Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

हम बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए मॉडल पशु अनुसंधान केंद्र, नानजिंग विश्वविद्यालय में चाओ-जून ली को धन्यवाद देते हैं। हम यामिनी दलाल, तात्सुओ फुकागावा, और मॉडल एनिमल रिसर्च सेंटर, नानजिंग विश्वविद्यालय और Greehey बच्चों के कैंसर अनुसंधान संस्थान में वर्तमान शोधकर्ताओं को उनके सहायक चर्चा, प्रयोगात्मक मार्गदर्शन और अभिकर्मकों के लिए धन्यवाद देते हैं। हम डॉन डब्ल्यू क्लीवलैंड, डेनिएल फाचिनेट्टी, यामिनी दलाल, मिन्ह बुई, गुस्तावो डब्ल्यू लियोन, जॉन थॉम्पसन, लॉरेंस एस किर्श्नर, अमृता एश्टेकर, बेन ई ब्लैक, ग्लेनिस ए लॉगस्डन, केंजी तागो और डॉन एस चांडलर को रिजेंट्स के उदार उपहारों के लिए धन्यवाद देते हैं । वाईएन को जियांग्सू प्रांत ' डबल-फर्स्ट क्लास ' कंस्ट्रक्शन फंड द्वारा समर्थित किया गया था, जियांग्सू प्रांत प्राकृतिक विज्ञान कोष (SBK2019021248), जियांग्सू प्रांत16 छह बड़ी प्रतिभा चोटियों कोष (टीडी-SWYY-001), जियांग्सू प्रांत "विदेशी विशेषज्ञ सौ प्रतिभा कार्यक्रम" कोष (SBK2019010048), और चीन में राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (३१९७०६६५) । इस अध्ययन को आंशिक रूप से एनसीआई अनुदान R21 CA205659 द्वारा समर्थित किया गया था।

1. सेल संस्कृति और pBabe-EYFP-CENP-A निर्माण के रेट्रोवायरस ट्रांसफेक्शन
नोट: EYFP-CENP-A pBabe-EYFP-CENP-A से एक समान प्रोटीन स्तर पर अंतर्जात CENP-A के लिए व्यक्त किया जाता है । कुल सेलुलर CENP-एक प्रोटीन इस EYFP-CENP-A के साथ प्रतिस्?...

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	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

यहां हमने EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के तरीकों का वर्णन किया, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि EYFP टैगिंग सेनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रो...

