Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Vi takker Chao-Jun Li på Model Animal Research Center, Nanjing University for massespektrometri analyse. Vi takker Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, og nuværende forskere ved Model Animal Research Center, Nanjing University og Greehey Children's Cancer Research Institute for deres nyttige diskussion, eksperimentel vejledning, og reagenser. Vi takker Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago og Dawn S. Chandler for deres generøse gaver af reagenser. Y.N. blev støttet af Jiangsu-provinsen ''Double- First-Class'' Construction Fund, Jiangsu-provinsen Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) og National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denne undersøgelse blev delvist støttet af NCI-tilskud R21 CA205659.

1. Cellekultur og retrovirustransfektion af pBabe-EYFP-CENP-A konstruktioner
BEMÆRK: EYFP-CENP-A udtrykkes fra pBabe-EYFP-CENP-A på et proteinniveau, der svarer til det endogene CENP-A. Total cellulære CENP-A protein erstattes med denne EYFP-CENP-A efter afbrydelse af CENP-A-/F allel af Cre recombinase som i RPE-1 CENP-A-/- celler6.
<ol><li>Klargøring af supernatanten indeholdende retrovirus ved hjælp af 293T-emballageceller.<ol>
<li>Dag 0: Spred 293T ...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Her beskrev vi metoder til massespektrometri analyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-CENP-A K124R mutant tyder på, at EYFP tagging inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin i CENP-A K124R mutant protein8. I vores resultater identificerede vi med succes allestedsnærværende lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, der svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometrianalyse. Massespektrometri analyse beskrevet her er en efterligne metode, som vi tidli...

I de fleste eukaryoter skal spindelmikrottbuler knyttes til en enkelt region af hvert kromosom, der betegnes som centromere. Kinetochore er et kompleks af proteiner, der er placeret på centromere. Undersøgelse af timingen af centromere og kinetochore protein bevægelser og strukturen af kinetochores og centromeres er vigtigt for at forstå kromosom ustabilitet (CIN) og kræft progression. De centrale spørgsmål er, hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes, og hvordan de deltager i nøjagtig kromosom adskillelse. I de fleste arter definerer tilstedeværelsen af et særligt nukleososom, der indeholder et specifikt histonlignende protein kaldet CENP-A, centromeres identitet. Det foreslås derfor, at CENP-A er ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet. Det er vigtigt at belyse mekanismen for, hvordan CENP-A definerer centromere identitet hos mennesker.
Holliday-krydsgenkendelsesproteinet (HJURP) er den CENP-A-specifikke chaperon , som deponerer CENP-A i centromeric nucleosomes1,2,3. Vi har tidligere rapporteret, at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase er påkrævet for CENP-A allestedsnærværendelation på lysin 124 (K124) og centromere lokalisering4. Også, vores resultater viste, at centromere rekruttering af nyligt syntetiseret CENP-A kræver allerede eksisterende ubiquitylated CENP-A5. Således blev der fremlagt en model, der antydede, at CENP-A allestedsnærværendelation er nedarvet gennem dimerisering mellem celledivisioner.
I modsætning til vores resultater og yu et al.,, negative resultater vedrørende CENP-A og dens centromeric lokalisering blev for nylig offentliggjort6. Artiklen hævdede, at CENP-A ændringer på lysin 124 (K124) kan undværes til etablering, vedligeholdelse og langsigtet funktion af menneskelige centromeres, baseret på deres negative resultater viser, at mutationen af K124R ikke påvirke CENP-A centromere lokalisering hverken celle levedygtighed6. Der er imidlertid plads nok til debat i deres resultater og konklusioner, og vi har allerede beskrevet, hvilket problem der kunne være i deres tidligere publikation7. Man skal være opmærksom på, at de fusionerede proteiner med CENP-A, som har meget større molekylvægt end størrelsen af endogene CENP-A: fx, de smeltede ~ 30 kDa forbedret gul fluorescerende protein (EYFP) til ~ 16 kDa CENP-A og analyserede EYFP-CENP-A K124R fusion protein i deres RPE-1 CENP-A-/knockout F system. K124 ubiquitin forventes ikke at binde direkte til HJURP baseret på strukturelle forudsigelser4,men tilsætning af mono-ubiquitin forventes at have en indvirkning på protein kropsbygning af CENP-A. Proteinet i CENP-A-kropsbygning kan ændres ved tilstedeværelsen af et stort fusionsprotein, og denne konformationsændring kan maskere de strukturelle ændringer forårsaget af tab af allestedsnærværendelation. Vi foreslår, at fusionen af store protein inducerer allestedsnærværendelation på en anden lysin end K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant og denne allestedsnærværendelation på et andet sted hæmmer / masker den oprindelige K124R enkelt mutant fænotype. Der blev rapporteret om dokumentation for, at der forekommer allestedsnærværende allestedsnærværende oplysninger i forskellige lysin i CENP-A K124R-proteinet med et stort tagprotein (EYFP), i vores tidligere publikation8. Det blev konstateret, at EYFP-mærkning fremkalder ubiquitination af et andet lysinsted for EYFP-CENP-A K124R, og at EYFP-CENP-A K124R-mutant binder sig til HJURP. Som følge heraf hæmmer og maskerer denne allestedsnærværendelation på et andet sted den oprindelige K124R-enkelt mutant fænotype, og både EYFP-CENP-A WT og K124R-mutanter viste centromere lokalisering (vi brugte og sammenlignede pBabe-EYFP-CENP-A WT og K124R-mutant sammen med pBabe-EYFP-kontrol.). Resultaterne viste, at flagmærkede eller umærkede CENP-A K124R-mutanter er dødelige, men kan reddes ved en monoubiquitinfusion, hvilket tyder på, at CENP-A allestedsnærværende forholdation er uundværlig for cellernes levedygtighed.
