Name: worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans
Uploaded: 2020-05-28T15:00:00
Duration: 11 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

BIOCEV'den (Prag, Çek Cumhuriyeti) Dr. Christian Lanctôt'a sabit solucanlar monte etmek için ağız mikropipet tekniğini öğrettiği için teşekkür ederiz ve Dr. Fatima Santos ve Dr Debbie Drage ağız mikropipetinde güvenlik kurulumlarını paylaştırdığımız için. Ayrıca francesca Hodge'a el yazması, Sharlene Murdoch ve Babraham Institute Facilities'e desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. OC, ERC 638426 ve BBSRC [BBS/E/B000C0426] tarafından desteklenir.

<ol>
	<li>Shave, D. D., Greenwald, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OrthoList:+A+compendium+of+C.+elegans+genes+with+human+orthologs.">OrthoList: A compendium of C. elegans genes with human orthologs.</a> PLoS One. 6 (5), 20085 (2011).</li><li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+C.+elegans.">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , (2006).</li><li>Letizia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics-enabled+phenotyping+of+a+whole+population+of+C.+elegans+worms+over+their+embryonic+and+post-embryonic+development+at+single-organism+resolution.">Microfluidics-enabled phenotyping of a whole population of C. elegans worms over their embryonic and post-embryonic development at single-organism resolution.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 4 (6), (2018).</li><li>San-Miguel, A., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+as+a+tool+for+C.+elegans+research.">Microfluidics as a tool for C. elegans research.</a> WormBook. , (2013).</li><li>Atakan, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Platform+for+Long-Term+Culture+and+High-Content+Phenotyping+of+Single+C.+elegans+Worms.">Automated Platform for Long-Term Culture and High-Content Phenotyping of Single C. elegans Worms.</a> Scientific Reports. 9 (1), 120-135 (2019).</li><li>Atakan, H. B., Cornaglia, M., Mouchiroud, L., Auwerx, J., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+high-content+phenotyping+from+the+first+larval+stage+till+the+onset+of+adulthood+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Automated high-content phenotyping from the first larval stage till the onset of adulthood of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Lab on a Chip. 19 (1), 120-135 (2018).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+image+analysis+toolbox+for+high-throughput+C.+elegans+assays.">An image analysis toolbox for high-throughput C. elegans assays.</a> Nature Methods. 9 (7), 714 (2012).</li><li>Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+heat+shock+response:+systems+biology+of+proteotoxic+stress+in+aging+and+disease.">The heat shock response: systems biology of proteotoxic stress in aging and disease.</a> Biology. 76 (9), 91-99 (2012).</li><li>Guisbert, E., Czyz, D. M., Richter, K., McMullen, P. D., Morimoto, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+tissue-selective+heat+shock+response+regulatory+network.">Identification of a tissue-selective heat shock response regulatory network.</a> PLoS Genetics. 9 (4), (2018).</li><li>Klapper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+fixative+and+vital+staining+of+lipid+droplets+in+Caenorhabditis+elegans+reveal+fat+stores+using+microscopy+and+flow+cytometry+approaches.">Fluorescence-based fixative and vital staining of lipid droplets in Caenorhabditis elegans reveal fat stores using microscopy and flow cytometry approaches.</a> Journal of Lipid Research. 52 (6), 1281-1293 (2011).</li><li>W&#228;hlby, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=and+low-throughput+scoring+of+fat+mass+and+body+fat+distribution+in+C.+elegans.">and low-throughput scoring of fat mass and body fat distribution in C. elegans.</a> Methods. 68 (3), 9 (2014).</li><li>Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+single-cell+cDNA+amplification+to+provide+a+template+for+representative+high-density+oligonucleotide+microarray+analysis.">Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis.</a> Nature Protocols. 2 (3), 739-752 (2007).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18, 529 (2017).</li><li>Carpenter, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellProfiler:+image+analysis+software+for+identifying+and+quantifying+cell+phenotypes.">CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes.