Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Vi takker Chao-Jun Li ved Model Animal Research Center, Nanjing University for massespektrometrianalyse. Vi takker Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa og nåværende forskere ved Model Animal Research Center, Nanjing University og Greehey Children's Cancer Research Institute for deres nyttige diskusjon, eksperimentell veiledning og reagenser. Vi takker Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago og Dawn S. Chandler for sine sjenerøse gaver av reagenser. Y.N. ble støttet av Jiangsu-provinsen ''Double- First-Class'' Construction Fund, Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Jiangsu-provinsen16 th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu-provinsen "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) og National Natural Science Foundation i Kina (31970665). Denne studien ble delvis støttet av NCI-stipendet R21 CA205659.

1. Cellekultur og retrovirustransfeksjon av pBabe-EYFP-CENP-A konstruksjoner
MERK: EYFP-CENP-A uttrykkes fra pBabe-EYFP-CENP-A på et lignende proteinnivå til endogene CENP-A. Totalt cellulærT CENP-A-protein erstattes med dette EYFP-CENP-A etter forstyrrelsen av CENP-A-/F allele av Cre recombinase som i RPE-1 CENP-A-/- celler6.
<ol><li>Tilberedning av supernatant som inneholder retrovirus ved hjelp av 293T emballasjeceller.<ol>
<li>Dag 0: Spre 293T emball...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Her beskrev vi metoder for massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at EYFP-merkingen induserer ubiquitylation ved en annen lysin i CENP-A K124R mutert protein8. I våre resultater identifiserte vi vellykket ubiquitylation på lysin 306 (K306) i EYFP-CENP-A K124R, som tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A gjennom massespektrometrianalyse. Massespektrometrianalysen som er beskrevet her, er en etterligningsmetode som vi tidligere identifiserer...

