Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Vi vill tacka Dr Christian Lanctôt vid BIOCEV (Prag, Tjeckien) för att lära oss munnen micropipette teknik för att montera fasta maskar och Dr Fatima Santos och Dr Debbie Drage för att dela säkerhet setup på munnen micropipette. Vi tackar också Francesca Hodge för redigering av manuskriptet, Sharlene Murdoch och Babraham Institute Facilities för deras stöd. OC stöds av ERC 638426 och BBSRC [BBS/E/B000C0426].

1. Fixering av maskar för fettinnehållsavbildning med hjälp av ett fluorescerande färgämne för lipiddroppar (BODIPY)10
<ol><li>Förbered en synkroniserad population av C. elegans genom blekning enligt standardrutiner2. Plate om 1 000 L1-stegs maskar på en 9 cm nematodtillväxtmedia (NGM) platta per tillstånd. OBS: Fler maskar är beredda än faktiskt kvantifieras i slutet, på grund av förlust av maskar vid hantering.</li>
	<li>För att avbilda djur på ung vuxenstadium (runt 50 h inlägg L1-plätering vid 20 °C), tvätta varje 9 cm-platta med 15 mL M9 i ett koniskt rör, centrifug vid 252 x g i 1 min och ta bort supernatanten.</li>
	<li>Upprepa tvätten och lämna 1 mL M9 över pelleten på maskar.</li>
	<li>Överför 1 mL M av M9 som innehåller maskarna i ett 2 mL lågproteinbindande mikrocentrifugrör, med hjälp av låg retentionstips.</li>
	<li>Snurra ner i 252 x g i en mikrocentrifug i 1 min och ta bort supernatanten, var noga med att inte röra maskens pellet nedtill på tuben.</li>
	<li>För övervakning av fetthalt med hjälp av 4,4-difluoro-1,3,5,7,8-Pentamethyl-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (BODIPY) färgning10 (Tabell över material), fixa maskar antingen genom att lägga till 0,5 mL på 60% isopropanol till masken pelleten i 3 min11, eller genom att lägga till 2 mL iskall metanol i 10 min. För båda förfarandena, invertera röret var 30:e s. VAR FÖRSIKTIG: Om metanol är det valda fixeringsreagenset måste detta steg företagas i en rökhuv på grund av dess toxicitet.</li>
	<li>Ta bort så mycket fixativ som möjligt utan att vidröra maskpelleten och tillsätt 1 mL M9. Låt maskarna lägga sig i botten av röret i 3−5 min.</li>
	<li>Tvätta igen med 1 mL M9, låt maskarna lägga sig och ta bort supernatanten och lämna ca 50 μL i röret. Säkra röret med hjälp av en klämma.</li>
	<li>Frys-knäcka maskarna genom att störta det säkert stängda röret i flytande kväve och sedan i ett varmt vattenbad vid ~40 °C.</li>
	<li>Upprepa steg 1.9 en gång till.</li>
	<li>Tillsätt 0,5 mL BODIPY utspädd i M9 vid en slutkoncentration på 1 μg/μL och placera på en rotator vid rumstemperatur i 1 h.</li>
	<li>Efter 1 h, låt maskarna lägga sig i botten av röret i 3−5 min.</li>
	<li>Ta bort supernatant och tillsätt 1 mL M9.</li>
	<li>Låt maskarna lägga sig i botten och ta bort supernatant. OBS: Alternativt är det möjligt att snurra ner vid 252 x g i 1 min, eftersom detta inte verkar påverka morfologin.</li>
	<li>Lägg till 0,5 mL M9. OBS: Om fixativet är 60% isopropanol, maskarna kan endast utnyttjas inom 48 h. Om fixativet är metanol, maskarna bör utnyttjas inom 24h.</li>
</ol>2. Förbereda agarose kuddar för att montera maskarna
OBS: Det kritiska steget när du förbereder en agarospad är att få en dyna med regelbunden tjocklek. Annars kommer maskar över dynan att vara i olika fokalplan, vilket gör det svårt att få en fokuserad bild av ett bredare synfält.
