Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

אנו מודים לצ-ג'ון לי במרכז לחקר בעלי חיים במודל, באוניברסיטת נאנג'ינג לניתוח ספקטרומטר המסה. אנו מודים ליאנמיני דלאל, טאסואו פאקאגאווה, והחוקרים הנוכחיים במרכז לחקר בעלי חיים במודל, אוניברסיטת נאנג'ינג ומכון המחקר לחקר הסרטן של הילדים למען הדיון המועיל שלהם, הדרכה ניסויית וריאגנטים. אנו מודים לדון ולקליבלנד, דנילה פצ'נטי, יאנמיני דלאל, מין ובאר, גוסטבו ולאונה, ג'ון תומפסון, לורנס ס. קירשנר, אמרוטה אשקאר, בן א. שחור, גלניס א. לוגסדון, קנג'י טאגו, ודון ס. צ'נדלר על המתנות הנדיבות שלהם של ריאגנטים. Y.N. היה נתמך על ידי מחוז ג'יאנגסו ' ' כפול ממדרגה ראשונה ' ' קרן בנייה, ג'יאנגסו מחוז המדע הטבעי קרן (SBK2019021248), מחוז ג'יאנגסו 16th שישה כישרון גדול פסגות 31970665 הקרן (TD-swyy-001), מחוז ג'יאנגסו "מומחה זר 100 כשרונות תוכנית" קרן (SBK2019010048), ו הלאומית למדעי הטבע ה מחקר זה היה נתמך באופן חלקי NCI גרנט R21 CA205659.

1. תרבית תאים ורטרווירוס של pBabe-EYFP-CENP-מבנים
הערה: EYFP-CENP-A מתבטא pBabe-EYFP-CENP-A ברמת חלבון דומה כדי אנדוסוגני CENP-A. סך הכל הסלולר cenp-חלבון מוחלף זה eyfp-cenp-a לאחר שיבוש של cenp-a-/f אלל על ידי recombinase כמו ב rpe-1 cenp-a-/-תאים6.
<ol><li>הכנת הסופרנטנט המכיל רטרווירוס באמצעות תאי אריזה 2...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

כאן תיארנו שיטות של ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. בתוצאות שלנו, זיהינו בהצלחה אוביקווילציה על ליזין 306 (K306) ב-EYFP-CENP-K124R, המתאים ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר ה...