</a> Genome. 7, 100 (2006).</li><li>Kamentsky, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+structure,+function+and+compatibility+for+CellProfiler:+modular+high-throughput+image+analysis+software.">Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software.</a> Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).</li><li>Casanueva, M. O., Burga, A., Lehner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fitness+trade-offs+and+environmentally+induced+mutation+buffering+in+isogenic+C.+elegans.">Fitness trade-offs and environmentally induced mutation buffering in isogenic C. elegans.</a> Science. 335 (6064), 82-85 (2012).</li><li>Clark, F. J., Meade, M., Ranepura, G., Hall, D. H., Savage-Dunn, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans+DBL-1/BMP+Regulates+Lipid+Accumulation+via+Interaction+with+Insulin+Signaling.">Caenorhabditis elegans DBL-1/BMP Regulates Lipid Accumulation via Interaction with Insulin Signaling.</a> G3. 8 (1), 343-351 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Solucan hizalama, kullanıcı tarafından seçilen solucanların montajlarını kolayca oluşturan ve solucanların görsel karşılaştırma, sınıflandırma ve gösterime yardımcı olacak şekilde hizalandığı FIJI tabanlı bir görüntü işleme ardışık hattıdır. Bu özellik aynı zamanda bazı mevcut araçlar tarafından sunulsa da, özellikle CellProfiler7'dekiWormToolbox modülü, Worm-align nispeten az önceki görüntü analizi deneyimi gerektirir: Kullanıcılar sadece montaj (ve analiz) için seçmek istedikleri solucanları izlemeleri gerekir. Ham görüntü verilerindeki solucanları izlemek kolay bir işlem olsa da -özellikle dokunmatik ekranlı bir bilgisayar veya tablet mevcutolduğunda-, bu çizgilerin solucanların uzunlamasına ekseni boyunca doğru şekilde çizildiği çok önemlidir. Solucanın sadece bir kısmını takip eden eksik çizgiler, CellProfiler analizi sırasında montajda kısmi solucanlara (yani kuyruk uçlarının kafaları eksik olan solucanlara) ve kısmi segmentasyon maskelerine neden olur. Ayrıca, iki solucanın çizgileri geçerse, solucanlar solucan hizalama montajında ve floresan nicelleştirme de doğru bir şekilde işlenmeyecektir. Kalite kontrolü için, orijinal görüntüdeki satır seçimlerinin yer kaplaması görüntüsü, bir QC tablosuyla birlikte veri klasörüne kaydedilir. Bunlardan, yanlış bölümlenmiş solucanlara yol açacak sorunlu çizgiler kolayca tanımlanabilir ve montaj ve/veya sonraki analizlerin dışında tutulabilir.
Solucan seçiminde deneyciden gelen doğrudan girdi belki de biraz zaman alıcı gibi görünse de, farklı gelişim aşamalarından gelen solucanların aynı görüntüde bulunduğu deneylerde diğerleri üzerinde iş akışının açık bir avantajını sunar: Solucanlar sadece doğru gelişim aşamasındaolan solucanları özetleyerek "izleme adımı" sırasında seçilebilir. Alternatif olarak, solucanlar, hem solucanların uzunluğuna/boyutuna ilişkin güvenilir göstergeler olan izleme hattının uzunluğuna veya segmentasyon maskesinin alanına göre Worm_CP çıktıkullanılarak filtrelenebilir. Dic görüntülerindeki boyutları ve görünümleri çok farklı olduğundan, makine öğrenme algoritmalarının solucanları farklı gelişim evrelerinden tanımakta zorlanabilir.
Worm-align çıktısı, tek solucanlarda, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için kullanılabilir. Bunu, Worm-align boru hattını çalıştırırken seçilen solucanlarda çok kanallı floresan yoğunluğunun ölçülmesine olanak tanıyan basit bir CellProfiler boru hattına (Worm_CP) Worm-align çıktısını ithal ederek gösterdik. CellProfiler yazılımının esnekliği nedeniyle bu yaklaşımı seçtik: Tek tek solucanlardaki ek özellikleri analiz etmek için boru hattına ek modüller dahil etmek kolaydır (örn. lipid damlacıklarının boyutunun ölçülmesi veya stres granülleri, çekirdekler, mitokondri). Buna ek olarak, tek solucan maskeleri potansiyel WormToolbox7için yeni bir model eğitmek için kullanılabilir.
Bu yöntemin temel avantajları hızlı olması ve basit bir solucan montaj kurulum gerektirir. Bu yöntem yazılım işlemi öğrenme veya bir makinealgoritması7 ile eğitim setleri çalışan zaman harcama gerektirmez gibi daha hızlıdır. Ayrıca, bu yöntem ya canlı ya da sabit solucanlar sadece normal agarose pedleri üzerine monte çalışır. Diğer yöntemlerde geliştirilen karmaşık mikroakışkan odaları kullanmaya gerek yoktur5,6.