अधिकांश यूकेरियोट्स में, स्पिंडल माइक्रोट्यूबुल्स को प्रत्येक गुणसूत्र के एक ही क्षेत्र से जोड़ना चाहिए, जिन्हें सेंट्रोमेरे कहा जाता है। किनेटोकोर प्रोटीन का एक जटिल है जो सेंट्रोमेरे में स्थित है। सेंट्रोमेरे और किनेटोकोर प्रोटीन की गतिविधियों के समय और किनेटोयर और सेंट्रोमेरेस की संरचना का अध्ययन गुणसूत्र अस्थिरता (सिन) और कैंसर की प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। प्रमुख प्रश्न यह हैं कि एक सेंट्रोमेरे (यानी, सेंट्रोमेरे पहचान) का गुणसूत्र स्थान और कार्य कैसे निर्धारित किया जाता है और वे सटीक गुणसूत्र अलगाव में कैसे भाग लेते हैं। अधिकांश प्रजातियों में, एक विशिष्ट हिमात की तरह प्रोटीन युक्त एक विशेष नाभिक की उपस्थिति CENP-A कहा जाता है सेंट्रोमेरे पहचान को परिभाषित करता है । इसलिए, यह प्रस्तावित है कि सेएनपी-ए सेंट्रोमेरे पहचान का गैर-डीएनए संकेतक (एपिजेनेटिक मार्क) है। यह कैसे CENP-A मनुष्यों में केंद्रीय पहचान को परिभाषित करता है के तंत्र को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
होलिडे जंक्शन रिकग्निशन प्रोटीन (एचयूआरपी) सेएनपी-ए-विशिष्ट चैपरन,है जो सेंट्रोमेरिक न्यूक्लियोसोम्स1,2,3में सेएनपी-ए जमा करता है।, हमने पहले बताया है कि CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase CENP के लिए आवश्यक है-lysine १२४ (K124) और सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण4पर सर्वव्यापकता । इसके अलावा, हमारे परिणामों से पता चला है कि नए संश्लेषित CENP-A की केंद्रीकृत भर्ती के लिए पहले से मौजूद सर्वव्यापक CENP-A5की आवश्यकता होती है । इस प्रकार, एक मॉडल प्रदान किया गया था जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि सेल डिवीजनों के बीच डामरीकरण के माध्यम से सीएनपी-ए सर्वव्यापकता विरासत में मिली है।
हमारे निष्कर्षों और यू एट अल के विपरीत, CENP-A और इसके केंद्रीय स्थानीयकरण के बारे में नकारात्मक परिणाम हाल ही में6प्रकाशित किए गए थे। लेख में दावा किया गया है कि CENP-lysine १२४ (K124) पर एक संशोधन मानव सेंट्रोमर की स्थापना, रखरखाव, और दीर्घकालिक समारोह के लिए अपरिहार्य हैं, उनके नकारात्मक परिणामों के आधार पर दिखा रहा है कि K124R के उत्परिवर्तन CENP-A centromere स्थानीयकरण न तो सेल व्यवहार्यता6को प्रभावित नहीं किया । हालांकि, उनके परिणामों और निष्कर्षों में बहस के लिए पर्याप्त जगह है, और हम पहले से ही बता चुके हैं कि उनके पिछले प्रकाशन7में क्या समस्या हो सकती है । ध्यान दिया जाना चाहिए कि वे CENP-A के साथ प्रोटीन जुड़े, जो अंतर्जात CENP-A के आकार की तुलना में बहुत बड़ा आणविक वजन है: उदाहरण के लिए, वे ~30 केडीए बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) ~ 16 केडीए CENP-A और विश्लेषण EYFP-CENP-A K124R संलयन प्रोटीन उनके RPE-1CENP-A-/F नॉकआउट प्रणाली में जुड़े । K124 सर्वव्यापकता को संरचनात्मक भविष्यवाणियों के आधार पर सीधे HJURP से बांधने की उम्मीद नहीं है4,हालांकि, मोनो-सर्वव्यापकता के अलावा सेनपी-ए के प्रोटीन संरचना पर प्रभाव पड़ने की भविष्यवाणी की गई है। CENP-A संरचना के प्रोटीन को एक बड़े संलयन प्रोटीन की उपस्थिति से बदला जा सकता है, और यह अनुरूप परिवर्तन सर्वव्यापी के नुकसान के कारण संरचनात्मक परिवर्तनों को मुखौटा कर सकता है। हमारा सुझाव है कि बड़े आकार के प्रोटीन का संलयन EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती में K124 के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापी लाती है और एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है/मास्क । सबूत है कि सर्वव्यापकता CENP में अलग-अलग lysine पर होता है-एक K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन एक बड़े टैग प्रोटीन (EYFP) के साथ हमारे पिछले प्रकाशन8में सूचित किया गया था । यह पाया गया कि EYFP टैगिंग EYFP-CENP-A K124R की एक और lysine साइट के सर्वव्यापकता लाती है और यह कि EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती HJURP को बांधता है । नतीजतन, एक और साइट पर यह सर्वव्यापकता मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है/मास्क करता है, और दोनों EYFP-CENP-एक WT और K124R म्यूटेंट ने सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण दिखाया (हमने पीबेबे-ईई-ए डब्ल्यूटीई और K124R उत्परिवर्ती की तुलना में पीबे-ईई एफपी नियंत्रण के साथ मिलकर किया । परिणामों से पता चला है कि फ्लैग-टैग या अनटैग्ड CENP-A K124R म्यूटेंट घातक हैं, लेकिन एक मोनोफिस्टिन फ्यूजन द्वारा बचाया जा सकता है, यह सुझाव देते हुए कि CENP-A सर्वव्यापकता सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है।
हाल के वर्षों में, कई अध्ययनों ने सेनपी-ए प्रोटीन और अन्य सेंट्रोमेरे-किनेटोकोर प्रोटीन के पोस्टट्रांसल संशोधनों (पीटीएमएस) की पहचान करने के लिए विभिन्न परख विकसित की9,10,है। हिस्टोन प्रोटीन के पीटीएमएस के अनुरूप जो क्रोमेटिन के कार्य को विनियमित करने वाला एक प्रमुख तंत्र है, सेंट्रोमेरिक क्रोमेटिन घटकों के पीटीएमएस भी सेंट्रोमर्स की समग्र संरचना और कार्य को विनियमित करने के लिए एक आवश्यक तंत्र में शामिल हैं। सेनपी-ए पीटीएम साइटों के बहुमत CENP-ए युक्त न्यूक्लियोसोम के लिए विशिष्ट हैं, हालांकि उनमें से कुछ हिस्टोन H3 में संरक्षित हैं, सुझाव है कि इन अवशेषों के संशोधन सेंट्रोमेरे विशिष्ट समारोह में योगदान करते हैं । फॉस्फोरिलेशन, एसीटिलेशन, मिथाइलेशन और सर्वव्यापकता सहित सेनपी-ए के पीटीएम को पहले9बताया गया था, जिसमें यह सुझाव दिया गया था कि सेएनपी-ए विभिन्न प्रकार के पीटीएम के अधीन है और इसके अमीनो टर्मिनस और सी-टर्मिनस हाइस्टोन-फोल्ड डोमेन पर उनके संयोजन सरणी हैं। CENP के महत्व-कई कार्यों में एक संशोधन हमारे सहित कई समूहों द्वारा पता चला था । इन कार्यों में सेंट्रोमरे, प्रोटीन स्थिरता और सीसीएन (संविलियन से जुड़े नेटवर्क)9की भर्ती में सेएनपी-ए बयान शामिल है। हालांकि, सीमित अध्ययन और CENP-A PTMs के निष्कर्षों को पहले से सूचित किया जाता है जहां तुलना विहित हिटोन में से एक के साथ की जाती है जो प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से उनके कार्य को विनियमित करती है। इन CENP-A PTMs की पहचान करने के लिए कार्यप्रणाली पर ध्यान केंद्रित तकनीकी रिपोर्ट भी सीमित हैं ।
क्योंकि सेएनपी-ए सर्वव्यापकता के लिए सेंट्रोमेरे12में सेएनपी-ए बयान के लिए आवश्यक है, जो सेल डिवीजन5के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिला है, और सेल व्यवहार्यता8के लिए अपरिहार्य है, भविष्य में सेंट्रोमेरे की कार्यात्मक गतिविधि, स्थिति और संरचना का अध्ययन करने के लिए CENP-A सर्वव्यापी की पहचान करने की विधि आवश्यक होगी। इसलिए, यहां हम EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि EYFP टैगिंग सेनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन8में एक अलग lysine पर सर्वव्यापकता लाती है । प्रमुख द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के परिणाम पर ठीक से चर्चा करने के लिए अन्य नियंत्रण परख और विश्लेषण (इम्यूनोफ्लोरेसेंस विश्लेषण, कॉलोनी आउटग्रोथ परख, और वीवो सर्वव्यापकता परख में) के प्रोटोकॉल भी प्रस्तुत किए जाते हैं।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

