Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

نشكر تشاو جون لي في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، جامعة نانجينغ لتحليل القياس الطيفي الكتلي. نشكر يانميني دلال، وتاتسو فوكاغاوا، والباحثين الحاليين في مركز أبحاث الحيوانات النموذجي، وجامعة نانجينغ ومعهد أبحاث سرطان الأطفال في غريهي على مناقشتهم المفيدة، والتوجيه التجريبي، والكواشف. نشكر دون و. كليفلاند، دانييلي فاشينيتي، يانميني دلال، مينه بوي، غوستافو دبليو ليون، جون طومسون، لورانس س. كيرشنر، عمروتا أشتيكار، بن إي بلاك، غلينيس أ. لوجسدون، كينجي تاغو، وداون س. تشاندلر على هداياهم السخية من الكواشف. وقد تم دعم Y.N. من قبل مقاطعة جيانغسو 'مزدوجة - من الدرجة الأولى' صندوق البناء ، صندوق العلوم الطبيعية لمقاطعة جيانغسو (SBK2019021248)، ومقاطعة جيانغسو 16th ستة صندوق قمم المواهب الكبرى (TD-SWYY-001)، مقاطعة جيانغسو "برنامج المواهب مائة الخبراء الأجانب" صندوق (SBK2019010048)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31970665). وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا من قبل NCI منحة R21 CA205659.

1. ثقافة الخلية وvirus retro transfection من pBabe-EYFP-CENP-A التشيّد
ملاحظة: يتم التعبير عن EYFP-CENP-A من pBabe-EYFP-CENP-A على مستوى بروتين مماثل إلى CENP-A الذاتية. يتم استبدال مجموع البروتين الخلوي CENP-A مع هذا EYFP-CENP-A بعد تعطيل CENP-A-/F أليل بواسطة إعادة الكومبينيز Cre كما هو الحال في RPE-1 CENP-A-/- الخلايا<sup class=...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

هنا وصفنا طرق تحليل القياس الطيفي الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن وضع العلامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. في نتائجنا، نجحنا في تحديد في كل مكان على lysine 306 (K306) في EYFP-CENP-A K124R، وهذا هو المقابلة لايزين 56 (K56) في CENP-A من خلال ت...