ברוב eukaryotes, מיקרוטובוקלס ציר חייב לצרף לאזור אחד של כל כרומוזום, כינה ריכוז. קינטוכור הוא קומפלקס של חלבונים הנמצאים במרכז הריכוז. לימוד העיתוי של התנועה של מרכז ומעטפת החלבון והמבנה של קינטומאז חשוב להבנת אי-יציבות כרומוזום (CIN) והתקדמות הסרטן. השאלות העיקריות הן כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, הזהות הצנטורלית) נקבעים וכיצד הם משתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום. ברוב המינים, הנוכחות של נוקלאוטיס מיוחד המכיל חלבון דומה histone הנקרא מגדיר את הזהות צנטרומר. לכן, מוצע כי CENP-A הוא מחוון שאינו DNA (סימן אפיגנטי) של הזהות צנטרומר. חשוב להבהיר את המנגנון של האופן שבו CENP-A מגדיר את הזהות הצנטרומר בבני אדם.
זיהוי של צומת הולידיי-היומי חלבון (hjurp) הוא המלווה cenp-a-מיוחד שעליו הפיקדונות cenp-a ב מרכז הריכוז של היום1,2,3. אנו דיווחו בעבר כי CUL4A-RBX1-COPS8 E3 לליגאז נדרש עבור cenp-A אובילציה על ליזין 124 (K124) ו צנטוררה לוקליזציה4. כמו כן, התוצאות שלנו הראו כי הגיוס צנטרומר של החדש מסונתז CENP-A דורש מראש הקיים אוביp-A5. לפיכך, מודל נמסר רומז כי CENP-A אובילציה עוברת בירושה דרך דימריזציה בין חטיבות התאים.
בניגוד לממצאים שלנו ולאלה של יו ואח ', התוצאות השליליות בנוגע ל-CENP-A והלוקליזציה הצנטגוניות שלה פורסמו לאחרונה6. המאמר טען כי CENP-A שינויים על ליזין 124 (K124) הם לוותר על הקמתה, תחזוקה, ותפקוד לטווח ארוך של מרכז האדם, מבוסס על התוצאות השליליות שלהם מראה כי מוטציה של K124R לא להשפיע על CENP-A צנטורייר לוקליזציה לא תאים6. עם זאת, יש מספיק מקום לדיון בתוצאות ובמסקנות שלהם, וכבר תיארנו איזו בעיה יכולה להיות בפרסום הקודם שלהם7. יש לשלם שימו לב כי הם התמזגו חלבונים עם CENP-A, שיש להם הרבה משקולות מולקולריות יותר מאשר בגודל של האנדוגניים CENP-A: למשל, הם התמזגו ~ 30 kDa חלבון פלורסנט משופרת (EYFP) כדי ~ 16 kDa CENP-A וניתח EYFP-CENP-K124R היתוך חלבון במערכת RPE-1 CENP-A-/F מערכת. K124 אוביקוויב לא צפוי לאגד ישירות HJURP מבוסס על תחזיות מבנית4, עם זאת, תוספת של מונו-אוביקוויב הוא ניבא יש השפעה על היווצרות חלבון של Cenp-A. החלבון של CENP-A קונפורמציה יכול להיות שונה על ידי נוכחות של חלבון פיוז'ן גדול, ושינוי זה התאמות עשוי להסוות את השינויים מבניים שנגרמו על ידי אובדן אוביפורמציה. אנו מציעים כי המיזוג של חלבון בגודל גדול גורם אוביקווילציה על ליזין אחר מאשר K124 ב-EYFP-CENP-A K124R מוטציה ואת זה אוביקווילציה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R המוטציה פנוטיפים. ראיות כי אובילציה מתרחשת על ליזין שונים ב-CENP-A K124R חלבון מוטציה עם חלבון תג גדול (EYFP) דווחה בפרסום הקודם שלנו8. נמצא כי התיוג EYFP גורמת אוביקווינציה של אתר ליזין אחר של EYFP-CENP-A K124R וכי EYFP-CENP-K124R מוטציה נקשר HJURP. כתוצאה מכך, אובילציה זה באתר אחר מעכב/מסכות המקורי K124R יחיד מוטציה פנוטיפ, ושניהם EYFP-CENP-מוטציות K124R הראו צנטרומר לוקליזציה (השתמשנו והשוו pBabe-EYFP-CENP-A WT ו K124R מוטציה, יחד עם בקרת pBabe-EYFP.). התוצאות הראו כי דגל-מתויג או לא מתויגים CENP-A K124R מוטציות קטלניות אבל ניתן להציל על ידי פיוז ' ן monoubi, מציע כי CENP-A אובילציה היא הכרחית לכדאיות התא.
בשנים האחרונות, מחקרים רבים פיתחו בחני שונים לזהות שינויים פוסטטרנסלוניים (לפטין) של cenp-חלבון ואחרים מרכז-החלבונים קיטומודים, הן בvivo והן במבחנה9,10,11. מקביל לפטין של חלבונים היסטון, כי הם מנגנון מרכזי המסדיר את הפונקציה של כרומטין, לפטין של רכיבים מרוכזת של כרוממיה מעורבים גם במנגנון חיוני כדי לווסת את המבנה הכולל ואת התפקוד של צנטרומרים. רוב האתרים של cenp-a ptm הם ספציפיים ל-cenp-a המכיל נוקלאוטיזומים, למרות כמה מהם נשמרים ב היסטון H3, מציע כי שינוי של שאריות אלה תורמים לפונקציה הספציפית צנטרומר. בשנת הבית, מתילציה, מתיונין, ואוביזלציה דווחו בעבר9, מציע כי cenp-A נתון למגוון מגוון של מערכי הקומבינטורית ומערכים שלהם על הטרמינוס האמינית והתחום הקיפול C-טרמינוס. חשיבותו של CENP-A שינויים בפונקציות מרובות נחשף על ידי קבוצות רבות כולל שלנו. פונקציות אלה כרוכות בתצהיר של CENP-A בריכוז, יציבות חלבונים, וגיוס של CCAN (הרשת המשויכת למרכז)9. עם זאת, מחקרים מוגבלים וממצאים של CENP-A השני מראש היכן ההשוואות נעשים עם אחד האבנים קאנוני כי ישירות או עקיף להסדיר את תפקידם. דוחות טכניים התמקדות במתודולוגיה כדי לזהות אלה CENP-A לפטין מוגבלים גם.
בגלל CENP-A אוביקווילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר12, ירש דרך dimerization בין חלוקת התא5, והכרחית לכדאיות התאים8, השיטה לזהות cenp-A אובילציה יהיה חיוני בעתיד כדי ללמוד את הפעילות הפונקציונלית, מיצוב, ומבנה של צנטרומר. לכן, כאן אנו מתארים בניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אוביקווילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי התיוג EYFP שגורם אוביקווילציה על ליזין שונים ב-CENP-A K124R מוטציה חלבון8. פרוטוקולים של בקרת שליטה אחרים וניתוחים (ניתוח אימונוoforסנס, המושבה התרחבות הגידול, ו בvivo אוביקווילציה) מוצגים גם כדי לדון את התוצאה של ניתוח המסה הגדולה ספקטרומטריה כראוי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

