Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Wij danken Chao-Jun Li van het Model Animal Research Center, Nanjing University voor de analyse van massaspectrometrie. Wij danken Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa, en de huidige onderzoekers van het Model Animal Research Center, Nanjing University en Greehey Children's Cancer Research Institute voor hun nuttige discussie, experimentele begeleiding en reagentia. Wij danken Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago en Dawn S. Chandler voor hun gulle giften van reagentia. Y.N. werd ondersteund door de provincie Jiangsu ''Double-First-Class'' Bouwfonds, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu Province 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) en National Natural Science Foundation in China (31970665). Deze studie werd mede ondersteund door NCI grant R21 CA205659.

1. Celcultuur en retrovirustransfectie van pBabe-EYFP-CENP-A constructies
OPMERKING: EYFP-CENP-A wordt uitgedrukt uit pBabe-EYFP-CENP-A op een vergelijkbaar eiwitniveau als endogene CENP-A. Totaal cellulair CENP-A eiwit wordt vervangen door dit EYFP-CENP-A na de verstoring van het CENP-A-/F allel door Cre recombinase zoals in RPE-1 CENP-A-/- cellen6.
<ol><li>Bereiding van het supernatant dat retrovirus bevat met behulp van 293T verpakkingscellen.<ol>
<li>Da...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Hier beschreven we methoden van massaspectrometrie analyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren suggereert dat de EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit8. In onze resultaten hebben we met succes alomtegenwoordigheid geïdentificeerd op lysine 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, die overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrieanalyse. De hier beschreven massaspectrometrieanalyse ...