Nispeten basit bir organizma, nematod C. elegans, insan hastalıkları incelemek için son derece yararlı bir model sistemidir. C. elegans genomundaki genlerin yaklaşık %38'inin insanlarda fonksiyonel benzerleri vardır1,2. C. elegans'ın benzersiz özelliklerinden biri, dokular arasında floresan muhabirlerin hücresel ekspresyonu ile ilgili in vivo bilgilere kolay erişim sağlayan optik saydam olmasıdır. Bu c. elegans görüntü tabanlı platformlar kullanarak yüksek içerikli ekranlar için bir prime model organizma yapar3. Ancak, bu çalışmaları sık sık karmaşıklaştıran bir konu, solucanların yoğun popülasyonlarını görüntülerken, çapraz lama ve kümelenme eğiliminde olmaları, tek tek solucanlar arasında karşılaştırmalar yapma, aşağı akış görüntü analizi ve nicelik bulanıklaştırma.
Bu sorunu aşmak mevcut çözümler genellikle culturing ve görüntüleme protokolü optimizasyonu güveniyor, mikro-akışkan kurulumları kullanımı yoluyla gibi4, tek solucanlar ayrı görüntülerde yakalanmasına izin5,6. Diğerleri, kümelenmiş bir popülasyonda bile tek solucanların tanınmasına olanak sağlayan makine öğrenimi algoritmaları uyguladılar. Ikincisi mükemmel bir örnek WormToolbox, açık kaynak görüntü analiz platformu, CellProfiler7modüler bir uzantısıdır. WormToolbox C. elegansanalizi için yüksek iş hacmi ve yüksek içerikli bir çözüm sunuyor , ve açıkça CellProfiler dahil yararlanır, ek analiz modülleri kolayca dahil edilebilir gibi. WormToolbox önceden eğitilmiş bir model (DefaultWormModel.xml ile birlikte gelse de, makine öğrenme algoritmasının yeniden eğitilmesi genellikle her yeni uygulama için gereklidir. Bunun nasıl yapılacıla ilgili çalışan ları Github' da (https://cp-website.github.io/Worm-Toolbox/) sAtınalı ş Buna rağmen, yükleme ve WormToolbox kullanarak acemi kullanıcılar için önemli bir zaman yatırım gerektirir.
Burada, kültüre basit ve maliyet ve zaman-etkili bir protokol ve C. elegansgörüntü popülasyonları açıklar. Edinilen görüntülerde tek tek solucanların değerlendirilmesine izin vermek için Worm-align adında basit bir açık kaynak FIJI tabanlı iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilir. İlk olarak, kullanıcı kafadan kuytu bir çizgi çizerek analiz için tek tek solucanları el ile seçmelidir. Solucan hizalama, seçilen solucanları genel bakışta görüntüden kırpmak için bu seçimi kullanır ve seçilen solucanların düzeltildiği ve görsel karşılaştırma ve sunum kolaylaştırmak için hizalandığı bir montaj oluşturur.
Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP'a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler'ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Biz ısı şoku tepkisi ölçmek için Worm_CP boru hattı kullandık, yüksek sıcaklık gibi stres nedeniyle yanlış katlanmış proteinleri yeniden katlanır iyi korunmuş koruyucu bir mekanizma8. Özellikle, entegre bir multi-copy transgene taşıyan solucanlar için boru hattı uygulanan, bir ısı şoku indükleyici gen organizatörü, hsp-70 (C12C8.1), yeşil floresan protein sürücüler (GFP)9. Biz de lipid damlacıkları görselleştirir bir floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlar üzerinde Worm_CP boru hattı kullandık (LDs), C. elegansana yağ depolama organel10. Bu iş akışı WormToolBox tarafından sunulan iş akışı na sahip olmasa da, görüntü tabanlı C. elegans deneylerinin görsel sunumu ve analizi için kullanıcı dostu ve basit bir alternatiftir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1352px;" width="1351">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Agarose</td>
			<td style="width:221px;">MeLford Biolaboratories Ltd</td>
			<td style="width:344px;">MB1200</td>
			<td style="width:571px;"></td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:216px;">Aspirator tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">A5177</td>
			<td>to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:35px;">Beaker</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BODIPY 493/593</td>
			<td style="width:221px;">Invitrogen</td>
			<td>D3922</td>
			<td>stock solution prepared in DMSO at 1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>MSE MISTRAL 1000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Conical flask</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cover Slip</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:37px;">Filter 0.2 &#181;m for Syringe</td>
			<td>Sartrius</td>
			<td style="width:344px;">16534-K</td>
			<td>Filter, to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Isopropanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Levamisole hydrochloride</td>
			<td style="width:221px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>BP212</td>
			<td>3mM solution prepared by dissolving levamisole in M9</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Liquid Nitrogen facility</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Low Retention Tip 1000&#181;L</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1182-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>VWR chemicals</td>
			<td>20847.307</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides, MENZEL GLASSER</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>BS7011/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Eclipse Ti</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave Oven</td>
			<td>Delongi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">M9</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;">9cm NGM Plates</td>
			<td></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td>prepared in the lab according to15</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;">PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>prepared in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Protein LoBind Tube 2ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>T9284-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ring Caps</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>Z611247-250EA</td>
			<td>glass micro-capillary tubes to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Rotator</td>
			<td>Stuart Scientific</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Silicone tubine translucent</td>
			<td>Scientific Laboratory Suppliers</td>
			<td style="width:344px;">TSR0600200P</td>
			<td>6.0 mm x 2.0 mm wall - to create mouth micro-pipette (see protocol step)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Sterilized H2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>MilliQ water autoclaved in the lab</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">10&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-3810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">200&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1120-8810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1000&#181;L Tips</td>
			<td>Starlab</td>
			<td>S1122-1830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">15mL Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:221px;">CORNING</td>
			<td>430791</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Vecta Shield</td>
			<td>VECTOR</td>
			<td>94010</td>
			<td>antifade mounting medium (H-1000) without DAPI</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