संरचना और kineto काम और सेंट्रोमर की गतिशीलता का अध्ययन गुणसूत्र अस्थिरता (CIN) और कैंसर प्रगति को समझने में महत्वपूर्ण है । कैसे गुणसूत्र स्थान और एक सेंट्रोमेरे (यानी, सेंट्रोमेरे पहचान) के कार्य निर्धारित कर रहे है और सटीक गुणसूत्र अलगाव में भाग लेने के एक बुनियादी सवाल है । सेएनपी-ए को सेंट्रोमरे पहचान का गैर-डीएनए संकेतक (एपिजेनेटिक मार्क) होने का प्रस्ताव है, और सेएनपी-ए सर्वव्यापकता के लिए सेएनपी-ए बयान के लिए आवश्यक है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिला है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है।
यहां हम EYFP-CENP-A K124R उत्परिवर्ती के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं, जिसमें यह सुझाव दिया गया है कि सेएनपी-ए K124R उत्परिवर्ती प्रोटीन में EYFP टैगिंग के कारण एक अलग lysine पर सर्वव्यापी प्रेरित है। LYsine 306 (K306) EYFP-CENP-A K124R में सर्वव्यापकता सफलतापूर्वक पहचान की गई थी, जो बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के माध्यम से सेनपी-ए में लिसिन 56 (K56) से मेल खाती है। एक चेतावनी GFP/EYFP के उपयोग या एक प्रोटीन के कार्य का विश्लेषण करने के लिए एक उपकरण के रूप में उच्च आणविक वजन प्रोटीन की टैगिंग में चर्चा की है । सर्वव्यापी बैंड का पता लगाने, साइट-विशिष्ट सर्वव्यापकता (एस) की पहचान और जीवित कोशिकाओं में सर्वव्यापीता के दृश्य या पूरे सेल चक्र के दौरान एक विशिष्ट एकल कोशिका के लिए वर्तमान तकनीकी सीमा पर भी चर्चा की जाती है।
यहां प्रस्तुत मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण की विधि को विभिन्न टैग और अन्य सेंट्रोमेरे-किनेटोकोर प्रोटीन के साथ मानव सेन्प-ए प्रोटीन पर लागू किया जा सकता है। कई परख/विश्लेषण से युक्त इन संयोजन तरीकों की सिफारिश उन शोधकर्ताओं के लिए की जा सकती है जो सर्वव्यापकता की कार्यात्मक भूमिकाओं की पहचान करने में रुचि रखते हैं ।

