Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Ringraziamo Chao-Jun Li presso il Model Animal Research Center della Nanjing University per l'analisi della spettrometria di massa. Ringraziamo Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e gli attuali ricercatori del Model Animal Research Center, della Nanjing University e del Greehey Children's Cancer Research Institute per la loro utile discussione, guida sperimentale e reagenti. Ringraziamo Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler per i loro generosi doni di reagenti. Y.N. è stato sostenuto dal Fondo di costruzione della provincia di Jiangsu ''Doppia-Prima Classe'', Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Provincia di Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Provincia "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in Cina (31970665). Questo studio è stato in parte sostenuto dalla sovvenzione NCI R21 CA205659.

1. La coltura cellulare e la trafezione retrovirus dei costrutti pBabe-EYFP-CENP-A
NOTA: EYFP-CENP-A è espresso da pBabe-EYFP-CENP-A a un livello proteico simile a quello endogeno CENP-A. La proteina EYFP-CENP-A cellulare totale viene sostituita da questa proteina EYFP-CENP-A dopo l'interruzione dell'alleloCENP-A -/F da parte della ricombinabile Cre come nelle celle RPE-1 CENP-A-/-6 .
<ol><li>Preparazione del superatante contenente retrovirus utilizzando c...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Qui abbiamo descritto i metodi di analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. Nei nostri risultati, abbiamo identificato con successo l'ubiquilazione sulla lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. L'analisi della spettrometria di mass...

