Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Nos gustaría dar las gracias al Dr. Christian Lanct-t en BIOCEV (Praga, República Checa) por enseñarnos la técnica de micropipeta de boca para montar gusanos fijos y a la Dra. Fatima Santos y a la Dra. Debbie Drage por compartir la configuración de seguridad en la micropipeta de la boca. También agradecemos a Francesca Hodge por editar el manuscrito, Sharlene Murdoch y Babraham Institute Facilities por su apoyo. OC es compatible con ERC 638426 y BBSRC [BBS/E/B000C0426].

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Worm-align es una canalización de procesamiento de imágenes basada en FIJI que genera fácilmente montajes de gusanos seleccionados por el usuario, en los que los gusanos se enderezan y alinean para ayudar a la comparación visual, clasificación y representación. Aunque esta característica también es ofrecida por algunas herramientas existentes, en particular el módulo WormToolbox en CellProfiler7, Worm-align requiere comparativamente poca experiencia previa en el análisis de imágenes: los usuarios solo necesitan rastrear los gusanos que les gustaría seleccionar para el montaje (y el análisis). Aunque el seguimiento de los gusanos en los datos de imagen sin procesar es un proceso fácil -especialmente cuando un ordenador o tableta de pantalla táctil está disponible-, es primordial, que las líneas se dibujan correctamente a lo largo del eje longitudinal de los gusanos. Las líneas incompletas, que siguen sólo una parte del gusano, darán lugar a gusanos parciales en el montaje (es decir, gusanos que faltan cabezas de extremos de cola) y máscaras de segmentación parcial durante el análisis CellProfiler. Además, si las líneas de dos gusanos individuales se cruzan, los gusanos no se procesarán correctamente en el montaje de alineación del gusano, así como para la cuantificación de la fluorescencia. Para el control de calidad, se guarda una imagen superpuesta de las selecciones de línea de la imagen original en la carpeta de datos, junto con una tabla de control de calidad. A partir de estos, las líneas problemáticas que conducirán a gusanos segmentados incorrectamente pueden ser fácilmente identificadas y excluidas del montaje y / o análisis posterior.
Aunque la entrada directa del experimentador en la selección de gusanos quizás parece un poco lenta, presenta una clara ventaja del flujo de trabajo sobre otros en experimentos donde gusanos de diferentes etapas de desarrollo están presentes en la misma imagen: los gusanos se pueden seleccionar durante el "paso de seguimiento", esbozando sólo los gusanos que están en la etapa de desarrollo correcta. Alternativamente, los gusanos se pueden filtrar utilizando la salida de Worm_CP en función de la longitud de la línea de seguimiento o del área de la máscara de segmentación, ambos indicadores confiables de la longitud/tamaño de los gusanos. Podría decirse que los algoritmos de aprendizaje automático pueden tener problemas para reconocer gusanos de diferentes etapas del desarrollo, ya que su tamaño y apariencia en las imágenes DIC son tan diferentes.
La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Demostramos esto importando la salida Worm-align en una canalización CellProfiler simple (Worm_CP), que permite la cuantificación de la intensidad de fluorescencia multicanal en los gusanos individuales que se seleccionaron mientras se ejecutaba la canalización Worm-align. Elegimos este enfoque debido a la flexibilidad del software CellProfiler: Es sencillo incorporar módulos adicionales en la canalización para analizar características adicionales en gusanos individuales (por ejemplo, medir el tamaño de las gotas de lípidos, o gránulos de tensión, núcleos, mitocondrias). Además, las máscaras de gusano único podrían utilizarse potencialmente para entrenar un nuevo modelo para WormToolbox7.
Las principales ventajas de este método son que es rápido y requiere una configuración de montaje de gusano simple. Este método es más rápido, ya que no requiere pasar tiempo aprendiendo la operación del software ni ejecutar conjuntos de entrenamiento a través de un algoritmo de máquina7. Además, este método funciona con gusanos vivos o fijos simplemente montados en almohadillas de agarosa regulares. No es necesario utilizar cámaras microfluídicas complejas, como se ha desarrollado en otros métodos5,6.