EYFP-CENP-A K124 उत्परिवर्ती सर्वव्यापी, HJURP के साथ बातचीत से पता चलता है, और सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण में कोई दोष न तो सेल घातकता । यहां Fachinetti एट अल द्वारा रिपोर्ट प्रणाली ( २०१७)6 फिर से गठित किया गया थ?...

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A सर्वव्यापकता सेंट्रोमेरे में CENP-ए बयान के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है, जो सेल डिवीजन के बीच डामरीकरण के माध्यम से विरासत में मिली है, और सेल व्यवहार्यता के लिए अपरिहार्य है। यहां हम EYFP-टैग CENP-A (EYFP-CENP-A) प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का वर्णन करते हैं।

EYFP-टैग किए गए सेनपी-ए (EYFP-CENP-A) के सर्वव्यापी की पहचान करने के लिए मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

इस विधि से EYFP-टैग किए गए CENP-A प्रोटीन के सर्वव्यापकता की पहचान करना संभव हो जाता है। इसे विभिन्न परीक्षणों और अन्य प्रोटीन के साथ मानव CENP-A प्रोटीन पर भी लागू किया जा सकता है। इसका मुख्य लाभ यह है कि इसका उपयोग महत्वपूर्ण जैविक महत्व वाले EYFP CENP-A K124R सर्वव्यापी साइटों की पहचान करने के लिए किया जा सकता है।यह कार्यात्मक प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला के बाद अनुवाद संशोधनों की जांच करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । प्रोटीन एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ बंधे तैयार करके शुरू करते हैं । इथेनॉल को हटाने के लिए बफर ए1 के साथ प्रति इम्यूनोप्रिपिपिटेशन रिएक्शन के 25 माइक्रोलीटर धोएं।फिर बफर A1 के साथ 50% मनका समाधान बनाएं। मोतियों में एंटी-जीएफपी एंटीबॉडी के दो माइक्रोलीटर जोड़ें। फिर बफर A1 को नेट मनका वॉल्यूम का 20 गुना तक जोड़ें। चार से 18 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं ।रोटेशन के लिए इष्टतम अवधि इम्यूनोप्रिपिपिटेशन की दक्षता के आधार पर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। रोटेशन के बाद, एक मिनट के लिए 100 बार जी पर मोतियों को अपकेंद्रित्र करें और अनबाउंड सुपरनेट को हटा दें। मोतियों का 50% समाधान बनाने के लिए बफर A1 जोड़ें और प्रत्येक इम्यूनोप्रिपिटेशन प्रतिक्रिया के लिए इस समाधान के 25 माइक्रोलीटर का उपयोग करें।इम्यूनोप्रिपिपिटेशन करने के लिए, बफर A1 में सोनीशन और फ्रीज/गल के माध्यम से कोशिकाओं को lyse । प्रोटीन सांद्रता को मापें और विभिन्न आईपी नमूनों के बीच प्रोटीन की मात्रा को सामान्य करें। फिर एसडीएस पेज में चलाने के लिए प्रत्येक ट्यूब से 5% नमूना निकालें।प्रोटीन के 25 माइक्रोलीटर के साथ शेष lysate मिलाएं एक मोती विरोधी GFP एंटीबॉडी के लिए बाध्य है और चार से 18 घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर अंत से अंत रोटेशन प्रदर्शन करते हैं । बफर ए में कोशिकाओं को lysing और पहले वर्णित इम्यूनोप्रिपिपिटेशन प्रदर्शन के बाद, EYFP CENP-A सर्वव्यापकता की पुष्टि करने के लिए कुल इम्यूनोप्रिपिट्सेंट का 10% रखें और सर्वव्यापी EYFP CENP-A की स्थिति को ठीक से निर्धारित करें। बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए अन्य 90% का उपयोग करें।व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4-12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जेल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूना चलाएं। फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए 50-70 किलोडडलटन जेल क्षेत्र को कूमासी ब्लू धुंधला और उत्पादित करें। प्रत्येक जेल स्लाइस को छोटे टुकड़ों में पासा करें और उन्हें 0.5 मिलीलीटर कम प्रोटीन बाध्यकारी ट्यूब में रखें।25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट में 50% एसीटोनिट्रिल के 100 माइक्रोलीटर के साथ जेल के टुकड़ों को धोएं। उन्हें 10-15 मिनट के लिए भंवर। फिर उन्हें नीचे स्पिन करें और सुपरनिटेंट को त्याग दें।आखिरी धोने के बाद, जेल के टुकड़ों को 30 मिनट के लिए बेंच टॉप वैक्यूम सांचित के साथ सुखा लें। 10 नैनोग्राम प्रति माइक्रोलीटर अनुक्रमण ग्रेड ट्राइप्सिन जोड़ें और जेल के टुकड़ों को पांच मिनट के लिए फिर से हाइड्रेट होने दें। फिर 25 मिलीमोलर अमोनियम बाइकार्बोनेट जोड़ें, बस जेल के टुकड़ों को कवर करने के लिए पर्याप्त है और उन्हें रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर पचाता है।