In de meeste eukaryoten moeten spindelmicrotubuli zich hechten aan één enkel gebied van elk chromosoom, centromere genoemd. De kinetochore is een complex van eiwitten die zich op de centromere bevinden. Het bestuderen van de timing van centromere en kinetochore eiwit bewegingen en de structuur van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosoom instabiliteit (CIN) en kanker progressie. De belangrijkste vragen zijn hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en hoe ze deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie. In de meeste soorten, de aanwezigheid van een speciaal nucleosoom met een specifieke histone-achtige eiwit genaamd CENP-A definieert de centromere identiteit. Daarom wordt voorgesteld dat CENP-A de niet-DNA-indicator (epigenetisch merk) van centromere identiteit is. Het is belangrijk om het mechanisme op te helderen van hoe CENP-A de centromere identiteit bij mensen definieert.
De Holliday junction recognition protein (HJURP) is de CENP-A-specifieke chaperon die CENP-A in centromerische nucleosomen1,2,3deponeert . We have previously reported that the CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase is required for CENP-A ubiquitylation on lysine 124 (K124) and centromere localization4. Ook onze resultaten toonden aan dat de centromere werving van nieuw gesynthetiseerde CENP-A vereist reeds bestaande ubiquitylated CENP-A5. Thus, a model was provided suggesting that CENP-A ubiquitylation is inherited through dimerization between cell divisions.
In tegenstelling tot onze bevindingen en die van Yu et al., werden de negatieve resultaten betreffende CENP-A en zijn centromeric lokalisatie onlangs gepubliceerd6. Het artikel beweerde dat CENP-A wijzigingen op lysine 124 (K124) zijn onmisbaar voor de oprichting, onderhoud, en de functie op lange termijn van de menselijke centromeres, op basis van hun negatieve resultaten waaruit blijkt dat de mutatie van K124R niet van invloed CENP-A centromere lokalisatie noch cel levensvatbaarheid6. Er is echter voldoende ruimte voor discussie in hun resultaten en conclusies, en we hebben al beschreven welk probleem er zou kunnen zijn in hun vorige publicatie7. Er moet op worden gelet dat ze eiwitten hebben versmolten met CENP-A, die veel grotere moleculaire gewichten hebben dan de grootte van endogene CENP-A: bijvoorbeeld, ze gesmolten ~ 30 kDa verbeterde gele fluorescente eiwitten (EYFP) tot ~ 16 kDa CENP-A en analyseerde EYFP-CENP-A K124R fusie eiwit in hun RPE-1 CENP-A-/F knock-out systeem. K124 ubiquitine zal naar verwachting niet rechtstreeks binden aan HJURP op basis van structurele voorspellingen4,maar de toevoeging van mono-ubiquitine zal naar verwachting een impact hebben op de eiwitcontenschap van CENP-A. Het eiwit van CENP-A-conformatie kan worden veranderd door de aanwezigheid van een groot fusie-eiwit, en deze conformatieverandering kan de structurele veranderingen maskeren die worden veroorzaakt door het verlies van alomtegenwoordigheid. Wij stellen voor dat de fusie van groot-en klein-grote eiwit alome alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine dan K124 in EYFP-CENP-A K124R mutant en deze alomtegenwoordigheid op een andere plaats remt / maskeert de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype. Bewijs dat alomtegenwoordigheid optreedt bij verschillende lysine in de CENP-A K124R mutant eiwit met een large tag eiwit (EYFP) werd gemeld in onze vorige publicatie8. Er werd vastgesteld dat EYFP tagging alomtegenwoordigheid induceert van een andere lysinesite van EYFP-CENP-A K124R en dat EYFP-CENP-A K124R mutant bindt aan HJURP. Als gevolg hiervan remt/maskeert deze alomtegenwoordigheid op een andere locatie het oorspronkelijke K124R enkel mutantene fenotype, en zowel EYFP-CENP-A WT als K124R mutanten vertoonden centromere lokalisatie (we gebruikten en vergeleken pBabe-EYFP-CENP-A WT en K124R mutant, samen met pBabe-EYFP control.). The results demonstrated that Flag-tagged or untagged CENP-A K124R mutants are lethal but can be rescued by a monoubiquitin fusion, suggesting that CENP-A ubiquitylation is indispensable to cell viability.