worm-align and worm_cp, two open-source pipelines for straightening and quantification of fluorescence image data obtained from caenorhabditis elegans

Sabit veya anestezili C. elegans görüntü verileri elde ederken sık karşılaşılan bir sorun solucanlar çapraz ve komşuları ile küme olmasıdır. Bu sorun solucanların artan yoğunluğu ile ağırlaştırılmış ve görüntüleme ve nicelik için zorluklar yaratır. C. elegans'ın ham görüntü verilerinden kullanıcı tarafından seçilen, düzleştirilmiş ve hizalanmış solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilecek, Solucan hizalama olan FIJI tabanlı bir iş akışı geliştirdik. Solucan hizalama, kullanıcının veya çözümleme algoritmasının önceden eğitilmesini gerektirmeyen basit ve kullanıcı dostu bir iş akışıdır. Worm-align ile oluşturulan montajlar solucanların görsel denetimine, sınıflandırılmasına ve temsiline yardımcı olabilir. Buna ek olarak, Worm-align çıktısı tek solucanlarda floresan yoğunluğunun sonraki nicelikselleştirilmesi için, doğrudan FIJI'de veya diğer görüntü analizi yazılım platformlarında kullanılabilir. Bunu, Worm-align çıktısını açık kaynak hücre profili yazılımını kullanan bir boru hattı olan Worm_CP'a aktararak gösteriyoruz. CellProfiler'ın esnekliği, yüksek içerikli tarama için ek modüllerin eklenmesini sağlar. Pratik bir örnek olarak, biz iki veri kümesi üzerinde boru hattı kullandık: ilk veri seti ısı şoku indükleyici gen hsp-70organizatörü kontrolü altında yeşil floresan protein (GFP) ifade ısı şok muhabiri solucanların görüntüleri , ve ikinci veri seti sabit solucanlar elde edilen görüntüler, floresan boya ile yağ depoları için boyanmış.

Watch this Scientific Journal Video about Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans at JoVE

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Worm-align/Worm_CP, Caenorhabditis elegans örneklerini düzeltmek ve hizalamak ve önceki eğitim adımlarına gerek kalmadan tüm solucan görüntü tabanlı tahlilleri yapmak için kullanılabilecek basit bir FIJI/CellProfiler iş akışıdır. Solucan hizalama/Worm_CP, canlı hayvanlarda ısı şokuna bağlı ekspresyonun veya sabit numunelerdeki lipid damlacıklarının ölçülebilirhale uyguladık.

Caenorhabditis elegans'tan Elde Edilen Floresan Görüntü Verilerinin Düzleştirilmesi ve Ölçülmesi Için Solucan Hizalama ve Worm_CP İki Açık Kaynak Boru Hattı

An issue often encountered when acquiring image data from fixed or anesthetized C. elegans is that worms cross and cluster with their neighbors. This ...