I de senere år har mange undersøgelser udviklet forskellige analyser til identifikation af posttranslationelle modifikationer (PTM'er) af CENP-A-protein og andre centromere-kinetochoreproteiner både in vivo og in vitro9,10,11. Svarende til PTM'er af histon proteiner, der er en vigtig mekanisme, der regulerer funktionen af kromatin, PTM'er af centromeric kromatin komponenter er også involveret i en væsentlig mekanisme til at regulere den overordnede struktur og funktion af centromeres. De fleste CENP-A PTM-anlæg er specifikke for CENP-A-holdige nukleosomer, selv om nogle få af dem er bevaret i histon H3, hvilket tyder på, at ændring af disse restkoncentrationer bidrager til den centromerespecifikke funktion. PTMs af CENP-A herunder fosforylering, acetylation, methylering, og allestedsnærværendelation blev tidligere rapporteret9, hvilket tyder på, at CENP-A er udsat for en række PTM'er og deres kombinatoriske arrays på sin amino endestation og C-terminus histone-fold domæne. Betydningen af CENP-A ændringer i flere funktioner blev afsløret af mange grupper, herunder vores. Disse funktioner omfatter CENP-A deposition på centromeres, protein stabilitet, og rekruttering af CCAN (konstituerende centromere-associerede netværk)9. Begrænsede undersøgelser og resultater af CENP-A-PTM'er er imidlertid præforme, hvor der foretages sammenligninger med en af kanoniske histoner, der direkte eller indirekte regulerer deres funktion. Tekniske rapporter med fokus på metoden til identifikation af disse CENP-A-PTM'er er også begrænsede.
Da CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere12, arvet gennem dimerization mellem celledeling5, og uundværlig for celle levedygtighed8, metoden til at identificere CENP-A allestedsnærværendelation ville være afgørende i fremtiden at studere den funktionelle aktivitet, positionering, og struktur af centromere. Derfor beskriver vi her massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at EYFP-mærkningen fremkalder allestedsnærværende allestedsnærværende i CENP-A K124R-mutantprotein8. Protokoller for andre kontrolanalyser og analyser (immunofluorescensanalyse, analyse af koloniudvækst og in vivo allestedsnærværendelationsanalyse) præsenteres også for at drøfte resultatet af en grundig massespektrometrianalyse korrekt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Undersøgelse af strukturen og dynamikken i kinetochores og centromeres er vigtigt at forstå kromosomal ustabilitet (CIN) og kræft progression. Hvordan kromosommal placering og funktion af en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og deltage i nøjagtig kromosom adskillelse er et grundlæggende spørgsmål. CENP-A foreslås at være ikke-DNA-indikator (epigenetisk mærke) af centromere identitet, og CENP-A allestedsnærværendelation er nødvendig for CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed.
Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværende allestedsnærværende EYFP-CENP-A K124R-mutant, hvilket tyder på, at allestedsnærværendelation ved en anden lysin induceres på grund af EYFP-mærkningen i CENP-A K124R-proteinet. Lysin 306 (K306) allestedsnærværendelation i EYFP-CENP-A K124R blev identificeret med succes, hvilket svarer til lysin 56 (K56) i CENP-A gennem massespektrometri analyse. En advarsel diskuteres i brugen af GFP / EYFP eller tagging af høj molekylvægt protein som et redskab til at analysere funktionen af et protein. Nuværende tekniske grænse er også drøftet for påvisning af allestedsnærværende bands, identifikation af sted-specifikke allestedsnærværendelation (r), og visualisering af allestedsnærværende i levende celler eller en bestemt enkelt celle i hele celle cyklus.