In de afgelopen jaren hebben veel studies verschillende tests ontwikkeld om posttranslationele modificaties (PTMs) van CENP-A-eiwit en andere centromere-kinetochore-eiwitten te identificeren, zowel in vivo als in vitro9,10,11. Analoog aan de PTMs van histoneiwitten die een belangrijk mechanisme zijn dat de functie van chromatine regelt, zijn PTMs van centromerische chromatinecomponenten ook betrokken bij een essentieel mechanisme om de algehele structuur en functie van centromeres te reguleren. De meeste CENP-A PTM-sites zijn specifiek voor CENP-A-bevattende nucleosomen, hoewel een paar daarvan in histone H3 worden bewaard, wat suggereert dat wijziging van deze residuen bijdraagt aan de centromere-specifieke functie. PTMs van CENP-A met inbegrip van fosforylatie, acetylatie, methylatie, en alomtegenwoordigheid werden eerder gemeld9, wat suggereert dat CENP-A wordt onderworpen aan een verscheidenheid van PTM's en hun combinatorische arrays op zijn amino terminus en C-terminus histone-fold domein. Het belang van CENP-A wijzigingen in meerdere functies werd onthuld door vele groepen, waaronder de onze. Deze functies omvatten CENP-A depositie bij centromeres, eiwitstabiliteit en rekrutering van het CCAN (constitutief centromere-geassocieerd netwerk)9. Beperkte studies en bevindingen van CENP-A PTM's zijn echter voorgevormd wanneer vergelijkingen worden gemaakt met een van canonieke histonen die hun functie direct of indirect reguleren. Technische rapporten die zich richten op de methodologie om deze CENP-A PTMs te identificeren zijn ook beperkt.
Because CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere12, inherited through dimerization between cell division5, and indispensable to cell viability8, the method to identify CENP-A ubiquitylation would be essential in future to study the functional activity, positioning, and structure of the centromere. Daarom beschrijven we hier massaspectrometrie-analyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R-mutant te identificeren, wat suggereert dat de EYFP-tagging alomtegenwoordigheid induceert bij een andere lysine in het CENP-A K124R gemuteerde eiwit8. Protocollen van andere controletesten en analyses (immunofluorescentieanalyse, kolonieuitgroeitest en in vivo alomtegenwoordigheidstest) worden ook gepresenteerd om de uitkomst van een grote massaspectrometrieanalyse goed te bespreken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Het bestuderen van de structuur en de dynamiek van kinetochores en centromeres is belangrijk voor het begrijpen van chromosomale instabiliteit (CIN) en kankerprogressie. Hoe de chromosomale locatie en functie van een centromere (d.w.z. centromere identiteit) worden bepaald en deelnemen aan nauwkeurige chromosoomsegregatie is een fundamentele vraag. CENP-A is proposed to be the non-DNA indicator (epigenetic mark) of centromere identity, and CENP-A ubiquitylation is required for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability.
Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om de alomtegenwoordigheid van EYFP-CENP-A K124R mutant te identificeren, wat suggereert dat alomtegenwoordigheid bij een andere lysine wordt veroorzaakt door de EYFP-tagging in het CENP-A K124R gemuteerd eiwit. Lysine 306 (K306) alomtegenwoordigheid in EYFP-CENP-A K124R werd met succes geïdentificeerd, wat overeenkomt met lysine 56 (K56) in CENP-A door middel van massaspectrometrie analyse. Een voorbehoud wordt besproken in het gebruik van GFP /EYFP of het taggen van eiwit met een hoog moleculair gewicht als hulpmiddel om de functie van een eiwit te analyseren. Huidige technische limiet wordt ook besproken voor de detectie van alomquitylated banden, identificatie van site-specifieke alomtegenwoordigheid(en), en visualisatie van alomtegenwoordigheid in levende cellen of een specifieke eencellige cel tijdens de hele celcyclus.
De methode van massaspectrometrie analyse hier gepresenteerd kan worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tags en andere centromere-kinetochore eiwitten. Deze combinatorische methoden bestaande uit verschillende tests / analyses kunnen worden aanbevolen voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in het identificeren van functionele rollen van alomtegenwoordigheid.