<ol><li>Förbered 2% agarosrondynorna genom att tillsätta 0,2 g agaros till 10 mL steriliserad H2O i en bägare eller en konisk kolv. Värm i mikron i 30 s tills agaros börjar koka. OBS: Överhettas inte och stanna så snart bubblor visas; annars ökar viskositeten i agaros gör det svårare att uppnå önskad pad tjocklek.</li>
	<li>När agarosen smält, dispensera en droppe smält agaros i mitten av ett mikroskop glasglas med hjälp av en 1000 μL pipett spets med sin mycket slutskuren. Omedelbart, men försiktigt, håll en annan glas glida mycket nära agaros droppe och släpp den på agaros för att bilda en pad av regelbunden tjocklek för bästa mikroskopi resultat. OBS: Släppa den övre bilden från en höjd kommer inte bara att bilda bubblor men kommer att resultera i en ojämn pad. Alternativt är det också möjligt att använda två glas diabilder flankerar bilden med dynan, med ett tunt lager tejp på varje bild.</li>
	<li>Efter minst 2−3 min tar du försiktigt bort den övre bilden. Med hjälp av den övre bildens sida trimmar du dynan så att den blir fyrkantig. Montera maskarna inom 5 min, för att förhindra att dynan torkar innan den används.</li>
</ol>3. Montering av fasta maskar för avbildning
<ol><li>Skapa en mun mikropipette genom att förlänga en tunn glas kapillär i lågan av en Bunsen brännare (Bild 1A). Efter förlängning i lågan, bryt kapillären i två bitar (Bild 1B). Välj den mest adekvata, oftast längsta, och testa om slutet av kapillären är öppen genom att försöka aspirera vatten. OBS: Om vätskan inte kommer in i kapillären är den för tunn eller blockerad. Skär försiktigt kapilläränden med en sax, undvika att skära för mycket som maskar kommer att aspirera om hålet är för stort.</li>
	<li>Plugga in glaskamsillären från steg 3.1 i kapillärad adaptern (Bild 1C), kopplad till 6 mm silikonröret och plugga in den andra änden av 6 mm silikonröret i ett 0,2 μm filter, fäst på ett 3 mm silikonrör på dess andra ände (Figur 1C). Sätt i en 1 mL-filterspets (Bild 1C) i den fria änden av 3 mm silikonröret för att aspirera vätska. OBS: 0,2 μm-filtret tillsätts mellan försöksörens mynning och kapillären, för att garantera maximal säkerhet för försökssprutan. En liknande lösning används för mun mikropipetter som används för att hantera mus embryon12. Byt filter (vanligtvis med några månaders mellanrum) om munnen mikropipette inte aspirerar vätska längre.</li>
	<li>Använd munnen mikropipette under en dissekering mikroskop, ta bort så mycket vätska som möjligt runt masken pelleten av fasta maskar (Figur 2). OBS: Pipetting supernatant ut med hjälp av en manuell mikropipette kan användas som ett alternativ till munpipetterna i steg 3.1 till 3.3 för att ta bort så mycket supernatant som möjligt. Tillsätt 6 μL monteringsmedium. Vi finner dock att denna metod inte fungerar lika effektivt eftersom överdriven vätska i kuddar skapar en gles mask densitet, vilket gör bildbehandling mer tidskrävande. Återuppta steg 3.6. Titta på botten av röret och se till att pipetten inte aspirera maskarna.</li>
	<li>Tillsätt snabbt 10 μL monteringsmedium (Table of Materials) till botten av röret.</li>
	<li>Skölj en 10 μL spets i PBS med spår av rengöringsmedel (0,01% Triton), för att förhindra att maskar fastnar på sidorna av plastpipetsspetsen. Skär den allra ände av spetsen med en sax.</li>
	<li>Överför 8 μL monteringsmedium som innehåller maskarna på agarospaden som bereds i steg 2.3. Under mikroskopet, försiktigt skaka bilden, för att undvika överlappning av maskarna.</li>
	<li>Täck ned fall av monteringsmedium på agarospaden med en 18 mm x 18 mm täckslip (Figur 3). OBS: Mindre täckslips är att föredra då de utövar mindre tryck på maskarna. Håll täckplattan med ett par pincett och applicera ena kanten av täcket mot agarospaden, innan du försiktigt sätter in täcket med pincett.</li>
</ol>4. Montering levande maskar för bildframställning
OBS: För att avbilda levande maskar, de måste vara immobiliserade på dynan. Ett sätt att uppnå detta är att förlama dem med den nikotinreceptorasenisten: levamisole (Table of Materials).