Metoden til massespektrometri analyse præsenteres her kan anvendes på humane CENP-A protein med forskellige tags og andre centromere-kinetochore proteiner. Disse kombinatoriske metoder, der består af flere analyser/ analyser, kan anbefales til forskere, der er interesseret i at identificere allestedsnærværende roller.

EYFP-CENP-A K124 mutant viser allestedsnærværendelation, interaktion med HJURP, og ingen fejl i centromere lokalisering hverken celle dødelighed. Her blev det system, der blev rapporteret af Fachinetti et al. (2017)6, genindsat: I diploid humane (RPE-1) celler, der bærer en afbrudt, og en 'floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), blev EYFP-CENP-A udtrykt fra den retrobe-EYFP-vektor. I dette system kan udtrykket af endogen CENP-A fra CENP-A-...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A allestedsnærværendelation er et vigtigt krav til CENP-A deposition på centromere, arvet gennem dimerization mellem celledeling, og uundværlig for celle levedygtighed. Her beskriver vi massespektrometrianalyse for at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-mærket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massespektrometri analyse til at identificere allestedsnærværendelation af EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Denne metode gør det muligt at identificere ubiquitylation af EYFP-mærket CENP-A protein. Det kan også anvendes på humant CENP-A protein med forskellige tests og andre proteiner. Den største fordel ved dette er, at det kan bruges til at identificere EYFP CENP-A K124R allestedsnærværende steder med afgørende biologisk betydning.Det kunne udvides til at undersøge de post-translationelle ændringer af en bred vifte af funktionelle proteiner. Begynd med at forberede protein A perler bundet med anti-GFP antistof. 25 mikroliter protein A-perler pr. immunudrekretationsreaktion med buffer A1 mindst tre gange for at fjerne ethanolen.Lav derefter en 50%perleløsning med buffer A1. Tilføj to mikroliter af anti-GFP antistof til perlerne. Tilføj derefter buffer A1 til 20 gange nettoperlens volumen. Udfør end-to-end rotation ved fire grader Celsius i fire til 18 timer.Den optimale varighed for rotationen skal bestemmes empirisk baseret på immunafcipationens effektivitet. Efter rotationen centrifugeres perlerne ved 100 gange g i et minut, og den ubundne supernatant fjernes. Tilføj buffer A1 for at lave en 50% opløsning af perler og brug 25 mikroliter af denne opløsning til hver immunoprecipationsreaktion.For at udføre immunoprecipitation, lyse celler i buffer A1 via sonikering og fryse / tø. Mål proteinkoncentrationerne og normaliser proteinmængderne blandt de forskellige IP-prøver. Fjern derefter 5% af prøven fra hvert rør til at køre i SDS side.Bland resten af lysatet med 25 mikroliter protein A perler bundet til anti-GFP antistof og udføre end-to-end rotation ved fire grader Celsius i fire til 18 timer. Efter at have lyst celler i buffer A og udført immunrecipitation som tidligere beskrevet skal der opbevares 10 % af de samlede immunoprecipitanter for at bekræfte EYFP CENP-A ubiquitylation og for præcist at bestemme placeringen af ubiquityleret EYFP CENP-A. Brug de øvrige 90% til massespektrometri analyse.Kør massespektrometriprøven i en kommercielt tilgængelig 4-12% Bis-Tris proteingel. Derefter udføre Coomassie blå farvning og punktafgifter 50-70 kilodalton gel region for massespektrometri analyse. Skær hver gel skive i små stykker og læg dem i en 0,5 milliliter lavt proteinbindende rør.Gelstykkerne vaskes med 100 mikroliter på 50%acetonitril i 25 millimolar ammoniumbikarbonat. Vortex dem i 10-15 minutter. Drej dem derefter ned og kassér supernatanten.Efter den sidste vask tørres gelstykkerne med en bænktopvakuumkoncentrator i 30 minutter. Tilsæt 10 mikroliter på 10 nanogram pr. mikrolitersekventeringsgrad trypsin, og lad gelstykkerne rehydrere i fem minutter. Derefter tilsættes 25 millimolar ammonium bikarbonat, lige nok til at dække gel stykker og fordøje dem på 37 grader Celsius natten over.Den næste dag, overføre fordøjet supernatant i en ren 0,65 milliliter silikone rør og tilsæt 50% acetonitril og 5% myresyre opløsning. Vortex prøven i 10 minutter. Drej den derefter ned og overfør supernatanten til et ekstraktionsrør.Prøven koncentreres igen til to mikroliter. Derefter tilsættes otte mikroliter af 3%acetonitrile og 2% myresyre opløsning. Vortex det i 15 minutter og drej det ned på 16,000 gange g i 30 minutter.Udfør ms-dataindsamling med LC-MS/MS ved hjælp af et flydende kromatografisystem kombineret med et massespektrometriinstrument. Injicer otte mikroliter af prøven i en omvendt fase flydende kromatografi kolonne og adskille peptider med en 2-80% gradient af opløsningsmiddel B i 60 minutter efter manuskript retninger. Indsaml massespektrometridata ved hjælp af den dataafhængige anskaffelsestilstand.