I de fleste eukaryoter må spindelmikrobuler festes til en enkelt region av hvert kromosom, betegnet som centromere. Kinetochore er et kompleks av proteiner som ligger på centromere. Å studere tidspunktet for centromere og kinetochore protein bevegelser og strukturen av kinetokores og centromeres er viktig for å forstå kromosom ustabilitet (CIN) og kreftprogresjon. De viktigste spørsmålene er hvordan kromosomplasseringen og funksjonen til en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og hvordan de deltar i nøyaktig kromosomsegregering. I de fleste arter definerer tilstedeværelsen av et spesielt nukleosom som inneholder et bestemt histonelignende protein kalt CENP-A centromere-identiteten. Derfor er det foreslått at CENP-A er ikke-DNA-indikatoren (epigenetisk merke) av centromere identitet. Det er viktig å belyse mekanismen for hvordan CENP-A definerer centromere identitet hos mennesker.
Holliday junction recognition protein (HJURP) er CENP-A-spesifikk chaperon som deponerer CENP-A i centromeriske nukleosomer1,2,3. Vi har tidligere rapportert at CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase er nødvendig for CENP-A ubiquitylation på lysin 124 (K124) og centromere lokalisering4. Våre resultater viste også at centromere rekruttering av nylig syntetisert CENP-A krever pre-eksisterende ubiquitylated CENP-A5. Dermed ble det gitt en modell som tyder på at CENP-A ubiquitylation er arvet gjennom dimerisering mellom celledelinger.
I motsetning til våre funn og de av Yu et al., negative resultater om CENP-A og dens centromeric lokalisering ble nylig publisert6. Artikkelen hevdet at CENP-A modifikasjoner på lysin 124 (K124) er unnværlig for etablering, vedlikehold, og langsiktig funksjon av menneskelige centromeres, basert på deres negative resultater som viser at mutasjonen av K124R ikke påvirket CENP-A centromere lokalisering verken celle levedyktighet6. Det er imidlertid nok plass til debatt i sine resultater og konklusjoner, og vi har allerede beskrevet hvilket problem det kan være i deres tidligere publikasjon7. Det bør tas hensyn til at de smeltet sammen proteiner med CENP-A, som har mye større molekylvekter enn størrelsen på endogene CENP-A: f.eks, smeltet de ~ 30 kDa forbedret gult fluorescerende protein (EYFP) til ~ 16 kDa CENP-A og analysert EYFP-CENP-A K124R fusjonsprotein i deres RPE-1 CENP-A-/F knockout system. K124 ubiquitin forventes ikke å binde direkte til HJURP basert på strukturelle spådommer4,men tillegg av mono-ubiquitin er spådd å ha en innvirkning på proteinkonformasjon av CENP-A. Proteinet av CENP-A-konformasjon kan endres ved tilstedeværelse av et stort fusjonsprotein, og denne konformasjonsendringen kan maskere de strukturelle endringene forårsaket av tap av ubiquitylation. Vi foreslår at fusjonen av store proteiner induserer ubiquitylation ved en annen lysin enn K124 i EYFP-CENP-A K124R mutant og denne ubiquitylation på et annet sted hemmer / masker den opprinnelige K124R enkelt mutert fenotype. Bevis for at ubiquitylation forekommer ved forskjellige lysin i CENP-A K124R mutert protein med et stort tag protein (EYFP) ble rapportert i vår forrige publikasjon8. Det ble funnet at EYFP-merking induserer ubiquitination av et annet lysin sted av EYFP-CENP-A K124R og at EYFP-CENP-A K124R mutant binder seg til HJURP. Som et resultat hemmer denne ubiquitylasjonen på et annet sted centromere lokalisering (vi brukte og sammenlignet pBabe-EYFP-CENP-A WT og K124R mutant, sammen med pbaba-EYFP-kontroll.). Resultatene viste at Flagg-merket eller ukodet CENP-A K124R mutanter er dødelige, men kan reddes av en monoubiquitin fusjon, noe som tyder på at CENP-A ubiquitylation er uunnværlig for celle levedyktighet.
I de senere årene har mange studier utviklet forskjellige analyser for å identifisere posttranslational modifikasjoner (PTMs) av CENP-A protein og andre centromere-kinetochore proteiner både in vivo og in vitro9,10,11. Analog med PTMs av histone proteiner som er en viktig mekanisme som regulerer funksjonen av kromatin, PTMs av centromeric kromatin komponenter er også involvert i en viktig mekanisme for å regulere den generelle strukturen og funksjonen til centromeres. De fleste CENP-A PTM-nettsteder er spesifikke for CENP-A-inneholdende nukleosomer, selv om noen av dem er bevart i histone H3, noe som tyder på at endring av disse rester bidrar til centromere-spesifikk funksjon. PTMs av CENP-A inkludert fosforylering, acetylering, metylering og ubiquitylation ble tidligere rapportert9, noe som tyder på at CENP-A er utsatt for en rekke PTMs og deres kombinatoriske arrays på sin aminoterminus og C-terminus histone-fold domene. Betydningen av CENP-A-modifikasjoner i flere funksjoner ble avslørt av mange grupper, inkludert vår. Disse funksjonene innebærer CENP-A deponering ved centromeres, proteinstabilitet og rekruttering av CCAN (konstitutiv centromere-assosiert nettverk)9. Imidlertid er begrensede studier og funn av CENP-A PTMer forhåndsformet hvor sammenligninger er gjort med en av kanoniske histoner som direkte eller indirekte regulerer deres funksjon. Tekniske rapporter som fokuserer på metodikken for å identifisere disse CENP-A PTMer er også begrenset.
Fordi CENP-A ubiquitylation er nødvendig for CENP-A deponering på centromere12, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling5, og uunnværlig for celle levedyktighet8, metoden for å identifisere CENP-A ubiquitylation ville være avgjørende i fremtiden for å studere funksjonell aktivitet, posisjonering, og struktur av centromere. Derfor beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at EYFP-merkingen induserer ubiquitylation ved en annen lysin i CENP-A K124R mutert protein8. Protokoller for andre kontrollanalyser og analyser (immunofluorescensanalyse, koloniutvekstanalyse og in vivo ubiquitylation analyse) presenteres også for å diskutere utfallet av store massespektrometrianalyse riktig.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Å studere strukturen og dynamikken i kinetokore og centromeres er viktig for å forstå kromosomusustabilitet (CIN) og kreftprogresjon. Hvordan kromosomplasseringen og funksjonen til en centromere (dvs. centromere identitet) bestemmes og delta i nøyaktig kromosomsegregering er et grunnleggende spørsmål. CENP-A foreslås å være ikke-DNA-indikatoren (epigenetisk merke) av centromere identitet, og CENP-A ubiquitylation er nødvendig for CENP-A deponering på centromere, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling, og uunnværlig for celle levedyktighet.
Her beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-CENP-A K124R mutant som tyder på at ubiquitylation ved en annen lysin induseres på grunn av EYFP-merking i CENP-A K124R mutert protein. Lysin 306 (K306) ubiquitylation i EYFP-CENP-A K124R ble identifisert, noe som tilsvarer lysin 56 (K56) i CENP-A gjennom massespektrometrianalyse. En påminnelse diskuteres ved bruk av GFP/EYFP eller merking av protein med høy molekylvekt som et verktøy for å analysere funksjonen til et protein. Gjeldende tekniske grense er også diskutert for påvisning av ubiquitylated band, identifisering av stedsspesifikke ubiquitylation(s), og visualisering av ubiquitylation i levende celler eller en bestemt enkeltcelle under hele cellesyklusen.
Metoden for massespektrometrianalyse presentert her kan brukes på menneskelig CENP-A protein med forskjellige koder og andre centromere-kinetochore proteiner. Disse kombinatoriske metodene bestående av flere analyser/analyser kan anbefales for forskere som er interessert i å identifisere funksjonelle roller i ubiquitylation.