<ol><li>Pipett 3−4 μL på 3 mM levamisole upplöst i M9 på agarospaden som skapats i steg 2.3. OBS: Det bör finnas tillräckligt med vätskevolym att maskarna inte är ovanpå varandra men inte för mycket vätska att maskarna är för glesa på dynan. Erfarna maskplockare kan använda 3 μL levamisole. Mindre erfarna plockare kan behöva lägga till en större volym levamisole, så att levamisole inte helt avdunstar.</li>
	<li>Plocka 30−50 maskar per tillstånd i droppen av levamisole.</li>
	<li>Täck droppe levamisole på agarospaden med en 18 mm x 18 mm täckplatta. Bild maskar inom 1 h, som förlamande agenten kommer så småningom leda till döden av maskarna.</li>
</ol>5. Bildbilder med ett epifluorescensmikroskop
<ol><li>Med en agaros dyna av enhetlig tjocklek, bild alla maskar på bilden på en gång med en 6 x 6 eller 7 x 7 stor bild till exempel med 20x målet för ett fluorescerande mikroskop. Om tjockleken på dynan är inte jämn, förvärva flera mindre 3 x 3 eller 4 x 4 bilder av samma bild.</li>
	<li>Använd samma inställningar för fluorescensintensitet och exponeringstid för alla förhållanden. Justera varje inställning så att den matchar bilden som har den ljusaste intensiteten, vilket garanterar att det inte finns någon pixelmättnad. För specifika instruktioner om bildanskaffning, följ mikroskoptillverkarens anvisningar.</li>
</ol>6. Skapa montagebilder av justerade enstaka maskar med hjälp av Worm-align FIJI pipeline
<ol><li>Installera programpaketet för analys av öppen källkod FIJI13/ImageJ14 från https://imagej.net/Fiji. Om en tidigare installation av FIJI finns tillgänglig, se till att den uppdateras till version 1.52a eller senare, eftersom vissa av de funktioner som används i makrot (t.ex. Tabellfunktioner) kräver detta. Hämta makrot Worm-align från Github: https://github.com/hannekeo/Worm-align.</li>
	<li>Öppna FIJI och kör makrot Worm-align. Utför Worm-align genom att klicka på Plugins | Makron | Kör i huvudmenyraden FIJI (bild S1). Nu leta reda på Worm-align.ijm skriptet på datorn.</li>
	<li>Makrot initieras genom att be om var bilderna befinner sig. Rörledningen kommer att fungera på både enkanaliga och flerkanaliga fluorescensbilder (Bild S2). Välj en indatamapp så genererar makrot automatiskt en utdatamapp där alla resultat kommer att sparas (Bild S3). OBS: Det är viktigt att den valda mappen innehåller endast bildfiler som förekomsten av andra filformat kommer att orsaka makrot att krascha. Helst bara gruppera ihop bilder som togs med samma mikroskop inställningar. Worm-align kommer att acceptera många olika filformat, inklusive nd2, czi, tif, rgb, jpg och png. Namnet på utdatamappen kommer att vara samma som indatamappen, med '_output' images_output tillagt som ett postfix, dvs. Utdatamappen kommer att innehålla fyra undermappar, där data kommer att sparas.</li>
	<li>Tillåt makrot att fortsätta att öppna den första bilden i inmatningsmappen och använda den som en representativ bild för att extrahera en inställning för att generera montaget. OBS: Worm-align kommer automatiskt att välja den första bilden i inmatningsmappen för att generera de inställningar som kommer att tillämpas på alla andra bilder i mappen. Om en annan bild anses vara mer representativ för datauppsättningen, se till att denna bild väljs genom att spara en kopia av bilden i inmatningsmappen, ändra namnet så att det nu finns listat överst i listan (t.0_RepresentativeImage ex.</li>
	<li>Med verktyget För ritning med rak linje ritar du en linje över bredden på en mask (Bild S4) och använder längden på denna linje för att bestämma höjden på de beskurna regionerna för enstaka maskar. För varje kanal anger du namn, uppslagstabell (LUT), intensitetsinställningar (B&C) och om den ska ingå i montaget (Bild S4). OBS: Dessa parametrar registreras och sparas i en inställningsfil, Inställningar.csv, som finns i Undermappen CellProfiler av utdatamappen.</li>
	<li>När alla inställningar har fångats, användaren visas hur bilderna kommer att se ut efter tillämpning av de inställningar som tillämpas (Figur S5). Kryssa i den övre rutan om inställningarna är tillräckliga. Välj alternativ för montagegenerering (ta bort fästingar, om det inte krävs): 1. Generera ett montage av valda maskar för varje enskild bild, eller 2. Generera ett kombinerat montage där alla maskar som valts på alla bilder i inmatningsmappen kommer att kombineras till ett enda montage. Klicka på OK om du vill utföra resten av makrot. OBS: Om den övre rutan inte är kryssad innan du klickar på 'OK' makrot kommer att köra om setup, så bildinställningar kan optimeras.</li>