Åbn den kommercielle software til at analysere massespektrometri data på skrivebordet. Hvis du vil starte en ny søgning, skal du klikke på LC-knappen i den øverste menu. Klik derefter på knappen Tilføj for at overføre de oprindelige RÅDNE DATAfiler fra MS.Vælg humant protein-id i paragonmetoden som databasesøgningsmetode, og søg i de oprindelige MS-rå datafiler i uniProt homo sapiens-databasen. Vælg trypsin som fordøjelsesenzymet, og indstil resten af parametrene i henhold til manuskriptretninger. Angiv resultatfilnavnet, og klik på knappen Gem som til højre i menuen.Vælg derefter en mappe til lagring af søgeresultaterne, og klik på knappen Gem. Klik på procesknappen for at starte søgningen. Når søgningen er afsluttet, gemmes data med det indtastede søgenavn automatisk i den valgte mappe.For at opnå MS / MS spektre af et bestemt peptid, skal du åbne søgeresultaterne i software F.Derefter skal du klikke på proteinet i proteinlisten i den øverste menu og klikke på peptidet i den midterste menu. MS/MS for dette peptid vises nederst i menuen. Hvis du vil eksportere og gemme MS/MS-spektre, skal du kopiere spektrene og indsætte det i et passende filformat.Genkonstruktioner af EYFP CENP-A vildtype eller K124R-mutant, som redder tabet af endogen CENP-A, blev kraftigt udtrykt, da retroviral integration blev udført. Udtrykket af endogene CENP-A blev ikke påvist syv dage efter induktion af Cre recombinase. Både EYFP CENP-A vildtype og K124R proteinudtryk viste sig at være på samme niveau som det oprindelige endogene CENP-A protein.Både EYFP CENP-A vildtype og K124R-mutanter viste centromere lokalisering syv dage efter afbrydelsen af det resterende udtryk for endogen CENP-A. EYFP CENP-A-vildtypen og K124R-mutanten viste allestedsnærværende og interaktion med HJURP i modsætning til tilfældet for mærket eller umærket CENP-A vild type og K124R-mutanten. Cellelevedygret blev vurderet ved at udføre koloniudvækstanalysen 14 dage efter afbrydelsen af den resterende endogene CENP-A-allel.Både EYFP CENP-A vildtype og K124R-mutanter viste et tilsvarende antal reddede kolonier 14 dage efter afbrydelsen af den resterende endogene CENP-A-allel. IP-massespektrometri afslørede ubiquitylation ved lysin 306 i EYFP CENP-A K124R i CENP-A minus F-celler. Alt i alt tydede disse resultater på, at fusion af protein i stor størrelse fremkalder ubiquitylation ved en anden lysin end K124R i CENP-A, hvilket hæmmer den oprindelige K124R enkelt mutant fænotype.Når du forsøger denne protokol, bruge kommercielt tilgængelige 4%12% Bis-Tris protein geler til at køre massespektrometri prøver. Tilsæt passende trypsin til gel stykker og rehydrere dem, indtil alle enzymer er blevet absorberet. Lavere molekylvægt tagging eller sondering teknik er faktisk forpligtet til at visualisere ubiquitylation og undersøge rumlige tidsmæssige protein ubiquitylation signalering på og hele organisme niveauer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amid brint / Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF-massespektrometri Analyse af Pak2 Aktivering

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Brug Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - Et kraftfuldt værktøj til at identificere nye C-di-GMP effektorproteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening at identificere Ubiquitin og ubiquitinlignende System Regulators Biologisk Pathways i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Berigelse af ekstracellulære matrixproteiner fra væv og fordøjelse til peptider for massespektrometri Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Anvendelser af Single-sonde: massespektrometri Imaging og Single Cell Analysis under omgivende betingelser

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...