EYFP-CENP-A K124 mutant viser ubiquitylation, interaksjon med HJURP, og ingen feil i centromere lokalisering verken celle dødelighet. Her ble systemet rapportert av Fachinetti et al. (2017)6 ombygd: i diploid menneskelige (RPE-1) celler som bærer en forstyrret og en ''floxed'' CENP-A allele (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A ble uttrykt fra pBabe-EYFP retro vectorvirus. I dette systemet kan uttrykket av endogene CENP-A fra CENP-A-/F allele ...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation er et viktig krav for CENP-A deponering ved centromere, arvet gjennom dimerisering mellom celledeling, og uunnværlig for celle levedyktighet. Her beskriver vi massespektrometrianalyse for å identifisere ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A) protein.

Massespektrometrianalyse for å identifisere Ubiquitylation av EYFP-merket CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Denne metoden gjør det mulig å identifisere ubiquityation av EYFP-merket CENP-A protein. Det kan også brukes på humant CENP-A protein med forskjellige tester og andre proteiner. Den største fordelen med dette er at den kan brukes til å identifisere EYFP CENP-A K124R allestedsnærværende steder med avgjørende biologisk betydning.Det kan utvides til å undersøke post-translational modifikasjoner av et bredt spekter av funksjonelle proteiner. Begynn med å forberede protein A perler bundet med anti-GFP antistoff. Vask 25 mikroliter protein A perler per immunforebutningsreaksjon med buffer A1 minst tre ganger for å fjerne etanol.Lag deretter en 50% perleløsning med buffer A1. Tilsett to mikroliter anti-GFP antistoff til perlene. Deretter legger buffer A1 til 20 ganger netto perlevolum. Utfør ende-til-ende rotasjon ved fire grader Celsius i fire til 18 timer.Den optimale varigheten for rotasjonen må bestemmes empirisk basert på effektiviteten av immunforebukkingen. Etter rotasjonen sentrifuger perlene på 100 ganger g i ett minutt og fjern det ubundne supernatant. Legg til buffer A1 for å lage en 50% løsning av perler og bruk 25 mikroliter av denne løsningen for hver immunprecipitation reaksjon.For å utføre immunforeinstallasjonen, lyse celler i buffer A1 via sonikering og fryse / tine. Mål proteinkonsentrasjoner og normaliser proteinmengdene blant de forskjellige IP-prøvene. Fjern deretter 5 % av eksemplet fra hvert rør for å kjøre på SDS-siden.Bland resten av lysatet med 25 mikroliter protein A perler bundet til anti-GFP antistoff og utfør ende-til-ende rotasjon ved fire grader Celsius i fire til 18 timer. Etter lysing av celler i buffer A og utført immunforeføring som tidligere beskrevet, må du beholde 10 % av de totale immunforekomstene for å bekrefte EYFP CENP-A ubiquityation og nøyaktig bestemme posisjonen til ubiquityated EYFP CENP-A. Bruk de andre 90%for massespektrometrianalyse.Kjør massespektrometriprøven i en kommersielt tilgjengelig 4-12% Bis-Tris proteingel. Utfør deretter Coomassie blå flekker og avgiftsdirektoratet 50-70 kilodalton gel regionen for massespektrometri analyse. Terninger hver gel skive i små biter og plassere dem i en 0,5 milliliter lav protein binding tube.Vask gelbitene med 100 mikroliter på 50% acetonitril i 25 millimolar ammoniumbikarbonat. Vortex dem i 10-15 minutter. Deretter spinner du dem ned og kaster det overnaturlige.Etter siste vask tørker du gelbitene med en benkeplatevakuumkonsentrator i 30 minutter. Tilsett 10 mikroliter på 10 nanogram per mikroliter sekvenseringsgrad trypsin og la gelbitene rehydrere i fem minutter. Tilsett deretter 25 millimolar ammoniumbikarbonat, akkurat nok til å dekke gelbitene og fordøye dem ved 37 grader Celsius over natten.På neste dag, overfør det fordøyde supernatantet til et rent 0,65 milliliter silikonisert rør og tilsett 50% acetonitril og 5% maursyreløsning. Vortex prøven i 10 minutter. Deretter spinner du det ned og overfører supernatanten til et ekstraksjonsrør.Konsentrer prøven igjen til to mikroliter. Tilsett deretter åtte mikroliter med 3% acetonitril og 2% maursyreoppløsning. Vortex det i 15 minutter og spinn den ned på 16, 000 ganger g i 30 minutter.Utfør MS-datainnsamling med LC-MS/MS ved hjelp av et flytende kromatografisystem kombinert med et massespektrometriinstrument. Injiser åtte mikroliter av prøven i en omvendt fase flytende kromatografikolonne og skill peptidene med en 2-80% gradient av løsningsmiddel B på 60 minutter etter manuskriptretninger. Samle inn massespektrometridata ved hjelp av den dataavhengige anskaffelsesmodusen.