	<li>Worm-align-pipelinen fortsätter nu att öppna alla bilder i inmatningsmappen. För varje bild ritar du linjer på den längsgående axeln av alla maskar som ska ingå i montaget och/eller kvantifiera (bild 4 och bild S6) med hjälp av verktyget 'segmenterad linje' (på FIJI huvudmenyraden). För att säkerställa korrekt anpassning av mask, dra linjer konsekvent från huvud till svansen (eller vice versa), och längs hela längden av masken (se exempel på bra och dålig linje ritning i figur 4B).</li>
	<li>Lägg till varje rad i ROI-hanteraren, genom att klicka på Ctrl+T. Worm-align använder de linjer som lagts till i ROI-hanteraren, i kombination med parametern maskbredd (anges i steg 6.4) för att generera beskurna bilder av enstaka valda maskar. Insamlingen av rad-ROIs sparas i undermappen 'data'. Den här mappen innehåller också en kopia av originalbilden som visar linjerna, samt maskens nummer. Linjer färgkodas med Glasbey_on_dark uppslagstabellen. Bilderna av rätade maskar sparas i single_worms undermappen i utdatamappen. Om det dessutom väljs i steg 6.6 i detta protokoll, producerar Worm-align montage av alla maskar som valts per översiktsbild och/eller för alla översiktsbilder i indatamappen (se bild 4C och figur S7). Dessa montage finns i den 'justerade' undermappen för utdatamappen.</li>
</ol>7. Analysera enmask fluorescens intensitet med hjälp av utdata från Worm-align i en automatiserad CellProfiler pipeline
<ol><li>För nedströms databearbetning och analys av Worm-align-utdata, ladda ner och installera open-source image analysis software package 'CellProfiler15,16 från https://cellprofiler.org/. Ladda ner Worm_CP.cpproj-pipelinen från GitHub: https://github.com/hannekeo/Worm-align OBS: Exemplet pipeline som beskrivs här konstruerades med cellprofiler2.2.0 och kanske inte körs i senare versioner av CellProfiler.</li>
	<li>Innan du startar Worms_CP.cpproj-pipelinen, se till att alla förväntade utdatabilder finns i undermappen CellProfiler i mappen Worm-align output: en bearbetad kopia av den ursprungliga bilden (med namnet: Original_), en binär bildmask av maskpopulationen (benämnd: Mask_), en linjemask av de linjer som ritats på valda maskar (benämnd: Lines_) och en bild som representerar var och en av kanalerna som finns i originalbilden (namngiven efter kanalnummer).</li>
	<li>För att kvantifiera fluorescens intensiteten i enstaka maskar, klicka på Images indatamodul och helt enkelt dra CellProfiler utdata mappen in i fönstret som säger Släpp filer och mappar här. Om en lista med bilder finns från tidigare analys tar du först bort dessa genom att högerklicka i fönstret och välja Rensa fillista. Om du vill utesluta 'Inställningar.csv'-filen från avbildningslistan väljer du antingen 'Endast bilder' eller 'Anpassad' med 'Extension is tif, tiff, ome.tif eller ome.tiff' för filterinställningarna (Bild S8).</li>
	<li>Klicka på metadataingångsmodulen. I den andra extraktionsmetoden klickar du på den gula mappen, och lokaliserar undermappen CellProfiler i utmatningsmappen WormAlign (Figur S9). Välj filen Inställningar.csv och länka inställningarna i filen till CellProfiler-utdata genom att matcha metadata i CSV-filerna till dem i bilderna (Channel metadata).</li>
	<li>Klicka på NamesAndTypes ingångsmodul och infoga en ny bild för varje kanal av den ursprungliga bilden som ska kvantifieras. OBS: Redan finns i exemplet rörledningen är masken masken, två färgbilder, linjemasken och den ursprungliga bilden, och tre grå skala bilder (den gröna och den röda kanalen). Listan i den här modulen behöver justeras om originalbilderna har fler eller färre kanaler än exempelbilderna.</li>
	<li>Kontrollera att namnet på bilderna i varje kolumnetikett/mask/mask är korrekt. OBS: Namnen på bilderna på en rad ska alla motsvara samma initialbild att analysera. Om ett misstag görs under bildanalysprocessen kommer några av utdatabilderna att saknas och namnen under de tre kolumnerna etikett/maskar kommer inte att motsvara samma initialbild längre för varje rad. Om så är fallet, hitta var misstaget är.</li>
	<li>Tryck på Visa utdatainställning för att välja mappen för att spara utdata från Cellprofiler.</li>
	<li>Klicka på Starta testläge. Väl i Testläge dubbelkollar du inställningarna för rörledningen genom att tillämpa dem på den första bilden i datauppsättningen, genom att klicka på Kör (som kommer att köras genom alla aktiva moduler i pipelinen) eller Steg (som kommer att köras genom pipelinen en modul i taget). OBS: Medan de extraherade mätningarna är i testläget kommer de inte att exporteras, även om en ExportToSpreadsheet-modul är närvarande (och aktiv) i rörledningen.</li>
	<li>När pipelinen har presterat som den ska klickar du på Avsluta testläge och trycker sedan på Analysera bilder. Som för närvarande konfigurerad kommer Worms_CP (1) att använda Mask_-bilden för att segmentera en grov maskmask och Lines_-bilden (Figur S10A) för att peka ut de valda maskarna och producera enmaskmaskar (Figur S10C), (2) mäta fluorescensintensiteten hos alla kanaler som finns i ingångsbilderna i de maskar som identifieras och maskeras. Rörledningen kan också mäta bakgrundsintensitet (figur S10B) och korrigera alla bilder i enlighet med detta (anges med ordet tröskelvärde i namnet på parametern mätt. t.ex.: Intensity_MeanIntensity_green_threshold), (3) mäta storleken på de valda maskarna, och (4) exportera alla uppmätta parametrar (Figur S10D).</li>