לימוד המבנה והדינמיקה של קינטומטלות וצנטורמרים חשובים בהבנת אי יציבות כרומוזומלית (CIN) והתקדמות הסרטן. כיצד המיקום הכרומוזומים ותפקודו של מרכז הריכוז (כלומר, זהות צנטוררה) נקבעים ומשתתפים בהפרדה מדויקת של כרומוזום היא שאלה יסודית. CENP-A מוצע להיות אינדיקטור non-DNA (מארק אפיגנטי) של זהות מרוכזת, ו-CENP-A אובידילציה נדרש עבור CENP-A התצהיר על צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, הכרחי הכדאיות התא.
כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-CENP-A K124R מוטציה רומז כי אובילילציה ב ליזין שונים נגרמת בגלל תיוג EYFP ב-K124R מוטציה חלבון CENP. ליזין 306 (K306) אוביזלציה ב-EYFP-K124R התגלתה בהצלחה, המתאימה ליזין 56 (K56) ב-CENP-A באמצעות ניתוח ספקטרומטר המסה. אזהרה נדונה בשימוש GFP/EYFP או תיוג של חלבון משקל מולקולרי גבוה ככלי לנתח את הפונקציה של חלבון. המגבלה הטכנית הנוכחית נדונה גם לאיתור להקות אוביקווילבטים, זיהוי אוביקווילציה ספציפיים לאתר, ויזואליזציה של אובידלציה בתאים חיים או תא יחיד מסוים במהלך מחזור התא כולו.
השיטה של ניתוח ספקטרומטר המסה המוצג כאן ניתן להחיל על האנושי CENP-חלבון עם תגים שונים ושאר מרכז החלבונים-הקיטוכורה. ניתן להמליץ על שיטות שונות הכוללות מספר בדיקות/ניתוח שנועדו לחוקרים המעוניינים לזהות תפקידים פונקציונליים של אובילציה.

Eyfp-CENP-מוטציה K124 מראה אוביקווילציה, אינטראקציה עם HJURP, ואין פגמים בלוקליזציה של מרכז התקשורת לא תאים. כאן המערכת דיווחה על ידי fachinetti ואח '. (2017)6 היה re-היווה: ב דיפלואידי אנושי (rpe-1) תאים נושא אחד שיבשו ואחד ' ' מכוסל ' ' cenp-a אלל (cenp-a-/f), eyfp-cenp-a היה ביטא את וקטור pba...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-מהווה מהווה דרישה חשובה עבור CENP-A התצהיר ב צנטרומר, ירש דרך dimerization בין החטיבה התא, והכרחי לקיום תאים. כאן אנו מתארים ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות אובילילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A) חלבון.

ניתוח ספקטרומטר המסה כדי לזהות את אוביקווילציה של EYFP-מתויג CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