Burada, ham mikroskopi görüntülerinden çıkarı olan düzleştirilmiş solucanların tek veya çok kanallı montajlarını oluşturmak için kullanılabilen Worm-align adlı basit bir açık kaynak Fiji tabanlı iş akışını tanımlıyoruz. Bu iş akışı kullanıcı tarafından seçilen ilgi çekici hayvanlara dayandığından, solucanların hepsinin doğru aşamada veya durumda olmadığı C.elegans'tan gelen görüntüleri analiz ederken özellikle yararlı olabilir. Worm-align çıktısının, Fiji veya diğer görüntü analiz yazılımları ile floresan sonraki niceliklendirme için kullanılabileceğini belirtmek gerekir.Burada CellProfiler boru hattı Worm_CP kullanarak floresan nicelliği göstermek. Alev uzatma sonra, uzatma sonra iki parçaya kırmak değilse iki parçaya kılcal kırın.Eğer iki parçaya bölünüyorsa, en uzununun ucunu kes. Uzun parçaseçin ve su aspire etmeye çalışarak kılcal açık olup olmadığını test edin. Adaptörü üç milimetrelik silikon tüpten ayırın.Cam kılcal damarı altı milimetrelik silikon boruya bağlı bir kılcal adaptöre takın. Daha sonra altı milimetrelik tüpün diğer ucunu 0,2 mikrometrelik bir filtreye ve diğer ucundaki üç milimetrelik silikon tüpe takın. Sıvı aspire etmek için üç milimetrelik silikon tüpserbest ucuna bir milimetrelik filtre ucu takın.Bir diseksiyon mikroskobu altında, ağız mikropipet ile sabit solucanlar bir pelet etrafında mümkün olduğunca çok sıvı çıkarın. Hızlı bir şekilde tüpün altına montaj orta 10 mikrolitre ekleyin. Solucanların plastik pipet ucunun kenarlarına yapışmasını önlemek için PBS'de 10 mikrolitrelik bir ucu deterjan izleriyle durulayın.Sonra bir makas ile ucun ucunu kesin. Solucanlar ile sekiz mikrolitre montaj ortamını önceden hazırlanmış bir agarose pedin üzerine aktarın. Mikroskop altında slayt gözlemlerken, yavaşça solucanların çakışmasını önlemek için çalkalayın.Daha sonra agarose ped üzerinde montaj ortamı nın damlasını 18'e 18 milimetrelik bir kapak kaydırarak kapatın. Canlı solucanlar monte etmek için, pipet üç milimolar levamisole üç ila dört mikrolitre M9 bir agarose ped üzerine çözülmüş. Levamisole damla içine durum başına 30-50 solucanlar seçin.Daha sonra damlayı 18'e 18 milimetrelik bir kapak la kaplayın ve solucanları bir saat içinde görüntüleyin. ImageJ'den açık kaynak görüntü analizi yazılım paketi Fiji'yi yükleyin veya bilgisayara zaten yüklenmişse, sürüm 1.52A veya daha sonra olduğunu doğrulayın, ardından Worm-align deposunu GitHub'dan indirin ve bilgisayara kaydedin. Tüm boru hattı bileşenleri indirilip yüklendikten sonra Fiji'yi açın ve eklentileri, makroları tıklatarak Worm-align makroyu çalıştırın ve ana menü çubuğunda çalıştırın.Solucan hizasını bulun. ijm script ve açık tıklayın. Analiz edilecek resimlerle giriş klasörüne gidin ve seç'i tıklatın ve seçili klasörün yalnızca resim dosyaları içerdiğinden emin olun.Makro, tüm sonuçların kaydedilen bir çıktı klasörü otomatik olarak oluşturur. Klasörün adı, post-fix olarak çıktısı olan giriş klasörüyle aynı olacaktır. Makronun