	<li>Öppna utdata Worm_CP som består av två csv-filer, maskar.csv och linjer.csv som sparas i den valda utdatamappen (se bild S11). Dessa filer kan öppnas i Excel eller R (Studio) för efterbehandling och rapportering. Om ytterligare utdata krävs, t ex per bilddata, kan detta väljas i exportToSpreadsheet-modulen i pipelinen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Worm-align är en FIJI-baserad bildbehandling pipeline som lätt genererar montage av användarvalda maskar, där maskar rätas och anpassas för att underlätta visuell jämförelse, klassificering och representation. Även om denna funktion erbjuds också av vissa befintliga verktyg, särskilt WormToolbox-modulen i CellProfiler7, kräver Worm-align jämförelsevis lite tidigare bildanalysupplevelse: Användare behöver bara spåra de maskar som de skulle vilja välja för montaget (och analysen). Även spåra maskar på rå bilddata är en enkel process-särskilt när en pekskärm dator eller surfplatta är tillgänglig-, är det av största vikt, att linjerna är korrekt dras längs den längsgående axeln av maskarna. Ofullständiga linjer, som följer endast en del av masken, kommer att resultera i partiella maskar i montaget (dvs, maskar saknas huvuden av svansändar) och partiell segmentering masker under CellProfiler analys. Dessutom, om linjer från två enskilda maskar kors, maskarna kommer inte att korrekt bearbetas i masken anpassning montage samt för fluorescens kvantifiering. För kvalitetskontroll en överlagringsbild av linjevalen på den ursprungliga bilden sparas i mappen data, tillsammans med en QC-tabell. Från dessa kan problematiska linjer som kommer att leda till felaktigt segmenterade maskar lätt identifieras och uteslutas från montage och /eller efterföljande analys.
Även om den direkta inmatningen från experimentören i valet av maskar kanske verkar lite tidskrävande, presenterar den en klar fördel av arbetsflödet framför andra i experiment där maskar från olika utvecklingsstadier finns i samma bild: Maskar kan väljas under "spårande steg", genom att endast skissera de maskar som är i rätt utvecklingsstadium. Alternativt kan maskar filtreras med hjälp av utdata från Worm_CP baserat på antingen längden på spårningslinjen, eller området för segmenteringsmasken, båda tillförlitliga indikatorer på maskarnas längd/storlek. Förmodligen kan maskininlärningsalgoritmer kämpa för att känna igen maskar från olika utvecklingsstadier, eftersom deras storlek och utseende i DIC-bilderna är så olika.
Utdata från Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visade detta genom att importera Worm-align-utdata till en enkel CellProfiler-pipeline (Worm_CP), som gör det möjligt att kvantifiering av flera kanaler fluorescens intensitet i de enskilda maskar som valdes medan du kör Worm-align pipeline. Vi valde detta tillvägagångssätt på grund av flexibiliteten i CellProfiler-programvaran: Det är enkelt att införliva ytterligare moduler i rörledningen för att analysera ytterligare funktioner i enskilda maskar (t.ex. mäta storleken på lipiddroppar, eller stressgranulat, kärnor, mitokondrier). Dessutom kan den enda mask masker potentiellt användas för att träna en ny modell för WormToolbox7.
De viktigaste fördelarna med denna metod är att det är snabbt och kräver en enkel mask montering set-up. Denna metod är snabbare eftersom det inte kräver att spendera tid lärande programvara drift och inte köra träningsuppsättningar genom en maskin algoritm7. Vidare, denna metod fungerar med antingen levande eller fasta maskar helt enkelt monterad på vanliga agaros kuddar. Det finns ingen anledning att använda komplexa mikrofluidiska kammare, som utvecklats i andra metoder5,6.

En relativt enkel organism, nematoden C. elegans, är ett extremt användbart modellsystem för att studera mänskliga sjukdomar. Omkring 38% av generna i C. elegans genomet har funktionella motsvarigheter hos människor1,2. En av de unika egenskaperna hos C. elegans är att det är optiskt transparent, vilket möjliggör enkel tillgång till in vivo information om (sub) cellulära uttryck av fluorescerande reportrar över vävnader. Detta gör C. elegans till en utmärkt modellorganism för skärmar med hög innehållshalt med hjälp av bildbaserade plattformar3. Men en fråga som ofta komplicerar dessa studier är att när imaging täta populationer av maskar, de tenderar att korsa och kluster, vilket gör jämförelser mellan enskilda maskar utmanande, grumlar nedströms bildanalys och kvantifiering.