שיטה זו מאפשרת לזהות בכל מקום חלבון CENP-A המתויג ב-EYFP. זה יכול להיות מיושם גם על חלבון CENP-A אנושי עם בדיקות שונות וחלבונים אחרים. היתרון העיקרי של זה הוא שניתן להשתמש בו כדי לזהות אתרים EYFP CENP-A K124R בכל מקום עם משמעות ביולוגית מכרעת.זה יכול להיות מורחב כדי לחקור את השינויים שלאחר התרגום של מגוון רחב של חלבונים פונקציונליים. התחל בהכנת חלבון חרוזים הקשורים בנוגדנים נגד GFP. לשטוף 25 microliters של חלבון חרוזים לכל תגובת immunoprecipitation עם חיץ A1 לפחות שלוש פעמים כדי להסיר את האתנול.לאחר מכן הפוך פתרון 50%חרוז עם מאגר A1. הוסיפו שני מיקרוליטרים של נוגדנים נגד GFP לחדדים. לאחר מכן הוסף מאגר A1 עד פי 20 מאמצעי האחסון של חרוז הרשת. בצע סיבוב מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות.משך הזמן האופטימלי לסיבוב חייב להיקבע באופן אמפירי בהתבסס על יעילות האימונופרציפציה. לאחר הסיבוב, צנטריפוגה את חרוזים ב 100 פעמים g במשך דקה אחת ולהסיר את על טבעי מאוגד. הוסף מאגר A1 כדי ליצור פתרון של 50% של חרוזים ולהשתמש ב- 25 מיקרוליטרים של פתרון זה עבור כל תגובת immunoprecipitation.כדי לבצע את immunoprecipitation, lyse תאים במאגר A1 באמצעות sonication והקפאה / הפשרה. למדוד ריכוזי חלבון ולנרמל את כמויות החלבון בין דגימות IP שונות. לאחר מכן הסר 5% מהדגימה מכל צינור כדי לפעול בדף SDS.מערבבים את שאר ליזט עם 25 microliters של חלבון חרוזים הקשורים נוגדן נגד GFP ולבצע סיבוב מקצה לקצה בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע עד 18 שעות. לאחר lysing תאים במאגר A וביצוע immunoprecipitation כפי שתואר קודם לכן, לשמור 10% של immunoprecipitants הכולל כדי לאשר EYFP CENP-A בכל מקום כדי לקבוע במדויק את המיקום של EYFP בכל מקום CENP-A. השתמש ב- 90% האחרים לניתוח ספקטרומטריית מסה.הפעל את דגימת ספקטרומטריית המסה בג'ל חלבון 4-12% זמין מסחרית. לאחר מכן בצע כתמים כחולים קומאסיים ובלו את אזור ג'ל 50-70 קילודלטון לניתוח ספקטרומטריית מסה. קוביות כל פרוסת ג'ל לחתיכות קטנות ומ מניחים אותם בצינור חלבון נמוך 0.5 מיליליטר.לשטוף את חתיכות ג'ל עם 100 microliters של 50% אצטוניטריל ב 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט. מערבולת אותם במשך 10-15 דקות. ואז לסובב אותם למטה ולהשליך את העל-טבעי.לאחר הכביסה האחרונה, לייבש את חתיכות ג'ל עם ספסל העליון ואקום concentrator במשך 30 דקות. הוסף 10 microliters של 10 ננוגרם לכל רצף microliter כיתה טריפסין ולתת חתיכות ג'ל rehydrate במשך חמש דקות. לאחר מכן מוסיפים 25 מילימולר אמוניום ביקרבונט, בדיוק מספיק כדי לכסות את חתיכות ג'ל ולעכל אותם ב 37 מעלות צלזיוס לילה.למחרת, להעביר את העל-טבעי מתעכל לתוך צינור סיליקון 0.65 מיליליטר נקי ולהוסיף 50% אצטוניטריל ו 5% חומצה פורמית פתרון. וורטקס הדגימה במשך 10 דקות. ואז לסובב אותו ולהעביר את העל-טבעי לתוך צינור חילוץ.רכז את הדגימה שוב לשני מיקרוליטרים. לאחר מכן הוסיפו שמונה מיקרוליטרים של 3%אצטוניטריל ו-2% תותב חומצה פורמית. Vortex זה במשך 15 דקות ולסובב אותו למטה ב 16, 000 פעמים g במשך 30 דקות.בצע רכישת נתוני MS עם LC-MS/MS באמצעות מערכת כרומטוגרפיה נוזלית יחד עם מכשיר ספקטרומטריית מסה. הזרק שמונה מיקרוליטרים של המדגם לעמוד כרומטוגרפיה נוזלית בשלב הפוך והפרד את הפפטידים עם שיפוע של 2-80% של ממס B תוך 60 דקות בעקבות הוראות כתב היד. אסוף נתוני ספקטרומטריית מסה באמצעות מצב רכישה תלוי נתונים.פתח את התוכנה המסחרית כדי לנתח נתוני ספקטרומטריית מסה בשולחן העבודה. כדי להתחיל חיפוש חדש, לחץ על לחצן LC בתפריט העליון. לאחר מכן לחץ על לחצן הוספה כדי להעלות את קבצי הנתונים הגולמיים המקוריים של MS.