Un organismo relativamente simple, el nematodo C. elegans,es un sistema modelo extremadamente útil para el estudio de enfermedades humanas. Alrededor del 38% de los genes en el genoma de C. elegans tienen contrapartes funcionales en humanos1,2. Una de las características únicas de C. elegans es que es ópticamente transparente, lo que permite un fácil acceso a la información in vivo con respecto a (sub) expresión celular de reporteros fluorescentes a través de los tejidos. Esto convierte a C. elegans en un organismo modelo principal para pantallas de alto contenido utilizando plataformas basadas en imágenes3. Sin embargo, un problema que a menudo complica estos estudios es que cuando se toman imágenes de poblaciones densas de gusanos, tienden a cruzarse y agruparse, haciendo comparaciones entre gusanos individuales desafiantes, nublando el análisis y la cuantificación de imágenes aguas abajo.
Las soluciones existentes que superan este problema suelen basarse en la optimización del protocolo de cultivo e imagen, como mediante el uso de configuraciones micro fluidísticas4,lo que permite capturar gusanos individuales en imágenes separadas5,6. Otros han aplicado algoritmos de aprendizaje automático que permiten el reconocimiento de gusanos individuales, incluso en una población agujena. Un excelente ejemplo de esto último es WormToolbox, que es una extensión modular de la plataforma de análisis de imágenes de código abierto, CellProfiler7. WormToolbox ofrece una solución de alto rendimiento y alto contenido para el análisis de C. elegans,y se beneficia claramente de su inclusión en CellProfiler, ya que se pueden incluir fácilmente módulos de análisis adicionales. Aunque WormToolbox viene incluido con un modelo previamente entrenado (DefaultWormModel.xml), el reentrenamiento del algoritmo de aprendizaje automático suele ser necesario para cada nueva aplicación. Los tutoriales en línea sobre cómo hacerlo están disponibles en Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). A pesar de esto, la instalación y el uso de WormToolbox requiere una importante inversión de tiempo para los usuarios principiantes.
Aquí, describimos un protocolo simple, rentable y eficaz en el tiempo para la cultura, y las poblaciones de imagen de C. elegans. Para permitir la evaluación de gusanos individuales en las imágenes adquiridas, hemos desarrollado un flujo de trabajo simple basado en FIJI de código abierto, llamado Worm-align. La alineación de gusanos se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos enderezar y alineados. En primer lugar, el usuario debe seleccionar manualmente gusanos individuales para su análisis dibujando una línea desde la cabeza hasta la cola. Worm-align utilizará esta selección para recortar los gusanos seleccionados de la imagen de visión general y generar un montaje en el que los gusanos seleccionados se enderezan y alinean para facilitar la comparación visual y la presentación.
Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Hemos utilizado la tubería de Worm_CP para cuantificar la respuesta de choque térmico, un mecanismo de protección bien conservado que reobri las proteínas que están mal pleidas debido a factores de estrés como la alta temperatura8. Específicamente, aplicamos la tubería a los gusanos que llevan un transgén integrado de múltiples copias, donde el promotor de un gen inducible por choque térmico, hsp-70(C12C8.1), impulsa la proteína fluorescente verde (GFP)9. También hemos utilizado la Worm_CP en animales fijos que han sido etiquetados con un tinte fluorescente que visualiza las gotas de lípidos (LDs), el principal orgánulo de almacenamiento de grasa en C. elegans10. Aunque este flujo de trabajo no tiene el rendimiento ofrecido por WormToolBox, es una alternativa sencilla y fácil de usar para la presentación visual y el análisis de experimentos de C. elegans basados en imágenes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Un problema que a menudo se encuentra al adquirir datos de imagen de C. elegans fijos o anestesiados es que los gusanos se cruzan y se agrupan con sus vecinos. Este problema se agrava con la creciente densidad de gusanos y crea desafíos para la toma de imágenes y la cuantificación. Desarrollamos un flujo de trabajo basado en FIJI, Worm-align, que se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos seleccionados por el usuario, enderezados y alineados a partir de datos de imagen sin procesar de C. elegans. Worm-align es un flujo de trabajo simple y fácil de usar que no requiere entrenamiento previo ni del usuario ni del algoritmo de análisis. Los montajes generados con Worm-align pueden ayudar a la inspección visual de los gusanos, su clasificación y representación. Además, la salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior de la intensidad de fluorescencia en gusanos individuales, ya sea en FIJI directamente o en otras plataformas de software de análisis de imágenes. Esto se demuestra mediante la importación de la salida Worm-align en Worm_CP, una canalización que utiliza el software CellProfiler de código abierto. La flexibilidad de CellProfiler permite la incorporación de módulos adicionales para la selección de alto contenido. Como ejemplo práctico, hemos utilizado la canalización en dos conjuntos de datos: el primer conjunto de datos son imágenes de gusanos reporteros de choque térmico que expresan proteína fluorescente verde (GFP) bajo el control del promotor de un gen inducible por choque térmico hsp-70,y el segundo conjunto de datos son imágenes obtenidas de gusanos fijos, manchadas para reservas de grasa con un tinte fluorescente.