Befintliga lösningar som övervinner denna fråga förlitar sig vanligtvis på optimering av protokollet för odling och bildframställning, till exempel genom användning av mikro-fluidikuppställningar4, vilket gör att enstaka maskar kan fångas iseparata bilder 5,6. Andra har tillämpat maskininlärningsalgoritmer som möjliggör erkännande av enstaka maskar, även i en klumpig population. Ett utmärkt exempel på det senare är WormToolbox, som är en modulär förlängning av den öppna källkoden bild analysplattform, CellProfiler7. WormToolbox erbjuder en lösning med hög genomströmning och hög innehållslig lösning för analys av C. elegans, och drar klart nytta av att den ingår i CellProfiler, eftersom ytterligare analysmoduler enkelt kan inkluderas. Även om WormToolbox levereras med en förtränad modell (DefaultWormModel.xml), krävs omskolning av maskininlärningsalgoritmen vanligtvis för varje nytt program. Online tutorials om hur man gör detta finns på Github (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/). Trots detta, installera och använda WormToolbox kräver en betydande tid-investering för nybörjare användare.
Här beskriver vi ett enkelt och kostnads- och tids-effektivt protokoll till kultur, och bildpopulationer av C. elegans. För att möjliggöra bedömning av enskilda maskar i de förvärvade bilderna har vi utvecklat en enkel öppen källkod FIJI-baserade arbetsflöde, med namnet Worm-align. Worm-align kan användas för att generera en- eller flerkanalsmontage av uträtade och anpassade maskar. För det första måste användaren manuellt välja enskilda maskar för analys genom att dra en linje från huvudet till svansen. Worm-align kommer att använda detta urval för att beskära valda maskar från översiktsbilden, och generera ett montage där valda maskar rätas och justeras för att underlätta visuell jämförelse och presentation.
Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Vi har använt Worm_CP pipeline för att kvantifiera värmechock svar, en väl bevarad skyddsmekanism som återfölrar proteiner som är felvikt på grund av stressfaktorer såsom hög temperatur8. Specifikt tillämpade vi rörledningen på maskar som bär en integrerad multi-kopia transgen, där främjare av en värmechock inducerbar gen, hsp-70(C12C8.1), driver grön fluorescerande protein (GFP)9. Vi har också använt Worm_CP-ledningen på fasta djur som har märkts med ett fluorescerande färgämne som visualiserar lipiddroppar (LDs), den viktigaste fettlagringsorganellen i C. elegans10. Även om detta arbetsflöde inte har det dataflöde som erbjuds av WormToolBox, är det ett användarvänligt och enkelt alternativ för visuell presentation och analys av bildbaserade C. elegans-experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Ett problem som ofta påträffas när man skaffar bilddata från fast eller sövd C. elegans är att maskar korsar och kluster med sina grannar. Detta problem förvärras med ökande täthet av maskar och skapar utmaningar för bildbehandling och kvantifiering. Vi utvecklade ett FIJI-baserat arbetsflöde, Worm-align, som kan användas för att generera enkel- eller flerkanalsmontage av användarvalda, rätade och anpassade maskar från råa bilddata av C. elegans. Worm-align är ett enkelt och användarvänligt arbetsflöde som inte kräver föregående utbildning av vare sig användaren eller analysalgoritmen. Montage som genereras med Worm-align kan hjälpa den visuella inspektionen av maskar, deras klassificering och representation. Dessutom kan produktionen av Worm-align användas för efterföljande kvantifiering av fluorescensintensitet i enstaka maskar, antingen i FIJI direkt, eller i andra bildanalysprogramplattformar. Vi visar detta genom att importera Worm-align-utdata Worm_CP, en pipeline som använder programvaran CellProfiler med öppen källkod. CellProfilers flexibilitet möjliggör införlivandet av ytterligare moduler för screening med hög innehåll. Som ett praktiskt exempel har vi använt rörledningen på två datamängder: den första datauppsättningen är bilder av värmechock reporter maskar som uttrycker grönt fluorescerande protein (GFP) under kontroll av promotorn för en värmechock inducible gen hsp-70, och den andra datauppsättningen är bilder som erhållits från fasta maskar, färgas för fett-butiker med en fluorescerande färgämne.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP är ett enkelt FIJI/CellProfiler-arbetsflöde som kan användas för att räta ut och rikta In Caenorhabditis elegans-prover och för att göra poäng med bildbaserade analyser med hela mask utan behov av föregående utbildningssteg. Vi har tillämpat Worm-align/Worm_CP till kvantifieringen av värme-chock inducerad uttryck i levande djur eller lipiddroppar i fasta prover.