בחר מזהה חלבון אנושי בשיטת הפרגון כשיטת החיפוש במסד הנתונים וחפש בקבצי הנתונים הגולמיים המקוריים של MS מול מסד הנתונים של UniProt homo sapiens. בחר טריפסין כאנזים העיכול והגדר את שאר הפרמטרים לפי הוראות כתב היד. הזינו את שם קובץ התוצאות ולחצו על הלחצן 'שמור בשם' מימין לתפריט.לאחר מכן בחר תיקיה לאחסון תוצאות החיפוש ולחץ על לחצן השמירה. לחץ על לחצן התהליך כדי להתחיל את החיפוש. לאחר סיום החיפוש, נתונים עם שם החיפוש שהוזן יאוחסנו באופן אוטומטי בתיקיה שנבחרה.כדי להשיג ספקטרום MS/MS של כל פפטיד ספציפי, פתח את תוצאות החיפוש בתוכנה F.Then לחץ על החלבון ברשימת החלבונים בתפריט העליון ולחץ על הפפטיד בתפריט האמצעי. MS/MS של פפטיד זה יופיע בתחתית התפריט. כדי לייצא ולשמור את ספקטרום MS/MS, העתק את הספקטרום והדבק אותו בתבנית קובץ מתאימה.מבני גנים של EYFP CENP-A סוג פראי או מוטציה K124R אשר מציל את אובדן CENP-A אנדוגני באו לידי ביטוי באופן הדוק כאשר אינטגרציה רטרו-ויראלית בוצעה. הביטוי של CENP-A אנדוגני לא זוהה שבעה ימים לאחר אינדוקציה של Recombinase Cre. הן סוג הבר EYFP CENP-A והן ביטוי החלבון K124R נמצאו ברמה דומה לחלבון CENP-A האנדוגניים הראשוני.הן EYFP CENP-A סוג פראי מוטציות K124R הראו לוקליזציה centromere בשבעה ימים לאחר שיבוש הביטוי הנותר של CENP-A אנדוגני. סוג הפרא EYFP CENP-A והמוטנט K124R הראו בכל מקום ואינטראקציה עם HJURP שלא כמו במקרה של סוג פראי מסומן או לא מתויג CENP-A ומוטנט K124R. הכדאיות התא הוערכה על ידי ביצוע המושבה להעריך 14 ימים לאחר ההפרעה של אלל CENP-A אנדוגני הנותרים.שניהם EYFP CENP-A סוג פראי מוטציות K124R הראו מספר דומה של מושבות שניצלו 14 ימים לאחר ההפרעה של אלל CENP-A אנדוגני הנותרים. ספקטרומטריית מסה IP חשפה בכל מקום בליסין 306 ב- EYFP CENP-A K124R בתאי CENP-A מינוס F. בסך הכל, תוצאות אלה הראו כי היתוך של חלבון בגודל גדול גורם בכל מקום בליזין אחר מאשר K124R ב CENP-A אשר מעכב את פנוטיפ מוטציה יחיד K124R המקורי.בעת ניסיון פרוטוקול זה, השתמש בג'ל החלבון 4%12%Bis-Tris הזמין מסחרית כדי להפעיל את דגימות ספקטרומטריית המסה. מוסיפים מספיק טריפסין לחתיכות הג'ל ומייבשים אותם מחדש עד שכל האנזימים נספגים. תיוג משקל מולקולרי נמוך יותר או טכניקת בדיקה נדרשת למעשה כדי לדמיין בכל מקום ולחקור חלבון זמני מרחבי בכל מקום איתות ברמות האורגניזם כולו.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI הכנה לדוגמא: שיטת אולטרה שכבה דקה

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

ניתוח מערכות חלבון גדול על ידי ספקטרומטריית מסה מבנית

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

אמיד מימן / דאוטריום Exchange &amp; MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית ניתוח של הפעלת Pak2

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

ספקטרומטריית מתחם מיסת לכידה - כלי רב עוצמה לזיהוי הרומן ג-di-GMP חלבונים מפעיל

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

הקרנת siRNA לזיהוי יוביקוויטין ורגולטורים מערכת דמויות יוביקוויטין של מסלולים ביולוגיים בתאי יונקים בתרבית

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

העשרה תאית מטריקס חלבונים מרקמות ועיכול לפפטידים לניתוח ספקטרומטריית המסה

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

יישומים של-הבדיקה הבודדה: הדמיה ספקטרומטריית מסה וניתוח תא יחיד בתנאי הסביבה

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...