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Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP es un flujo de trabajo simple de FIJI/CellProfiler que se puede utilizar para enderezar y alinear muestras de Caenorhabditis elegans y para puntuar ensayos basados en imágenes de gusano entero sin necesidad de pasos de entrenamiento previos. Hemos aplicado Worm-align/Worm_CP a la cuantificación de la expresión inducida por choque térmico en animales vivos o gotas de lípidos en muestras fijas.

Alinee y Worm_CP, dos tuberías de código abierto para el enderezamiento y cuantificación de datos de imagen de fluorescencia obtenidos de Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Aquí describimos un flujo de trabajo simple basado en Fiji de código abierto llamado Worm-align, que se puede utilizar para generar montajes de un solo canal o multicanal de gusanos enderezados de interés a partir de imágenes de microscopía crudas. Dado que este flujo de trabajo se basa en animales de interés seleccionados por el usuario, podría ser particularmente útil al analizar imágenes de C.elegans donde los gusanos no están todos en la etapa o condición correcta. Cabe señalar que la salida de Worm-align puede utilizarse para la cuantificación posterior de la fluorescencia con Fiji u otro software de análisis de imágenes.Aquí demostramos la cuantificación de la fluorescencia utilizando la tubería CellProfiler Worm_CP. Comience creando una micropipeta de boca extendiendo un capilar de vidrio delgado en la llama de un quemador Bunsen. Después de la extensión en la llama, romper el capilar en dos piezas si no se rompió en dos pedazos después de la extensión.Si se rompió en dos pedazos, corte el final de la más larga. Seleccione la pieza más larga y compruebe si el capilar está abierto intentando aspirar agua. Separe el adaptador de un tubo de silicona de tres milímetros.Enchufe el capilar de vidrio en un adaptador capilar conectado a un tubo de silicona de seis milímetros. A continuación, conecte el otro extremo del tubo de seis milímetros en un filtro de 0,2 micrómetros y un tubo de silicona de tres milímetros en su otro extremo. Enchufe una punta de filtro de un milímetro en el extremo libre del tubo de silicona de tres milímetros para aspirar líquido.Bajo un microscopio de disección, retire la mayor cantidad de líquido posible alrededor de un pellet de gusanos fijos con la micropipeta de la boca. Agregue rápidamente 10 microlitros de medio de montaje en la parte inferior del tubo. Enjuague una punta de 10 microlitros en PBS con rastros de detergente para evitar que los gusanos se peguen a los lados de la punta de la pipeta de plástico.A continuación, cortar el extremo de la punta con un par de tijeras. Transfiera ocho microlitros de medio de montaje con los gusanos a una almohadilla de agarosa previamente preparada. Mientras observa la diapositiva bajo el microscopio, agite suavemente para evitar la superposición de los gusanos.A continuación, cubra la caída del medio de montaje en la almohadilla de agarosa con un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros. Para montar gusanos vivos, pipetee de tres a cuatro microlitros de tres levamisoles milimolar disueltos en M9 sobre una almohadilla de agarosa. Escoja de 30 a 50 gusanos por condición en la gota de levamisol.A continuación, cubra la gota con un cubreobjetos de 18 por 18 milímetros e imagine los gusanos en una hora. Instale el paquete de software de análisis de imágenes de código abierto Fiji desde ImageJ, o si ya está instalado en el equipo, compruebe que es la versión 1.52A o posterior y, a continuación, descargue el repositorio Worm-align desde GitHub y guárdelo en el equipo. Una vez que todos los componentes de canalización se han descargado e instalado, abra Fiji y ejecute la macro Worm-align haciendo clic en plugins, macros y ejecutándose en la barra de menú principal.Localice la alineación