giriş klasöründeki ilk görüntüyü açmasına ve solucanların genişliği, parlaklık ve kontrast da dahil olmak üzere montajı oluşturmak için gereken ayarları ayıklamak için temsili bir görüntü olarak kullanmasına izin verin.Düz çizgi çizim aracını kullanarak, solucan genişliği boyunca bir çizgi çizin ve Tamam'ı tıklatın. Tek solucanlar için kırpılan bölgelerin yüksekliğini belirlemek için bu satırın uzunluğunu kullanın. Her kanal için, adı, arama tablosunu ve montaja dahil edilip edilmemesigerektiğini belirtin, ardından Tamam'ı tıklatın. Ardından, kaydırıcıları kullanarak kanalların parlaklık ve kontrast ayarlarını ayarlayın. Kalan kanallar için bu işlemi yineleyin.Tüm ayarlar yapılandırıldıktan sonra, ayarlar tablosuna kaydedilir ve çıktı klasörünün CellProfiler alt klasörüne kaydedilir. Ayarlar uygulamasından sonra tüm görüntülerin nasıl görüneceğini göstermek için bir görüntü oluşturulur. Görüntü tatmin ediciyse, üst kutuyu işaretleyin.Tüm ayarlar panelinin ikinci ve üçüncü kutusunda montaj oluşturma seçeneklerini belirtir. Her iki kutuyu da işaretli bırakın ve makronun geri kalanını yürütmek için Tamam'ı tıklatın. Üst kutuyu işaretlememek makronun kurulumu yeniden çalıştırmasına neden olur.Makro daha sonra giriş klasöründeki tüm görüntüleri açmaya devam eder. Her görüntü için, parçalı veya serbest çizgi aracı kullanılarak montaja dahil edilecek tüm solucanların uzunlamasına eksenine çizgiler çizin. Solucanların tam uzunluğu boyunca sürekli olarak baştan başa veya tam tersi çizgiler çizin ve Her satırı Denetim T.'yi tıklatarak YG yöneticisine ekleyin.İstenilen tüm solucanlar eklendikten sonra Tamam'ı tıklatın. Solucan hizalama daha sonra, çıktı klasörünün tek solucan alt klasörüne kaydedilecek olan tek seçili solucanların kırpılmış görüntülerini oluşturur.Seçilen tüm solucanların montajları hizalanmış klasöre kaydedilir. Download sayfasında önceki CellProfiler sürümleri için bağlantıyı tıklayarak ve gerekli işletim sistemini seçerek CellProfiler 2.2.0'ı indirin ve kurun. Worm_CP ardışık Worm_CP başlatmadan önce, beklenen tüm çıktı görüntülerinin Worm-align çıktı klasörünün CellProfiler alt klasöründe bulunduğundan emin olun.Özgün görüntünün işlenmiş bir kopyası, solucan popülasyonunun ikili görüntü maskesi, seçili solucanlar üzerinde çizgi çizilirse maskeyi hizala ve orijinal görüntüdeki kanalların her birini temsil eden bir görüntü bulunmalıdır. CellProfiler'ı açın, ardından görüntüler giriş modülüne tıklayın ve CellProfiler modülü klasörünü burada dosya ve klasörleri bırak yazan pencereye sürükleyin. Önceki bir çözümlemeden bir resim listesi varsa, önce pencereye sağ tıklayarak ve dosya listesini temizleyerek bunları kaldırın.Meta veri giriş modülüne ve ikinci çıkarma yöntemine tıklayın, sarı klasöre tıklayın ve Worm-align çıktı klasörünün CellProfiler alt klasörüne gidin. Ayarlar dosyasını seçin ve ardından güncelleştirmeyi tıklatın. Ardından, adlar ve tür giriş modülü ne tıklayın ve boru hattı