EYFP-CENP-A K124 mutant toont alomtegenwoordigheid, interactie met HJURP, en geen gebreken in centromere lokalisatie noch cel letaliteit. Hier werd het door Fachinetti et al. (2017)6 gemelde systeem opnieuw gevormd: in diploïde menselijke (RPE-1) cellen die er een droegen verstoord en één ''floxed'' CENP-A allel (CENP-A-/F), werd EYFP-CENP-A uitgedrukt uit de pBabe-EYFP retrovirusvector. In dit systeem kan de expressie van endogene CENP-A uit het <e...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation is an important requirement for CENP-A deposition at the centromere, inherited through dimerization between cell division, and indispensable to cell viability. Hier beschrijven we massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) eiwit te identificeren.

Massaspectrometrieanalyse om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A) te identificeren

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Deze methode maakt het mogelijk om alomtegenwoordigheid van EYFP-tagged CENP-A eiwit te identificeren. Het kan ook worden toegepast op menselijke CENP-A eiwit met verschillende tests en andere eiwitten. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat het kan worden gebruikt om EYFP CENP-A K124R alomtegenwoordige sites met een cruciale biologische betekenis te identificeren.Het zou kunnen worden uitgebreid om de post-translationele wijzigingen van een breed scala aan functionele eiwitten te onderzoeken. Begin met het bereiden van eiwit Een kralen gebonden met anti-GFP antilichaam. Was 25 microliter eiwit Een kralen per immunoprecipitatiereactie met buffer A1 ten minste drie keer om de ethanol te verwijderen.Maak dan een 50% kraal oplossing met buffer A1. Voeg twee microliter anti-GFP antilichaam toe aan de kralen. Voeg vervolgens buffer A1 toe tot 20 keer het netto kraalvolume. Voer end-to-end rotatie uit bij vier graden Celsius gedurende vier tot 18 uur.De optimale duur van de rotatie moet empirisch worden bepaald op basis van de efficiëntie van de immunoprecipitatie. Na de rotatie, centrifugeren de kralen op 100 keer g gedurende een minuut en verwijder de niet-gebonden supernatant. Voeg buffer A1 toe om een 50%-oplossing van kralen te maken en gebruik 25 microliter van deze oplossing voor elke immunoprecipitatiereactie.Om de immunoprecipitatie uit te voeren, lyse cellen in buffer A1 via sonicatie en vries/dooi. Meet eiwitconcentraties en normaliseer de eiwithoeveelheden tussen de verschillende IP-monsters. Verwijder vervolgens 5% van het monster uit elke buis om op de SDS-pagina uit te voeren.Meng de rest van het lysaat met 25 microliter eiwit Een kralen gebonden aan anti-GFP-antilichaam en voer end-to-end rotatie uit bij vier graden Celsius gedurende vier tot 18 uur. Na het lysing van cellen in buffer A en het uitvoeren van immunoprecipitatie zoals eerder beschreven, houdt u 10% van de totale immunoprecipitanten om EYFP CENP-A-a.-100 te hebben uitgevoerd en de positie van de eerder beschreven EYFP CENP-A nauwkeurig te bepalen. Gebruik de andere 90%voor massaspectrometrie analyse.Voer het massaspectrometriemonster uit in een commercieel verkrijgbaar 4-12%Bis-Tris eiwitgel. Voer vervolgens Coomassie blauwe vlekken en accijns de 50-70 kilodalton gel regio voor massa spectrometrie analyse. Snijd elke gel in kleine stukjes en leg ze in een 0,5 milliliter laag eiwitarme bindingsbuis.Was de gelstukken met 100 microliter van 50%acetonitril in 25 millimolar ammoniumbicarbonaat. Vortex ze voor 10-15 minuten. Draai ze dan naar beneden en gooi de supernatant weg.Na de laatste wasbeurt, droog de gel stukken met een bank top vacuüm concentrator voor 30 minuten. Voeg 10 microliter van 10 nanogram per microliter sequencing grade trypsine toe en laat de gelstukken vijf minuten hydrateren. Voeg vervolgens 25 millimolar ammoniumbicarbonaat toe, net genoeg om de gelstukken te bedekken en ze 's nachts te verteren bij 37 graden Celsius.Breng de verteerde supernatant op de volgende dag over in een schone siliconen buis van 0,65 milliliter en voeg 50%acetonitril en 5%mierenzuuroplossing toe. Vortex het monster gedurende 10 minuten. Draai het dan naar beneden en breng de supernatant in een extractiebuis.Concentreer het monster opnieuw op twee microliters. Voeg vervolgens acht microliters van 3%acetonitril en 2%mierenzuuroplossing toe. Vortex gedurende 15 minuten en draai het naar beneden op 16.000 keer g gedurende 30 minuten.Ms-gegevensverwerving uitvoeren met LC-MS/MS met behulp van een vloeibaar chromatografiesysteem in combinatie met een massaspectrometrie-instrument. Injecteer acht microliter van het monster in een omgekeerde fase vloeibare chromatografiekolom en scheid de peptiden met een 2-80% gradiënt van oplosmiddel B in 60 minuten na manuscriptaanwijzingen. Verzamel massaspectrometriegegevens met behulp van de