في معظم eukaryotes ، يجب أن تلتصق ميكروتيبولس المغزل إلى منطقة واحدة من كل كروموسوم ، يطلق عليه السنترومير. الكينتوشور هو مجمع من البروتينات التي تقع في السنترومير. دراسة توقيت حركات البروتين السنتروميري و kinetochore وبنية kinetochores و centromeres مهم لفهم عدم الاستقرار الكروموسوم (CIN) وتطور السرطان. وتتمثل الأسئلة الرئيسية في كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) وكيفية مشاركتهم في الفصل الدقيق للكروموسومات. في معظم الأنواع، وجود نواة خاصة تحتوي على بروتين معين يشبه هيستون يسمى CENP-A يحدد هوية السنترومير. ولذلك، يُقترح أن يكون مؤشر CENP-A هو مؤشر غير الحمض النووي (علامة اللاجينية) لهوية الميرومير. من المهم توضيح آلية كيفية تعريف CENP-A لهوية السنترومير في البشر.
إن بروتين التعرف على تقاطع هوليداي (HJURP) هو شابرون CENP-A-محددة الذي يودع CENP-A في نوى 11،2،3. لقد سبق أن ذكرت أن مطلوب CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase لCENP-A في كل مكان على lysine 124 (K124) وتوطين centromere4. كما أن نتائجنا أظهرت أن التوظيف centromere من توليفها حديثا CENP-A يتطلب موجودة من قبل في كل مكان CENP-A5. وهكذا، تم تقديم نموذج يشير إلى أن CENP-A في كل مكان موروثة من خلال التملم بين الانقسامات الخلية.
وعلى النقيض من النتائج التي توصلنا إليها وتلك التي توصلنا إليها، فقد تم نشر النتائج السلبية المتعلقة بـ CENP-A وتوطينها في المنطقة الوسطى مؤخراً6. وادعى المقال أن CENP-A التعديلات على lysine 124 (K124) هي الاستغناء عن إنشاء، وصيانة، وظيفة طويلة الأجل من تينتروميرس الإنسان، استنادا إلى نتائجها السلبية تبين أن طفرة K124R لم تؤثر على CENP-A centrom توطين لا خلية قابلية البقاء6. ومع ذلك، هناك ما يكفي من النقاش في النتائج والاستنتاجات، وقد سبق أن وصفنا ما هي المشكلة التي يمكن أن تكون هناك في نشرتهم السابقة7. وينبغي إيلاء الاهتمام بأنهم تنصهر البروتينات مع CENP-A، التي لديها أوزان جزيئية أكبر بكثير من حجم CENP-A الذاتية: على سبيل المثال، تنصهر ~ 30 كيلو ادا المعزز البروتين الفلورسنت (EYFP) إلى ~ 16 كيلو ادا CENP-A وتحليل EYFP-CENP-A K124R البروتين الانصهار في نظامهم RPE-1CENP-A-/F خروج المغلوب. لا يتوقع أن يرتبط K124 ubiquitin مباشرة إلى HJURP استناداً إلى التنبؤات الهيكلية4، ومع ذلك ، من المتوقع أن يكون لإضافة أحادية ubiquitin تأثير على بروتين التشكل من CENP-A. يمكن تغيير بروتين CENP-A التشكل من خلال وجود بروتين انصهار كبير ، وهذا التغيير التشكلي قد يخفي التغيرات الهيكلية الناجمة عن فقدان في كل مكان. نقترح أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في lysine غير K124 في EYFP -CENP -A K124R متحولة وهذا في كل مكان في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة. دليل على أن يحدث في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين المتحول K124R CENP-A مع بروتين كبير (EYFP) تم الإبلاغ عنها في نشرتنا السابقة8. ووجد أن علامات EYFP تحفز في كل مكان من موقع ليسين آخر من EYFP -CENP-A K124R وأن EYFP-CENP-A K124R يربط متحولة HJURP. ونتيجة لذلك ، فإن هذا ubiquitylation في موقع آخر يمنع / أقنعة الأصلي K124R الأصلي نمط ظاهري متحولة واحدة ، وكلاهما EYFP - CENP - A WT وK124R المسوخ أظهرت تعريب centromere (استخدمنا وقارنا pBabe - EYFP - CENP - A WT و K124R متحولة ، جنبا إلى جنب مع pBabe - EYFP control.). وأظهرت النتائج أن العلم الموسومة أو غير الموسومة CENP- A K124R المسوخ قاتلة ولكن يمكن إنقاذها من قبل الانصهار monoubiquitin، مما يشير إلى أن CENP-A في كل مكان هو لا غنى عنه لقابلية الخلية.
في السنوات الأخيرة، وضعت العديد من الدراسات المقايسات المختلفة لتحديد التعديلات ما بعد التحويل (PTMs) من البروتين CENP-A والبروتينات المركزية-كينتوشور الأخرى سواء في الجسم الحي وفي المختبر9،10،11. مماثلة ل PTMs من بروتينات هيستون التي هي آلية رئيسية تنظم وظيفة الكروماتين، وتشارك أيضا PTMs من مكونات الكروماتين chromatin centromeric في آلية أساسية لتنظيم الهيكل العام ودالة centromeres. معظم مواقع CENP-A PTM محددة للنيات التي تحتوي على CENP-A، على الرغم من أن يتم حفظ عدد قليل منها في H3، مما يشير إلى أن تعديل هذه المخلفات تساهم في وظيفة centromere محددة. PTMs من CENP-A بما في ذلك الفسفر، أستيليشن، methylation، وفي كل مكان كانت قد ذكرت سابقا9، مما يشير إلى أن CENP-A يتعرض لمجموعة متنوعة من PTMs والمصفوفات الخاصة بهم الجمعي على الدلفين الأمينية وC-terminus هيستون أضعاف المجال. وقد كشفت عن أهمية CENP -A التعديلات في وظائف متعددة من قبل العديد من المجموعات بما في ذلك لنا. وتشمل هذه الوظائف CENP-A ترسب في centromeres، واستقرار البروتين، وتوظيف CCAN (الشبكة المرتبطة centromere التأسيسية)9. ومع ذلك، فإن الدراسات والنتائج المحدودة لـ CENP-A PTMs هي preformed حيث يتم إجراء مقارنات مع واحدة من النغمات الكنسية التي تنظم وظيفتها بشكل مباشر أو غير مباشر. كما أن التقارير التقنية التي تركز على منهجية تحديد هذه التدابير CENP-A PTMs محدودة أيضاً.
لأن CENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في12سنترومير ، ورثت من خلال dimerization بين انقسام الخلية5، ولا غنى عنه لقابلية الخلية8، فإن طريقة لتحديد CENP -A في كل مكان يكون من الضروري في المستقبل لدراسة النشاط الوظيفي ، وتحديد المواقع ، وهيكل من centromere. ولذلك، هنا نحن وصف تحليل الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن علامات EYFP يدفع في كل مكان في lysine مختلفة في البروتين CENP-A K124R متحولة8. كما يتم عرض بروتوكولات من المقايسات وغيرها من التحليلات السيطرة (تحليل المناعةfluorescence، محك مستعمرة خارج نمو، وفي التحليل في كل مكان vivo) لمناقشة نتائج التحليل الرئيسي لقياس الطيف الشامل بشكل صحيح.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