için gerekli tüm görüntülerin mevcut olduğundan emin olun.Ardışık hattı çalıştırmadan önce, çıktı modülündeki çıktı sonuçları için bir hedef seçin. Başlat test modunu tıklatarak ardışık yapının nasıl performans gösterdiğini görmek ve klasördeki ilk görüntüde çalışmasına izin vermek için test modunu kullanın. Boru hattının performansından memnun olduğunuzda, çıkış test moduna tıklayın ve görüntüleri analiz edin.Analize başlamadan önce, analiz modülüönündeki tüm gözlerin kapalı olduğundan emin olun. Çözümleme tamamlandığında, iki CSV dosyası, solucanlar CSV ve CSV satırlarıoluşan Worm_CP çıktı klasörünü açın. Bu protokolde açıklanan yönteme göre C.elegans'ın kültürlenmesi ve görüntülenmesi solucan popülasyonlarının büyük genel bakış görüntülerini üretir.Boru hattının çıkışı büyük ölçüde görüntülerin üzerine çizilen çizgilerin kalitesine bağlıdır. Worm-align'dan birkaç satır örneği ve çıktıları burada gösterilmiştir. Worm-align komut dosyası kullanılırken, kesişen solucanların görsel tanımlaması, veri alt klasöründe bulunan bindirme görüntülerinden ve montajdaki tek tek solucan panellerinden mümkündür.QC tablosu, çakışan solucanları tanımlamak için de kullanılabilir. Ancak, kesişen çizgiler Worm_CP boru hattı için sorunludur. Bunun nedeni, Worm_CP tek tek solucanları belirlemeye yardımcı olmak için ilgi alanları değil, satır maskesi kullanmasıdır.Bu nedenle, CellProfiler solucanlardan birini iki nesne olarak bölümlere ayıracaktır. Worm_CP boru hattı lipid damlacıkları içine dahil bir floresan boya ile etiketlenmiş sabit hayvanlardan floresan yoğunluğunu ölçmek için kullanılmıştır. Lipid damlacık içeriği, elle ölçülen yabani tip ve mutant DBL1 hayvanları arasında %17, Worm_CP boru hattı kullanılarak %12 oranında azalır.Worm_CP aynı zamanda gfp'yi ısı şoku indükleyici genin kontrolü altında ifade eden canlı solucanlarda ısı şoku tepkisini ölçmek için de kullanıldı. Isı stresi yokluğunda, solucanlar GFP ifadesini tetiklemedi. Solucanlar kısa ısı şoku olarak maruz kaldığında, GFP ifadesi indüklenir.Worm_CP çıktısı büyük ölçüde Worm-align kullanarak çizdiğiniz çizgilerin kalitesine bağlıdır. Çizgilerinizin dokunmadığından veya çakışmadığından emin olun ve tüm çizgilerinizi aynı yöne çizin. QC tablosunu denetlemek, bu durumları çözümlemenizden çıkarabilmeniz için dokunan veya çakışan satırları belirlemenize yardımcı olabilir.Worm-align çıktısı, Fiji'de veya diğer görüntü analizi yazılım paketlerinde sonraki niceleme için kullanılabilir. Burada, örneğin lipid damlacıklarının sayısını saymak veya solucan içindeki tek tek damlacıkların yoğunluğunu ölçmek için diğer analiz modüllerinin kolayca dahil edilebildiği çok temel bir CellProfiler boru hattı gösterdik. Bu tekniğin avantajlarından biri de tek tek solucanlardan gelen floresanları hızla ölçme olasılığıdır.Laboratuvarımızda floresan muhabirlerini kullanarak bireysel canlılığa ilgi görüyoruz ve bu amaç için Worm-align ve Worm_CP rutin olarak kullanıyoruz.