Nella maggior parte degli eucarioti, i microtubuli del mandrino devono essere attaccati a una singola regione di ogni cromosoma, definito centromero. Il cinetochore è un complesso di proteine che si trovano al centromero. Lo studio dei tempi dei movimenti della proteina centromera e cinetochore e la struttura dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Le domande chiave sono come vengono determinate la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) e come partecipano alla segregazione cromosomica accurata. Nella maggior parte delle specie, la presenza di un nucleomatoma speciale contenente una proteina simile a un istone specifica chiamata CENP-A definisce l'identità del centromero. Pertanto, si propone che il CENP-A sia l'indicatore non DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero. È importante chiarire il meccanismo di come CENP-A definisce l'identità del centromero negli esseri umani.
La proteina di riconoscimento della giunzione di Holliday (HJURP) è l'accompagnatore specifico CENP-A che deposita CENP-A nei nucleosomeri centromerici1,2,3. Abbiamo già riferito che il CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase è richiesto per l'ubiquilazione CENP-A sulla lisina 124 (K124) e la localizzazione del centromero4. Inoltre, i nostri risultati hanno mostrato che il reclutamento di centrimeri di CENP-A di5nuova sintesi richiede CENP-A oniquizzato preesistente. Così, è stato fornito un modello che suggerisce che l'ubiquilinazione CENP-A viene ereditata attraverso la dimerizzazione tra le divisioni cellulari.
In contrasto con le nostre scoperte e quelle di Yu et al., risultati negativi per quanto riguarda il CENP-A e la sua localizzazione centromerica sono stati recentemente pubblicati6. L'articolo affermava che le modifiche del CENP-A sulla lisina 124 (K124) sono dispensabili per l'istituzione, la manutenzione e la funzione a lungo termine dei centrimeri umani, sulla base dei loro risultati negativi che mostravano che la mutazione di K124R non influenzava la localizzazione del centromero CENP-A né la vitalità cellulare6. Tuttavia, c'è abbastanza spazio per discutere nei loro risultati e conclusioni, e abbiamo già descritto quale problema ci potrebbe essere nella loro precedente pubblicazione7. Occorre prestare attenzione al fatto che fondessero le proteine con il CENP-A, che hanno pesi molecolari molto più grandi delle dimensioni del CENP-A endogeno: ad esempio, hanno fuso la proteina fluorescente gialla avanzata da 30 kDa (EYFP) a 16 kDa CE-A e hanno analizzato la fusione delle proteine EYFP-CENP-A K124R nel loro sistema RPE-1CE-A-Knockout.-/F L'ubiquitina K124 non dovrebbe legarsi direttamente all'HJURP sulla base di previsioni strutturali4, tuttavia si prevede che l'aggiunta di monoubiquitina avrà un impatto sulla conformazione proteica del CENP-A. La proteina della conformazione CENP-A può essere modificata dalla presenza di una grande proteina di fusione, e questo cambiamento conformazionale può mascherare i cambiamenti strutturali causati dalla perdita di ubiquilazione. Suggeriamo che la fusione di proteine di grandi dimensioni induca l'ubiquililazione in una lisina diversa da K124 nel mutante EYFP-CENP-A K124R e questa ubiquililazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante. La prova che l'ubiquilazione si verifica in lisina diversa nella proteina mutante CENP-A K124R con una grande proteina tag (EYFP) è stata riportata nella nostra precedente pubblicazione8. Si è scoperto che il tagging EYFP induce l'ubiquitinazione di un altro sito lisina di EYFP-CENP-A K124R e che EYFP-CENP-A K124R mutante lega a HJURP. Di conseguenza, questa ubiquilazione in un altro sito inibisce/maschera il fenotipo originale K124R singolo mutante, e sia EYFP-CENP-A WT che K124R mutanti hanno mostrato la localizzazione del centromero (abbiamo usato e confrontato pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutante, insieme al controllo pBabe-EFP). I risultati hanno dimostrato che i mutanti CENP-A K124R marcati con bandiera sono letali, ma possono essere salvati da una fusione monoubiquitina, suggerendo che l'ubiquilazione CENP-A è indispensabile per la vitalità cellulare.
Negli ultimi anni, molti studi hanno sviluppato diversi saggi per identificare le modifiche post-traduzionali (PTM) della proteina CENP-A e di altre proteine centromere-cinetochore sia in vivo che in vitro9,10,11. Analogo ai PTM delle proteine istone che sono un importante meccanismo che regola la funzione della cromatina, i PTM dei componenti della cromatina centromerici sono anche coinvolti in un meccanismo essenziale per regolare la struttura complessiva e la funzione dei centrimeri. La maggior parte dei siti CENP-A PTM sono specifici dei nucleosomi che contengono CENP-A, anche se alcuni di essi sono conservati nell'istone H3, suggerendo che la modifica di questi residui contribuisce alla funzione specifica del centromero. I PTM del CENP-A, tra cui il fosfororylazione, l'acetilazione, la metilazione e l'ubiquilazione sono stati precedentemente segnalati9, suggerendo che il CENP-A è sottoposto a una varietà di PTM e dei loro array combinatori sul suo dominio aminofileterminus e C-terminus histone-fold. L'importanza delle modifiche CENP-A in più funzioni è stata rivelata da molti gruppi, tra cui la nostra. Queste funzioni comportano la deposizione CENP-A ai centrimeri, la stabilità delle proteine e il reclutamento del CCAN (rete costitutiva associata a centrimere)9. Tuttavia, studi limitati e risultati dei PTM CENP-A sono preformati quando si fanno confronti con uno degli istoni canonici che regolano direttamente o indirettamente la loro funzione. Anche le relazioni tecniche che si concentrano sulla metodologia per identificare questi PTM CENP-A sono limitate.
Poiché l'ubiquilazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A alcentromero 12, ereditata dalla dimerizzazione tra la divisione cellulare5e indispensabile alla vitalità cellulare8, il metodo per identificare l'ubiquilazione CENP-A sarebbe essenziale in futuro per studiare l'attività funzionale, il posizionamento e la struttura del centromero. Pertanto, qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che il tagging EYFP induce l'ubiquilazione in una diversa lisina nella proteina mutante CENP-A K124R8. I protocolli di altri saggi e analisi di controllo (analisi dell'immunofluorescenza, analisi della crescita della colonia e analisi dell'ubiquilazione in vivo) sono anche presentati per discutere correttamente l'esito di un'analisi della spettrometria di massa maggiore.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Studiare la struttura e la dinamica dei cinetocori e dei centrimeri è importante per comprendere l'instabilità cromosomica (CIN) e la progressione del cancro. Il modo in cui la posizione cromosomica e la funzione di un centromero (cioè l'identità del centromero) sono determinate e partecipano alla segregazione accurata del cromosoma è una questione fondamentale. Il CENP-A è proposto come l'indicatore non-DNA (segno epigenetico) dell'identità del centromero, e l'ubiquililazione CENP-A è necessaria per la deposizione CENP-A al centromero, ereditata dalla dimerizzazione tra divisione cellulare e indispensabile alla vitalità cellulare.
Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del mutante EYFP-CENP-A K124R suggerendo che l'ubiquilazione in una lisina diversa è indotta a causa dell'etichettatura EYFP nella proteina mutante CENP-A K124R. L'ubiquilità di lisina 306 (K306) in EYFP-CENP-A K124R è stata identificata con successo, che corrisponde alla lisina 56 (K56) nel CENP-A attraverso l'analisi della spettrometria di massa. Un avvertimento è discusso nell'uso di GFP/EYFP o l'etichettatura di proteine ad alto peso molecolare come strumento per analizzare la funzione di una proteina. L'attuale limite tecnico è discusso anche per l'individuazione di bande oniquilate, l'identificazione di ubiquilazione site-specific, e la visualizzazione dell'ubiquilazione nelle cellule viventi o una singola cellula specifica durante l'intero ciclo cellulare.
Il metodo di analisi della spettrometria di massa qui presentato può essere applicato alla proteina umana CENP-A con diversi tag e altre proteine del centromere-kinetochore. Questi metodi combinatori costituiti da diversi saggi / analisi potrebbero essere raccomandati per i ricercatori che sono interessati a identificare i ruoli funzionali dell'ubiquilazione.