de gusanos. ijm script y haga clic en abrir. Navegue a la carpeta de entrada con las imágenes que se analizarán y haga clic en seleccionar, asegurándose de que la carpeta seleccionada solo contenga archivos de imagen.La macro generará automáticamente una carpeta de salida donde se guardarán todos los resultados. El nombre de la carpeta será el mismo que la carpeta de entrada con la salida como un post-fix. Permita que la macro abra la primera imagen en la carpeta de entrada y utilízala como imagen representativa para extraer los ajustes necesarios para generar el montaje, incluido el ancho de los gusanos, el brillo y el contraste.Con la herramienta de dibujo de línea recta, dibuje una línea a lo largo del ancho de un gusano y haga clic en Aceptar. Utilice la longitud de esta línea para determinar la altura de las regiones recortadas para gusanos individuales. Para cada canal, especifique el nombre, la tabla de búsqueda y si debe incluirse en el montaje y, a continuación, haga clic en Aceptar. A continuación, ajuste los ajustes de brillo y contraste de los canales mediante los controles deslizantes. Repita este proceso para los canales restantes.Una vez configuradas todas las opciones, se registrarán en una tabla de configuración y se guardarán en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida. Se genera una imagen para mostrar cómo se verán todas las imágenes después de la aplicación de la configuración. Si la imagen es satisfactoria, marque la casilla superior.La segunda y tercera casilla del panel Comprobar todos los ajustes especifican las opciones para la generación de montajes. Deje ambas casillas marcadas y haga clic en Aceptar para ejecutar el resto de la macro. Si no marca la casilla superior, la macro volverá a ejecutar la configuración.A continuación, la macro procede a abrir todas las imágenes de la carpeta de entrada. Para cada imagen, dibuje líneas en el eje longitudinal de todos los gusanos que se incluirán en el montaje utilizando la herramienta segmentada o la herramienta de línea a mano alzada. Dibuje líneas de forma consistente de cabeza a cola o viceversa a lo largo de toda la longitud de los gusanos y agregue cada línea al administrador de ROI haciendo clic en Control T.Una vez que se hayan agregado todos los gusanos deseados, haga clic en Aceptar. Worm-align generará imágenes recortadas de gusanos seleccionados individuales, que se guardarán en la subcarpeta de gusano único de la carpeta de salida.Los montajes de todos los gusanos seleccionados se guardarán en la carpeta alineada. Descargue e instale CellProfiler 2.2.0 haciendo clic en el vínculo de las versiones anteriores de CellProfiler en la página de descarga y seleccionando el sistema operativo necesario. Antes de iniciar la canalización de Worm_CP, asegúrese de que todas las imágenes de salida esperadas estén presentes en la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida Worm-align.Debe haber una copia procesada de la imagen original, una máscara de imagen binaria de la población de gusanos, alinear la máscara si la línea se dibuja en gusanos seleccionados y debe estar presente una imagen que represente cada uno de los canales de la imagen original. Abra CellProfiler, luego haga clic en el módulo de entrada de imágenes y arrastre la carpeta del módulo CellProfiler a la ventana que dice soltar archivos y carpetas aquí. Si hay una lista de imágenes de un análisis anterior, primero elimínelas haciendo clic con el botón derecho en la ventana y seleccionando Borrar lista de archivos.Haga clic en el módulo de entrada de metadatos y, en el segundo método de extracción, haga clic en la carpeta amarilla y vaya a la subcarpeta CellProfiler de la carpeta de salida Worm-align. Seleccione el archivo de configuración y, a continuación, haga clic en Actualizar. A continuación, haga clic en el módulo de entrada de nombres y tipos y asegúrese de que todas las