Research

JoVE Journal

Biology

Worm-align and Worm_CP, Two Open-Source Pipelines for Straightening and Quantification of Fluorescence Image Data Obtained from Caenorhabditis elegans

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Vampiric Isolation of Extracellular Fluid from Caenorhabditis elegans

Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The genetically tractable model organism C. elegans has provided insights into a myriad of biological questions, enabled by its short generation time, ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

Workflow for High-content, Individual Cell Quantification of Fluorescent Markers from Universal Microscope Data, Supported by Open Source Software

Yüksek içerik, Open Source Software tarafından desteklenen Evrensel Mikroskop Verilerden Floresan Göstergeler, Bireysel Hücre Niceleme için iş akışı

Advances in understanding the control mechanisms governing the behavior of cells in adherent mammalian tissue culture models are becoming increasingly ...

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Tracking and Quantifying Developmental Processes in C. elegans Using Open-source Tools

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Quantitatively capturing developmental processes is crucial to derive mechanistic models and key to identify and describe mutant phenotypes. Here ...

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Observation and Quantification of Telomere and Repetitive Sequences Using Fluorescence In Situ Hybridization FISH with PNA Probes in Caenorhabditis elegans

Gözlem ve telomer Niceleme ve Tekrarlayan Diziler kullanma Floresan<em&gt; In Situ</emPNA Sondalar&gt; ile hibridizasyon (FISH)<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Telomere is a ribonucleoprotein structure that protects chromosomal ends from aberrant fusion and degradation. Telomere length is maintained by telomerase ...

Open Source High Content Analysis Utilizing Automated Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Otomatik Flüoresans Ömrü Görüntüleme Mikroskopi kullanmak Open Source Yüksek İçerik Analizi

We present an open source high content analysis instrument utilizing automated fluorescence lifetime imaging (FLIM) for assaying protein interactions ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

VirusMapper Süper çözünürlüklü Mikroskopi Açık kaynak Tek parçacık Analizi

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Lipid bolluk ve değerlendirme Lipid dağılımı Nil kırmızı ve O kırmızı petrol boyama tarafından Caenorhabditis elegans miktar

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...