دراسة بنية وديناميكيات الكينتوتشورات و centromeres مهم في فهم عدم استقرار الكروموسومات (CIN) وتطور السرطان. إن كيفية تحديد موقع الكروموسومات ووظيفته لـ "السنترومير" (أي هوية السنترومير) والمشاركة في الفصل الدقيق للكروموسومات هو سؤال أساسي. ويقترح أن يكون مؤشر الحمض النووي غير (علامة وراثية) هوية سنترومير، وCENP-A في كل مكان مطلوب لترسب CENP-A في السنترومير، موروثة من خلال التمدن بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية.
هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP-CENP-A K124R متحولة مما يشير إلى أن يتم حث في كل مكان في ليسين مختلفة بسبب وضع علامات EYFP في البروتين المتحول CENP-A K124R. تم تحديد Lysine 306 (K306) في كل مكان في EYFP-CENP-A K124R بنجاح، والذي يتوافق مع الlysine 56 (K56) في CENP-A من خلال تحليل القياس الطيفي الشامل. ويناقش التحذير في استخدام GFP / EYFP أو وضع علامات على ارتفاع الوزن الجزيئي البروتين كأداة لتحليل وظيفة البروتين. كما يناقش الحد التقني الحالي للكشف عن النطاقات في كل مكان، وتحديد كل مكان في كل مكان (ق) محددة، وتصور في كل مكان في الخلايا الحية أو خلية واحدة محددة خلال دورة الخلية بأكملها.
طريقة تحليل قياس الطيف الشامل المعروضة هنا يمكن تطبيقها على البروتين CENP-A البشري مع علامات مختلفة وغيرها من البروتينات centromere-kinetochore. ويمكن التوصية بهذه الطرق الجمعية التي تتكون من عدة مقايسات/تحليلات للباحثين المهتمين بتحديد الأدوار الوظيفية للدمج في كل مكان.

EYFP-CENP-A K124 متحولة يظهر في كل مكان، والتفاعل مع HJURP، وليس هناك عيوب في توطين centromere لا الفتك الخلية. هنا تم إعادة تشكيل النظام الذي أبلغ عنه Fachinetti et al. (2017)6: في خلايا الإنسان diploid (RPE-1) التي تحمل واحدة تعطلت وواحدة ''floxed'' CENP-A أليل(CENP-A-/F),تم التعبير عن EYFP-CENP-A من ن?...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A في كل مكان هو شرط مهم ل CENP-A ترسب في السنترومير، ورثت من خلال تخمير بين انقسام الخلايا، ولا غنى عنه لقابلية الخلية. هنا نحن وصف تحليل قياس الطيف الشامل لتحديد في كل مكان من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A) البروتين.

تحليل قياس الطيف الكتلي لتحديد Ubiquitylation من EYFP الموسومة CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