Worm-align och Worm_CP, två Open-Source Pipelines för Räta och kvantifiering av fluorescens bilddata erhålls från Caenorhabditis elegans

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Vi beskriver här en enkel opensource Fiji-baserade arbetsflödet heter Worm-align, som kan användas för att generera enstaka eller flera kanaler montage av rätade maskar av intresse från rå mikroskopi bilder. Eftersom det här arbetsflödet är beroende av användaren valda djur av intresse, kan det vara särskilt användbart när du analyserar bilder från C.elegans där maskarna inte är alla i rätt skede eller villkor. Det bör noteras att produktionen av Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering av fluorescens med antingen Fiji eller annan programvara för bildanalys.Här visar vi fluorescenskvantifiering med hjälp av CellProfiler-rörledningen Worm_CP. Börja med att skapa en munmikropipette genom att förlänga en tunn glasmörare i lågan på en Bunsenbrännare. Efter förlängning i lågan, bryta kapillären i två bitar om det inte bröt i två bitar efter förlängning.Om den bröts i två bitar, skär slutet av den längsta. Välj den längre biten och testa om kapillären är öppen genom att försöka aspirera vatten. Lossa adaptern från ett tre millimeters silikonrör.Anslut glas kapillären i en kapillär adapter kopplad till en sex millimeter silikonrör. Anslut sedan den andra änden av sex millimeter röret i en 0,2 mikrometer filter och en tre millimeter silikonrör på sin andra änden. Plugga in en en millimeters filterspets i den fria änden av den tre millimeter silikonrör till aspirera vätska.Under en dissekering mikroskop, ta bort så mycket vätska som möjligt runt en pellet av fasta maskar med munnen mikropipette. Tillsätt snabbt 10 mikroliter av monteringsmedium till botten av röret. Skölj en 10 mikroliterspets i PBS med spår av rengöringsmedel för att förhindra att maskar fastnar på sidorna av plastpipettspetsen.Klipp sedan den allra änden av spetsen med en sax. Överför åtta mikroliter av monteringsmedium med maskarna på en tidigare förberedd agarosepad. Medan du observerar glidbanan under mikroskopet, försiktigt agitera den för att undvika överlappning av maskarna.Täck sedan droppe monteringsmedium på agarospaden med en 18 av 18 millimeters täckplatta. För att montera levande maskar, pipettera tre till fyra mikroliter av tre millimolar levamisole upplöst i M9 på en agarose pad. Plocka 30 till 50 maskar per villkor i droppen av levamisole.Täck sedan droppen med en 18 av 18 millimeter coverslip och bild maskarna inom en timme. Installera programmet för analysprogrampaketet för öppen källkod Fiji från ImageJ, eller om det redan är installerat på datorn, kontrollera att det är version 1.52A eller senare, hämta sedan Worm-align-lagringsplatsen från GitHub och spara den på datorn. När alla pipeline-komponenter har hämtats och installerats, öppna Fiji och exekvera Worm-align makro genom att klicka på plugins, makron, och köra i huvudmenyraden.Leta upp Worm-align. ijm-skriptet och klicka på öppna. Navigera till inmatningsmappen med bilderna som ska analyseras och klicka på Välj, se till att den valda mappen bara innehåller bildfiler.Makrot kommer automatiskt att generera en utdatamapp där alla resultat kommer att sparas. Namnet på mappen kommer att vara samma som indatamappen med utdata som en efterkorrigering. Tillåt makrot att öppna den första bilden i inmatningsmappen och använda det som en representativ bild för att extrahera de inställningar som krävs för att generera montaget, inklusive maskarnas bredd, ljusstyrkan och kontrasten.Använd verktyget för rak linjeritning och rita en linje över en masks bredd och klicka på OK. Använd längden på den här linjen för att bestämma höjden på de beskurna regionerna för enstaka maskar. För varje kanal anger du namn, uppslagstabell och om den ska ingå i montaget, klicka sedan på OK. Därefter justerar du inställningarna för ljusstyrka och kontrast för kanalerna med hjälp av skjutreglagen. Upprepa denna process för de återstående kanalerna.När alla inställningar har konfigurerats registreras de i en inställningstabell och sparas i Undermappen CellProfiler i utdatamappen. En bild genereras för att visa hur alla bilder kommer att se ut efter applicering av inställningarna. Om bilden är tillfredsställande, kryssa i den övre rutan.Den andra och tredje rutan i panelen kontrollera alla inställningar ange alternativen för montage generation. Låt båda rutorna vara markerade och klicka på OK om du vill köra resten av makrot. Om du inte kryssar i den övre rutan kommer makrot att köra om konfigurationen.Makrot fortsätter sedan att öppna alla bilder i inmatningsmappen. För varje bild ritar du linjer på den längsgående axeln för alla maskar som ska ingå i montaget genom att använda det segmenterade eller frihandslinjeverktyget. Rita linjer konsekvent från huvud till svans eller vice versa längs maskarnas fulla längd och lägg till varje rad i ROI-hanteraren genom att klicka på Kontroll T.När alla önskade maskar har lagts till, klicka på OK. Worm-align kommer då att generera beskurna bilder av enstaka valda maskar, som kommer att sparas i den enda masken undermapp av utdatamappen.Montage av alla maskar som valts kommer att sparas i den justerade mappen. Hämta och installera CellProfiler 2.2.0 genom att klicka på länken för tidigare