Åpne den kommersielle programvaren for å analysere massespektrometridata på skrivebordet. Hvis du vil starte et nytt søk, klikker du på LC-knappen øverst på menyen. Klikk deretter på Legg til-knappen for å laste opp de opprinnelige MS Raw-datafilene.Velg menneskelig protein-ID i paragonmetoden som databasesøkemetode og søk i de opprinnelige MS-rådatafilene mot UniProt homo sapiens-databasen. Velg trypsin som fordøyelsesenzym og sett resten av parametrene i henhold til manuskriptretninger. Skriv inn resultatfilnavnet, og klikk på Lagre som-knappen til høyre for menyen.Velg deretter en mappe for lagring av søkeresultatene og klikk på lagre-knappen. Klikk prosessknappen for å starte søket. Når søket er avsluttet, lagres data med det angitte søkenavnet automatisk i den valgte mappen.For å få MS / MS spectra av et bestemt peptid, åpne søkeresultatene i programvare F.Klikk deretter på proteinet i proteinlisten i toppmenyen og klikk på peptid i midtmenyen. MS/MS for dette peptidet vises nederst i menyen. Hvis du vil eksportere og lagre MS/MS-spektraet, kopierer du spektraet og limer det inn i et passende filformat.Genkonstruksjoner av EYFP CENP-A vill type eller K124R mutant som redder tapet av endogene CENP-A ble stabilt uttrykt når retroviral integrasjon ble utført. Uttrykket for endogene CENP-A ble ikke oppdaget syv dager etter induksjon av Cre recombinase. Både EYFP CENP-A vill type og K124R proteinuttrykk ble funnet å være på samme nivå som det første endogene CENP-A-proteinet.Både EYFP CENP-A vill type og K124R mutanter viste centromere lokalisering på syv dager etter forstyrrelsen av det gjenværende uttrykket av endogene CENP-A. EYFP CENP-A vill type og K124R mutant viste ubiquityation og interaksjon med HJURP i motsetning til tilfellet for flagget merket eller ukodet CENP-A vill type og K124R mutant. Cellelevelighet ble vurdert ved å utføre koloniens utvekstanalyse 14 dager etter forstyrrelsen av den gjenværende endogene CENP-A allele.Både EYFP CENP-A vill type og K124R mutanter viste et lignende antall reddet kolonier 14 dager etter forstyrrelsen av de resterende endogene CENP-A allele. IP massespektrometri avslørte ubiquityation ved lysin 306 i EYFP CENP-A K124R i CENP-A minus F-celler. Til sammen antydet disse resultatene at fusjonen av stort protein induserer ubiquitylering ved en annen lysin enn K124R i CENP-A som hemmer den opprinnelige K124R enkeltmuterte fenotypen.Når du prøver denne protokollen, bruk de kommersielt tilgjengelige 4%12% Bis-Tris proteingeler for å kjøre massespektrometriprøvene. Tilsett tilstrekkelig trypsin i gelbitene og rehydrere dem til alle enzymer er absorbert. Lavere molekylvektmerking eller sonderingsteknikk er faktisk nødvendig for å visualisere ubiquitylering og undersøke romlig temporal proteinubiquityation signalering på og hele organismenivåer.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amid Hydrogen / Deuterium Utveksling &amp; MALDI-TOF massespektrometri Analyse av Pak2 Activation

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Profilering tiol Redox Proteome Bruke Isotope Tagging massespektrometri

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Capture Compound massespektrometri - et kraftig verktøy for å identifisere Novel c-di-GMP Effector Proteiner

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

siRNA Screening for å identifisere Ubiquitin og Ubiquitin-lignende system regulatorer av biologiske mekanismer i dyrkede pattedyrceller

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Anrikning av Ekstracellulære Matrix Proteiner fra Vev og Fordøyelse inn Peptider for massespektrometrianalyse

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Anvendelser av Single-sonde: massespektrometri Imaging og enkelt celle analyse under omgivelses

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...