هذه الطريقة تجعل من الممكن لتحديد في كل مكان من البروتين EYFP الموسومة CENP-A. ويمكن أيضا أن تطبق على الإنسان CENP-A البروتين مع اختبارات مختلفة والبروتينات الأخرى. والميزة الرئيسية لذلك هي أنه يمكن استخدامه لتحديد مواقع EYFP CENP-A K124R في كل مكان مع أهمية بيولوجية حاسمة.ويمكن توسيع نطاقها للتحقيق في التعديلات اللاحقة للترجمة لمجموعة واسعة من البروتينات الوظيفية. تبدأ من خلال إعداد البروتين الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة GFP. غسل 25 ميكرولترات من البروتين حبات لكل تفاعل مناعي مع A1 العازلة على الأقل ثلاث مرات لإزالة الإيثانول.ثم جعل 50٪ حبة الحل مع المخزن المؤقت A1. إضافة اثنين microliters من الأجسام المضادة GFP إلى الخرز. ثم إضافة المخزن المؤقت A1 إلى 20 مرة صافي حجم حبة. تنفيذ دورة من نهاية إلى نهاية في أربع درجات مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة.يجب تحديد المدة المثلى للدوران تجريبيًا استنادًا إلى كفاءة المناعة. بعد التناوب، الطرد المركزي الخرز في 100 مرة ز لمدة دقيقة واحدة وإزالة غير منضم فائقة. إضافة A1 العازلة لجعل 50٪ حل من الخرز واستخدام 25 ميكرولترات من هذا الحل لكل رد فعل المناعي.لأداء المناعة، والخلايا ال ليس في A1 العازلة عبر سونيكيشن وتجميد / ذوبان. قياس تركيزات البروتين وتطبيع كميات البروتين بين عينات IP مختلفة. ثم إزالة 5٪ من العينة من كل أنبوب لتشغيل في صفحة SDS.اخلط بقية المزيج مع 25 ميكرولترات من البروتين A الخرز المرتبطة بالأجسام المضادة لـ GFP وأداء دوران من النهاية إلى النهاية عند أربع درجات مئوية لمدة أربع إلى 18 ساعة. بعد الخلايا في عازلة A وأداء المناعة كما وصف سابقا، والحفاظ على 10٪ من مجموع immunoprecipants لتأكيد EYFP CENP-A في كل مكان وتحديد موقف من كل مكان في كل مكان EYFP CENP-A. استخدام 90٪ أخرى لتحليل قياس الطيف الشامل.تشغيل عينة الطيف الشامل في 4-12٪ المتاحة تجارياً بروتين هلام Bis-Tris. ثم قم بإجراء تلوين كوز الأزرق Coomassie واستئصال منطقة هلام 50-70 كيلودالتون لتحليل القياس الطيفي الشامل. النرد كل شريحة هلام في قطع صغيرة ووضعها في أنبوب البروتين منخفضة 0.5 ملليمتر ملزمة.غسل القطع هلام مع 100 ميكرولترات من 50٪ الأسيتونتريل في 25 ميليمولار بيكربونات الأمونيوم. دوامة لهم لمدة 10-15 دقيقة. ثم تدور عليهم وتجاهل supernatant.بعد الغسيل الأخير، جفف قطع الجل مع مركز فراغ أعلى مقاعد البدلاء لمدة 30 دقيقة. إضافة 10 ميكرولترات من 10 نانوغرام لكل ميكرولتر التسلسل الصف التربسين والسماح للقطع هلام إعادة الترطيب لمدة خمس دقائق. ثم إضافة 25 ميليمولار بيكربونات، فقط بما فيه الكفاية لتغطية القطع هلام وهضمها في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها.في اليوم التالي, نقل هضم هضوب إلى أنبوب سيليكوني 0.65 ملليلتر نظيفة وإضافة 50٪ الأسيتونتريل و 5٪ حل حمض فشكل. دوامة العينة لمدة 10 دقائق. ثم تدور عليه ونقل افرا في أنبوب الاستخراج.تركيز العينة مرة أخرى إلى اثنين من microliters. ثم إضافة ثمانية ميكروليتر من 3٪ acetonitrile و 2٪ حل حمض فشكل. دوامة لمدة 15 دقيقة وتدور عليه في 16،000 مرات ز لمدة 30 دقيقة.إجراء عملية الحصول على بيانات MS باستخدام LC-MS/MS باستخدام نظام كروماتوغرافي سائل مقرون بآلة قياس الطيف الكتلي. حقن ثمانية ميكرولترات من العينة في مرحلة عكسية عمود الكروماتوغرافيا السائلة وفصل الببتيدات مع 2-80٪ تدرج من المذيب B في 60 دقيقة بعد اتجاهات المخطوطات. جمع بيانات قياس الطيف الكتلي باستخدام وضع الاكتساب المعتمد على البيانات.افتح البرنامج التجاري لتحليل بيانات قياس الطيف الكتلي على سطح المكتب. لبدء بحث جديد، انقر فوق الزر LC في القائمة العلوية. ثم انقر فوق الزر إضافة لتحميل ملفات البيانات الأولية MS الأصلي.