अगले दिन, पचा सुपरनेट को एक साफ 0.65 मिलीलीटर सिलिकॉन ट्यूब में स्थानांतरित करें और 50% एसीटोनिट्रिल और 5% फॉरमिक एसिड समाधान जोड़ें। भंवर 10 मिनट के लिए नमूना। फिर इसे नीचे स्पिन करें और सुपरनैंट को एक निष्कर्षण ट्यूब में स्थानांतरित करें।नमूना को फिर से दो माइक्रोलीटर पर केंद्रित करें। फिर 3% एसीटोनिट्रिल और 2% फॉरमिक एसिड समाधान के आठ माइक्रोलीटर जोड़ें। भंवर यह 15 मिनट के लिए और 30 मिनट के लिए 16, 000 बार जी पर नीचे स्पिन ।एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी प्रणाली का उपयोग कर एलसी-एमएस/एमएस के साथ एमएस डेटा अधिग्रहण करें । नमूने के आठ माइक्रोलीटर को रिवर्स चरण तरल क्रोमेटोग्राफी कॉलम में इंजेक्ट करें और पांडुलिपि निर्देशों के बाद 60 मिनट में सॉल्वेंट बी के 2-80% ढाल के साथ पेप्टाइड्स को अलग करें। डेटा-निर्भर अधिग्रहण मोड का उपयोग करके बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा एकत्र करें।डेस्कटॉप पर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा का विश्लेषण करने के लिए वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर खोलें। नई खोज शुरू करने के लिए, शीर्ष मेनू पर एलसी बटन पर क्लिक करें। इसके बाद ओरिजनल एमएस रॉ डाटा फाइल्स को अपलोड करने के लिए ऐड बटन पर क्लिक करें।डेटाबेस खोज विधि के रूप में पैरागॉन विधि में मानव प्रोटीन आईडी का चयन करें और यूनिप्रॉट होमो सेपियंस डेटाबेस के खिलाफ मूल एमएस कच्चे डेटा फ़ाइलों को खोजें। पाचन एंजाइम के रूप में ट्राइपसिन का चयन करें और पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार बाकी मापदंडों को निर्धारित करें। परिणाम फाइलनेम दर्ज करें और मेनू के दाईं ओर बटन के रूप में सेव पर क्लिक करें।इसके बाद सर्चिंग रिजल्ट्स को स्टोर करने के लिए फोल्डर चुनें और सेव बटन पर क्लिक करें। खोज शुरू करने के लिए प्रोसेस बटन पर क्लिक करें। खोज समाप्त होने के बाद, दर्ज खोज नाम वाला डेटा स्वचालित रूप से चयनित फ़ोल्डर में संग्रहीत हो जाएगा।किसी भी विशिष्ट पेप्टाइड के एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए, सॉफ्टवेयर F.तो शीर्ष मेनू में प्रोटीन सूची में प्रोटीन पर क्लिक करें और मध्य मेनू में पेप्टाइड पर क्लिक करें में खोज परिणाम खोलें । इस पेप्टाइड का एमएस/एमएस मेन्यू के नीचे दिखाई देगा । एमएस/एमएस स्पेक्ट्रा को निर्यात और सहेजने के लिए स्पेक्ट्रा की कॉपी करें और उसे उपयुक्त फाइल फॉर्मेट में चिपका दें ।EYFP CENP-एक जंगली प्रकार या K124R उत्परिवर्ती जो अंतर्जात CENP-A के नुकसान को बचाता है के जीन निर्माण स्थिर व्यक्त किया गया था जब रेट्रोवायरल एकीकरण किया गया था । क्रे रिकॉम्बिनेज के शामिल होने के सात दिन बाद अंतर्जात सेनपी-ए की अभिव्यक्ति का पता नहीं चला । दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R प्रोटीन अभिव्यक्ति प्रारंभिक अंतर्जात CENP-एक प्रोटीन के समान स्तर पर पाया गया था ।दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R म्यूटेंट अंतर्जात CENP-ए की शेष अभिव्यक्ति के व्यवधान के बाद सात दिनों में सेंट्रोमेरे स्थानीयकरण दिखाया । EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R उत्परिवर्ती को झंडी दिखाकर चिह्नित टैग या बिना चलने वाले CENP-एक जंगली प्रकार और K124R उत्परिवर्ती के लिए मामले के विपरीत HJURP के साथ सर्वव्यापकता और बातचीत दिखाया । शेष अंतर्जात सेनपी-ए एलील के व्यवधान के 14 दिन बाद कॉलोनी आउटग्रोथ परख का प्रदर्शन करके सेल व्यवहार्यता का आकलन किया गया था।दोनों EYFP CENP-एक जंगली प्रकार और K124R म्यूटेंट शेष अंतर्जात CENP-एक allele के व्यवधान के बाद 14 दिन बचाया कालोनियों की एक समान संख्या में दिखाया । आईपी मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने CENP-A ऋण एफ कोशिकाओं में EYFP CENP-A K124R में lysine ३०६ में सर्वव्यापकता का पता चला । सभी एक साथ, इन परिणामों ने सुझाव दिया कि बड़े आकार के प्रोटीन का संलयन CENP-A में K124R के अलावा एक lysine पर सर्वव्यापकता लाती है जो मूल K124R एकल उत्परिवर्ती फेनोटाइप को रोकता है ।इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री नमूनों को चलाने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 4%12% बीआईएस-ट्रिस प्रोटीन जैल का उपयोग करें। जेल के टुकड़ों में पर्याप्त ट्राइप्सिन जोड़ें और सभी एंजाइमों को अवशोषित होने तक उन्हें फिर से हाइड्रेट करें। कम आणविक वजन टैगिंग या जांच तकनीक वास्तव में सर्वव्यापी कल्पना और स्थानिक लौकिक प्रोटीन सर्वव्यापकता और पूरे जीव के स्तर पर संकेत की जांच करने के लिए आवश्यक है ।