imágenes necesarias para la canalización están presentes.Antes de ejecutar la canalización, seleccione un destino para los resultados de salida en el módulo de salida. Utilice el modo de prueba para ver el rendimiento de la canalización haciendo clic en el modo de prueba de inicio y permita que se ejecute a través de la primera imagen de la carpeta. Cuando esté satisfecho con el rendimiento de la canalización, haga clic en salir del modo de prueba y analice las imágenes.Antes de comenzar el análisis, asegúrese de que todos los ojos delante del módulo de análisis estén cerrados. Una vez completado el análisis, abra la carpeta de salida Worm_CP que consta de dos archivos CSV, gusanos CSV y líneas CSV. Cultivar e tomar imágenes de C.elegans según el método descrito en este protocolo produce grandes imágenes de visión general de las poblaciones de gusanos.La salida de la canalización depende en gran medida de la calidad de las líneas dibujadas en la parte superior de las imágenes. Varios ejemplos de línea y su salida de Worm-align se muestran aquí. Cuando se utiliza el script Worm-align, la identificación visual de gusanos intersectantes es posible a partir de las imágenes de superposición que se encuentran en la subcarpeta de datos, así como de los paneles de gusanos individuales en el montaje.La tabla de control de calidad también se puede utilizar para identificar gusanos superpuestos. Sin embargo, las líneas de intersección son problemáticas para la canalización de Worm_CP. Esto se debe a que Worm_CP utiliza máscara de línea, no regiones de interés, para ayudar a identificar gusanos individuales.Por lo tanto, CellProfiler segmentará uno de los gusanos como dos objetos. El Worm_CP tubería se ha utilizado para cuantificar la intensidad de la fluorescencia de animales fijos etiquetados con un tinte fluorescente que se incorpora en las gotas de lípidos. El contenido de gotas de lípidos se reduce en un 17% entre los animales DBL1 de tipo salvaje y mutantes mediante cuantificación manual, y en un 12% utilizando el Worm_CP tubería.Worm_CP también se utilizó para cuantificar la respuesta de choque térmico en gusanos vivos que expresan la GFP bajo el control de un gen inducible por choque térmico. En ausencia de estrés por calor, los gusanos no indujeron la expresión de la GFP. Cuando los gusanos se exponen como un choque térmico corto, se induce la expresión de GFP.La salida de Worm_CP depende en gran medida de la calidad de las líneas que dibuje con Worm-align. Asegúrese de que sus líneas no se toquen o se superpongan y dibuje todas las líneas en la misma dirección. Comprobar la tabla de control de calidad puede ayudarle a identificar las líneas que se están tocando o superponiendo para que pueda excluir esos casos del análisis.La salida de Worm-align se puede utilizar para la cuantificación posterior en Fiji o en otros paquetes de software de análisis de imágenes. Hemos mostrado aquí una canalización CellProfiler muy básica en la que otros módulos de análisis podrían incorporarse muy fácilmente, por ejemplo, para contar el número de gotas de lípidos o para cuantificar la intensidad de las gotas individuales dentro de un gusano. Una de las ventajas de esta técnica es la posibilidad de cuantificar rápidamente la fluorescencia de gusanos individuales.En nuestro laboratorio, tenemos un interés en la viabilidad individual utilizando reporteros de fluorescencia y utilizamos Worm-align y Worm_CP rutinariamente para este propósito.

Research

JoVE Journal

Biology

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Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

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Imágenes C. elegans Los embriones utilizando un microscopio de epifluorescencia y software de código abierto

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Investigación

Biología

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