gegevensafhankelijke acquisitiemodus.Open de commerciële software om massaspectrometriegegevens op het bureaublad te analyseren. Als u een nieuwe zoekopdracht wilt starten, klikt u op de KNOP LC in het bovenste menu. Klik vervolgens op de knop Toevoegen om de oorspronkelijke MS-onbewerkte gegevensbestanden te uploaden.Selecteer human protein ID in de paragon methode als de database zoekmethode en zoek de originele MS raw data bestanden tegen de UniProt homo sapiens database. Selecteer trypsine als spijsverteringsenzym en stel de rest van de parameters in op basis van de routebeschrijving van het manuscript. Voer de bestandsnaam resultaten in en klik op de knop Opslaan als rechts van het menu.Selecteer vervolgens een map voor het opslaan van de zoekresultaten en klik op de knop Opslaan. Klik op de procesknop om de zoekopdracht te starten. Nadat de zoekopdracht is beëindigd, worden gegevens met de ingevoerde zoeknaam automatisch opgeslagen in de geselecteerde map.Om MS/MS spectra van een specifiek peptide te verkrijgen, opent u de zoekresultaten in software F.Klik vervolgens op het eiwit in de eiwitlijst in het bovenste menu en klik op het peptide in het middelste menu. De MS/MS van dit peptide verschijnt onderaan het menu. Als u de MS/MS-spectra wilt exporteren en opslaan, kopieert u de spectra en plakt u deze naar een geschikte bestandsindeling.Genconstructies van EYFP CENP-A wild type of K124R mutant die het verlies van endogene CENP-A redt werden stabiel uitgedrukt toen retrovirale integratie werd uitgevoerd. De expressie van endogene CENP-A werd niet gedetecteerd zeven dagen na de inductie van Cre recombinase. Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R eiwit expressie bleek te zijn op een vergelijkbaar niveau als de eerste endogene CENP-A eiwit.Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R mutanten toonden centromere lokalisatie op zeven dagen na de verstoring van de resterende expressie van endogene CENP-A. De EYFP CENP-A wild type en de K124R mutant toonde alomtegenwoordigheid en interactie met HJURP in tegenstelling tot het geval voor gemarkeerde gelabelde of niet-gelabelde CENP-A wild type en de K124R mutant. De levensvatbaarheid van de cel werd beoordeeld door de uitgroeitest van de kolonie 14 dagen na de verstoring van het resterende endogene CENP-A-allel uit te voeren.Zowel EYFP CENP-A wild type en K124R mutanten toonde een vergelijkbaar aantal geredde kolonies 14 dagen na de verstoring van de resterende endogene CENP-A allel. IP massaspectrometrie bleek alomtegenwoordigheid bij lysine 306 in EYFP CENP-A K124R in CENP-A minus F cellen. Alles bij elkaar, deze resultaten suggereerden dat de fusie van grote grootte eiwit induceert alomtegenwoordigheid op een andere lysine dan K124R in CENP-A die de oorspronkelijke K124R single mutant fenotype remt.Wanneer u dit protocol probeert, gebruikt u de commercieel beschikbare 4%12%Bis-Tris eiwitgels om de massaspectrometriemonsters uit te voeren. Voeg voldoende trypsine aan de gel stukken en hydrateren totdat alle enzymen zijn geabsorbeerd. Lager moleculair gewicht tagging of indringende techniek is eigenlijk nodig om alomtegenwoordigheid te visualiseren en te onderzoeken ruimtelijke temporele eiwit alomtegenwoordigheid signalering op de en hele organisme niveaus.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Monstervoorbereiding: de Ultra Thin Layer methode

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Het analyseren van grote eiwitcomplexen de Structuurfondsen massaspectrometrie

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-wave Ion Mobility-massaspectrometrie: Basic Experimentele Procedures voor Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Directe analyse van enkele cellen met behulp van massaspectrometrie bij atmosferische druk

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide waterstof / deuterium Exchange en MALDI-TOF-massaspectrometrie Analyse van de Pak2 Activering

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering Thiol Redox Proteome Met behulp van Isotope Tagging massaspectrometrie

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound Massaspectrometrie - een krachtig hulpmiddel om het identificeren van nieuwe c-di-GMP effectoreiwitten

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening naar Ubiquitin en Ubiquitin-achtig systeem regulatoren van biologische pathways identificeren in gekweekte zoogdiercellen

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Verrijking van extracellulaire matrix eiwitten uit weefsels en de spijsvertering in peptiden voor massaspectrometrie Analyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Toepassingen van de single-probe: massaspectrometrie Imaging en Single Cell Analysis onder omgevingsomstandigheden

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...