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

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MALDI नमूना तैयार: अल्ट्रा पतली परत मेथड

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

स्ट्रक्चरल मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा बड़े प्रोटीन परिसरों विश्लेषण

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

टी लहर आयन गतिशीलता मास स्पेक्ट्रोमेट्री प्रोटीन परिसर विश्लेषण के लिए मूल प्रायोगिक प्रक्रिया

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

वायुमंडलीय दबाव में मास स्पेक्ट्रोमेट्री से एकल कक्ष के प्रत्यक्ष विश्लेषण

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

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Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

एमाइड / हाइड्रोजन ड्यूटेरियम Pak2 सक्रियकरण की विनिमय &amp; MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

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Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

कैद यौगिक मास स्पेक्ट्रोमेट्री - उपन्यास सी-डि-जीएमपी effector के प्रोटीन की पहचान के लिए एक शक्तिशाली उपकरण

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

संवर्धित स्तनधारी कोशिकाओं में जैविक रास्ते की Ubiquitin और ubiquitin की तरह सिस्टम नियामकों की पहचान siRNA स्क्रीनिंग

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए पेप्टाइड में ऊतकों और पाचन से बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन के संवर्धन

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

एकल जांच के आवेदन: मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग और परिवेश की स्थिति के तहत सिंगल सेल विश्लेषण

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...