Il mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquilazione, interazione con HJURP e nessun difetto nella localizzazione del centromere né la letalità cellulare. Qui il sistema riportato da Fachinetti et al. (2017)6 è stato ricostituito: in cellule umane diploide (RPE-1) che ne trasportavano una perturbata e un CENP-A ''floxed''(CENP-A-/F),-/FEYFP-CENP-A è stato espresso dal vettore retrò pBabe-EYFPvirus. In questo sistema, l'espressione del CENP-A endogeno ...

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

L'ubiquilazione CENP-A è un requisito importante per la deposizione ceNP-A al centromero, ereditata attraverso la dimerizzazione tra la divisione cellulare e indispensabile per la vitalità cellulare. Qui descriviamo l'analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione della proteina CENP-A (EYFP-CENP-A) marcata con EYFP.

Analisi della spettrometria di massa per identificare l'ubiquilazione del CENP-A con tag EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Questo metodo consente di identificare l'ubiquità della proteina CENP-A taggata dall'EYFP. Può anche essere applicato alla proteina CENP-A umana con diversi test e altre proteine. Il vantaggio principale di questo è che può essere utilizzato per identificare siti onnipresenti EYFP CENP-A K124R con un significato biologico cruciale.Potrebbe essere esteso per studiare le modifiche post-traslazionali di una vasta gamma di proteine funzionali. Inizia preparando la proteina A perline legate con anticorpi anti-GFP. Lavare 25 microlitri di proteine A per reazione di immunoprecipitazione con tampone A1 almeno tre volte per rimuovere l'etanolo.Quindi creare una soluzione di perline del 50% con buffer A1. Aggiungere due microlitri di anticorpo anti-GFP alle perline. Quindi aggiungere il buffer da A1 a 20 volte il volume netto delle perline. Eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore.La durata ottimale per la rotazione deve essere determinata empiricamente in base all'efficienza dell'immunoprecipitazione. Dopo la rotazione, centrifugare le perline a 100 volte g per un minuto e rimuovere il supernatante non legato. Aggiungere tampone A1 per fare una soluzione al 50% di perline e utilizzare 25 microlitri di questa soluzione per ogni reazione di immunoprecipitazione.Per eseguire l'immunoprecipitazione, liscire le cellule nel tampone A1 tramite sonicazione e congelare/scongelare. Misurare le concentrazioni proteiche e normalizzare le quantità proteiche tra i diversi campioni IP. Quindi rimuovere il 5% del campione da ogni tubo da eseguire nella pagina SDS.Mescolare il resto del lysate con 25 microlitri di proteine A perline legate all'anticorpo anti-GFP ed eseguire la rotazione end-to-end a quattro gradi Celsius per quattro-18 ore. Dopo aver lisciviato le cellule nel tampone A ed eseguito l'immunoprecipitazione come descritto in precedenza, mantenere il 10% degli immunoprecipitanti totali per confermare l'ubiquità CENP-A dell'EYFP e determinare con precisione la posizione dell'EYFP CENP-A ubiquitilato. Utilizzare l'altro 90% per l'analisi della spettrometria di massa.Eseguire il campione di spettrometria di massa in un gel proteico Bis-Tris 4-12%disponibile in commercio. Quindi eseguire la colorazione blu Coomassie e asportare la regione gel da 50-70 kilodalton per l'analisi della spettrometria di massa. Dadi ogni fetta di gel in piccoli pezzi e mettili in un tubo di legame a basso contenuto proteico da 0,5 millilitri.Lavare i pezzi di gel con 100 microlitridi di acetonitrile al 50% in bicarbonato di ammonio millimolare. Vortice per 10-15 minuti. Quindi spinli verso il basso e scarta il supernatante.Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare i pezzi di gel con un concentratore sottovuoto da banco per 30 minuti. Aggiungere 10 microlitri di 10 nanogrammi per microlitri che sequenziano la trippsina e lasciare che i pezzi di gel si reidratano per cinque minuti. Quindi aggiungere 25 bicarbonato di ammonio millimolare, quanto basta per coprire i pezzi di gel e digerirli a 37 gradi Celsius durante la notte.Il giorno successivo, trasferire il supernatante digerito in un tubo siliconato pulito da 0,65 millilitri e aggiungere il 50% di acetonitrile e la soluzione di acido formico al 5%. Vortice il campione per 10 minuti. Quindi giralo verso il basso e trasferisci il supernatante in un tubo di estrazione.Concentrare nuovamente il campione su due microlitri. Aggiungere quindi otto microlitri di soluzione di acido 3% acetonitrile e 2% formico. Vortice per 15 minuti e girare verso il basso a 16.000 volte g per 30 minuti.Eseguire l'acquisizione dei dati MS con LC-MS/MS utilizzando un sistema di cromatografia liquida abbinato a uno strumento di spettrometria di massa. Iniettare otto microlitri del campione in una colonna di cromatografia liquida in fase inversa e separare i peptidi con un gradiente del 2-80% del solvente B in 60 minuti dopo le indicazioni manoscritte. Raccogliere dati di spettrometria di massa utilizzando la modalità di acquisizione dipendente dai dati.Aprire il software commerciale per analizzare i dati della spettrometria di massa sul desktop. Per avviare una nuova ricerca, fare clic sul pulsante LC nel menu in alto. Quindi fare clic sul pulsante Aggiungi per caricare i file di dati non elaborati MS originali.Selezionare l'ID proteina umana nel metodo paragon come metodo di ricerca del database e cercare i file di dati raw MS originali nel database UniProt homo sapiens. Selezionare la tripina come enzima di digestione e impostare il resto dei parametri in base alle direzioni del manoscritto. Immettere il nome del file dei risultati e fare clic sul pulsante Salva con nome a destra del menu.Quindi selezionare una cartella per archiviare i risultati della ricerca e fare clic sul pulsante Salva. Fare clic sul pulsante processo per avviare la ricerca. Al termine della ricerca, i dati con il nome di ricerca immesso verranno memorizzati automaticamente nella cartella selezionata.Per ottenere gli spettri MS/MS di qualsiasi peptide specifico, aprire i risultati della ricerca nel software F.Quindi fare clic sulla proteina nell'elenco delle proteine nel menu in alto e fare clic sul peptide nel menu centrale. L'MS/MS di questo peptide apparirà nella parte inferiore del menu. Per esportare e salvare gli spettri MS/MS, copiare gli spettri e incollarli in un formato di file adatto.I costrutti genici di tipo selvatico EYFP CENP-A o mutante K124R che salva la perdita di CENP-A endogeno sono stati espressi stabilmente quando è stata eseguita l'integrazione retrovirale. L'espressione del CENP-A endogeno non è stata rilevata sette giorni dopo l'induzione della ricombinasi di Cre. Sia il tipo selvatico EYFP CENP-A che l'espressione proteica K124R sono risultati ad un livello simile alla proteina CENP-A endogena iniziale.Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato la localizzazione del centromero a sette giorni dall'interruzione della restante espressione del CENP-A endogeno. Il tipo selvaggio EYFP CENP-A e il mutante K124R mostravano ubiquità e interazione con HJURP a differenza della cassa per il tipo selvaggio CENP-A contrassegnato o non registrato e il mutante K124R. La vitalità cellulare è stata valutata eseguendo il test di crescita della colonia 14 giorni dopo l'interruzione del rimanente allele endogeno CENP-A.Sia i mutanti selvatici EYFP CENP-A che K124R hanno mostrato un numero simile di colonie salvate 14 giorni dopo l'interruzione del restante allele endogeno CENP-A. La spettrometria di massa IP ha rivelato ubiquisizione a lysine 306 in EYFP CENP-A K124R nelle cellule CENP-A meno F. Tutti insieme, questi risultati hanno suggerito che la fusione di proteine di grandi dimensioni induce ubiquisizione in una lisina diversa da K124R nel CENP-A che inibisce il fenotipo mutante singolo K124R originale.Quando si tenta questo protocollo, utilizzare i gel proteici 4%12%Bis-Tris disponibili in commercio per eseguire i campioni di spettrometria di massa. Aggiungere una tripina adeguata ai pezzi di gel e reidratarli fino a quando tutti gli enzimi non sono stati assorbiti. La tecnica di etichettatura o sondaggio a peso molecolare inferiore è in realtà necessaria per visualizzare l'ubiquitàlazione e indagare la segnalazione di ubiquità della proteina temporale spaziale a livello dell'intero organismo.

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