حدد معرف البروتين البشري في طريقة المثل كأسلوب البحث في قاعدة البيانات والبحث في ملفات البيانات الأولية MS الأصلي مقابل قاعدة بيانات UniProt homo sapiens. حدد التربسين كما هو الانزيم الهضم وتعيين بقية المعلمات وفقا لاتجاهات المخطوطات. أدخل اسم ملف النتائج وانقر فوق الزر حفظ باسم على يمين القائمة.ثم حدد مجلدًا لتخزين نتائج البحث وانقر على زر الحفظ. انقر فوق الزر Process لبدء البحث. بعد انتهاء البحث، سيتم تخزين البيانات التي تحمل اسم البحث الذي تم إدخاله تلقائيًا في المجلد المحدد.للحصول على أطياف MS /MS من أي ببتيد معين، فتح نتائج البحث في برنامج F.Then انقر على البروتين في قائمة البروتين في القائمة العلوية وانقر على الببتيد في القائمة الوسطى. سوف MS / MS من هذا الببتيد تظهر في الجزء السفلي من القائمة. لتصدير أطياف MS/MS وحفظها، انسخ الأطياف ولصقها على تنسيق ملف مناسب.تم التعبير عن بنيات الجينات من نوع EYFP CENP-A البرية أو متحولة K124R التي تنقذ فقدان CENP-A الذاتية بشكل ثابت عندما تم تنفيذ تكامل الفيروسات الرجعية. لم يتم الكشف عن التعبير عن CENP-A الذاتية بعد سبعة أيام من تحريض إعادة الكومبينيز Cre. تم العثور على كل من نوع EYFP CENP-A البرية والتعبير عن البروتين K124R لتكون على مستوى مماثل للبروتين CENP-A الذاتية الأولية.أظهر كل من EYFP CENP-A من النوع البري وK124R mutants توطين السنترومير في سبعة أيام بعد تعطيل التعبير المتبقي من CENP-A الذاتية. وأظهرت EYFP CENP-A نوع البرية وK124R متحولة في كل مكان والتفاعل مع HJURP على عكس حالة لوضع علامة أو غير الموسومة CENP-A نوع البرية وK124R متحولة. تم تقييم صلاحية الخلية من خلال إجراء مقايسة المستعمرة خارج 14 يوما بعد تعطيل CENP-A الأليلة الذاتية المتبقية.وأظهرت كل من نوع EYFP CENP-A البرية وK124R المسوخ عدد مماثل من المستعمرات التي تم إنقاذها بعد 14 يوما من تعطيل CENP-A الأليلة الذاتية المتبقية. كشف قياس الطيف الكتلي IP في كل مكان في lysine 306 في EYFP CENP-A K124R في خلايا CENP-A ناقص F. معا، هذه النتائج تشير إلى أن الانصهار من البروتين كبير الحجم يدفع في كل مكان في ليسين غير K124R في CENP-A الذي يمنع الأصلي K124R نمط ظاهري واحد متحولة.عند محاولة هذا البروتوكول، استخدم المواد الهلامية البروتينية المتاحة تجارياً بنسبة 4٪12٪ Bis-Tris لتشغيل عينات قياس الطيف الكتلي. إضافة التربسين كافية لقطع هلام وإعادة هيدرات لهم حتى تم امتصاص جميع الانزيمات. إن تقنية وضع علامات على الوزن الجزيئي أو التحقق مطلوبة في الواقع لتصور كل مكان وتحقيق إشارات في كل مكان من البروتين الزماني على مستوى الكائنات الحية بأكملها.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI تحضير العينة : الترا أسلوب طبقة رقيقة

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

تحليل البروتين المجمعات الكبيرة التي الطيف الكتلي الإنشائية

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

تي موجة ايون التنقل الكتلة الطيفي : الإجراءات التجريبية الأساسية لتحليل البروتين مجمع

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

أميد الهيدروجينية / الديتريوم الطيف الكتلي تبادل و- TOF MALDI تحليل Pak2 التنشيط

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

التنميط بروتيوم الأكسدة والاختزال ثيول استخدام الطيف النظائر كتلة توصيف

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

التقاط الطيف الكتلي - أداة قوية لتحديد رواية ج-دي-GMP المستجيب البروتينات

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

إثراء خارج الخلية مصفوفة البروتينات من الأنسجة والهضم في الببتيدات لتحليل الطيف الكتلي

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

تطبيقات أحادية التحقيق: وسائل التصوير الطيفي والتحليل خلية واحدة في ظل الظروف المحيطة

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...