CellProfiler-utgåvor på nedladdningssidan och välja det operativsystem som krävs. Innan du startar Worm_CP pipeline, se till att alla förväntade utdatabilder finns i CellProfiler undermappen av Worm-align utdatamappen.En bearbetad kopia av originalbilden, en binär bildmask av maskpopulationen, justera mask om linjen ritas på markerade maskar och en bild som representerar var och en av kanalerna i den ursprungliga bilden ska vara närvarande. Öppna CellProfiler, klicka sedan på bilderna inmatningsmodulen och dra CellProfiler modulmappen in i fönstret som säger släppa filer och mappar här. Om en lista med bilder finns från en tidigare analys tar du först bort dessa genom att högerklicka i fönstret och välja rensa fillistan.Klicka på metadata indata modulen och på den andra extraheringsmetoden, klicka på den gula mappen och navigera till CellProfiler undermappen av Worm-align output mappen. Välj inställningsfilen, klicka sedan på uppdatera. Därefter klickar du på de namn och typer ingångsmodul, och se till att alla bilder som krävs för rörledningen är närvarande.Innan du kör pipelinen, välj ett mål för utdataresultat i utdatamodulen. Använd testläget för att se hur rörledningen presterar genom att klicka på starttestläge och låt den köras genom den första bilden i mappen. När nöjd med prestandan i rörledningen, klicka på Avsluta testläge och analysera bilder.Innan du påbörjar analys, se till att alla ögon framför analysmodulen är stängda. När analysen är klar öppnar du Worm_CP som består av två CSV-filer, maskar CSV och linjer CSV. Culturing och imaging C.elegans enligt den metod som beskrivs i detta protokoll producerar stora översiktsbilder av mask populationer.Rörledningens utdata beror till stor del på kvaliteten på de linjer som ritas ovanpå bilderna. Flera linje exempel och deras utdata från Worm-align visas här. När du använder Worm-align skriptet, visuell identifiering av korsande maskar är möjligt från överlägg bilder som finns i data undermappen, liksom från panelerna av enskilda maskar i montaget.QC-tabellen kan också användas för att identifiera överlappande maskar. Emellertid är korsande linjer problematiska för Worm_CP pipeline. Detta beror på Worm_CP använder linjemask, inte av intresseområden, för att hjälpa till att identifiera enskilda maskar.Därför kommer CellProfiler segmentera en av maskarna som två objekt. Den Worm_CP rörledningen har använts för att kvantifiera fluorescens intensitet från fasta djur märkta med ett fluorescerande färgämne som införlivar i lipiddroppar. Lipiddropphalten minskas med 17%mellan vildtyp och muterade DBL1-djur med manuell kvantifiering, och med 12% med hjälp av Worm_CP pipeline.Worm_CP användes också för att kvantifiera värmechocksvaret i levande maskar som uttrycker GFP under kontroll av en värmechock inducerbar gen. I avsaknad av värmestress inducerar maskarna inte GFP-uttryck. När maskarna exponeras som en kort värmechock induceras GFP-uttryck.Utdata av Worm_CP beror till stor del på kvaliteten på de linjer du ritar med hjälp av Worm-align. Se till att dina linjer inte rör eller överlappar varandra och rita alla dina linjer i samma riktning. Om du kontrollerar tabellen QC kan du identifiera linjer som berör eller överlappar så att du kan utesluta dessa fall från din analys.Utdata av Worm-align kan användas för efterföljande kvantifiering antingen i Fiji eller i andra bildanalysprogramprogrampaket. Vi har här visat en mycket grundläggande CellProfiler-pipeline där andra analysmoduler mycket lätt skulle kunna införlivas, till exempel för att räkna antalet lipiddroppar eller för att kvantifiera intensiteten hos enskilda droppar i en mask. En av fördelen med denna teknik är en möjlighet att kvantifiera fluorescens från enskilda maskar snabbt.I vårt labb, vi har ett intresse för individuell livskraft med hjälp av fluorescens reportrar och vi använder Worm-align och Worm_CP rutinmässigt för detta ändamål.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryon med en Epifluorescent Mikroskop och Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampyriska Isolering av extracellulär vätska från<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basisk<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Metoder: Synkronisering och miljöövervakning

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Arbetsflöde för hög halt, Individuell Cell Kvantifiering av fluorescerande markörer från Universal Mikroskop Data, som stöds av Open Source Software

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Spårning och kvantifiera utvecklingsprocesser i<em&gt; C. elegans</em&gt; Använda Open-source-verktyg

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation och kvantifiering av Telomer och repetitiva sekvenser användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH) med PNA prober<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Open Source Hög innehållsanalys Använda automatiserade fluorescens Lifetime Imaging Microscopy

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Kvantifiering av Lipid överflöd och utvärdering av Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans av Nile rött och olja röd O färgning

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Rening och analys av Caenorhabditis elegans Extracellulära blåsor

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...