Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Agradecemos a Chao-Jun Li no Centro de Pesquisa Animal Modelo, Universidade de Nanjing pela análise de espectrometria em massa. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa e pesquisadores atuais do Centro de Pesquisa Animal Modelo, Nanjing University e Greehey Children's Cancer Research Institute por sua discussão útil, orientação experimental e reagentes. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago e Dawn S. Chandler por seus generosos presentes de reagentes. Y.N. foi apoiado pelo Fundo de Construção da Província de Jiangsu ''Double-First-Class'', Jiangsu Province Natural Science Fund (SBK2019021248), Província de Jiangsu 16th Six Big Talent Peaks Fund (TD-SWYY-001), Jiangsu Province "Foreign Expert Hundred Talents Program" Fund (SBK2019010048) e National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudo foi parcialmente apoiado pela subvenção nci R21 CA205659.

1. Cultura celular e transfecção retrovírus de construções pBabe-EYFP-CENP-A
NOTA: O EYFP-CENP-A é expresso a partir de pBabe-EYFP-CENP-A em nível de proteína semelhante ao CENP-A endógeno. A proteína CENP-A celular total é substituída por este EYFP-CENP-A após a interrupção do CENP-A-/F aleelo por Cre recombinase como em células RPE-1 CENP-A-/-6.
<ol><li>Preparação do supernatante contendo retrovírus usando células de embalagem 293T.<ol...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Aqui descrevemos métodos de análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Em nossos resultados, identificamos com sucesso a ubiquização na lysina 306 (K306) em EYFP-CENP-A K124R, que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. A análise de espectrometria de massa descrita aqui é ...

Na maioria dos eucariotes, os microtúbulos de fuso devem ser anexados a uma única região de cada cromossomo, denominado centômero. O kinetochore é um complexo de proteínas que estão localizadas no centromere. Estudar o tempo dos movimentos da proteína centrómera e da kinetochore e a estrutura de cinetochores e centromers é importante para a compreensão da instabilidade cromossomo (CIN) e da progressão do câncer. As principais questões são como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e como participam da segregação precisa do cromossomo. Na maioria das espécies, a presença de um nucleossomo especial contendo uma proteína específica semelhante a histona chamada CENP-A define a identidade do centromere. Portanto, propõe-se que o CENP-A seja o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade centromere. É importante elucidar o mecanismo de como o CENP-A define a identidade centrômera em humanos.
A proteína de reconhecimento de junção Holliday (HJURP) é o acompanhante específico do CENP-A que deposita CENP-A em nucleosósmos centréricos1,,2,,3. Já noticiamos anteriormente que o CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase é necessário para ubiquização CENP-A na lysina 124 (K124) e na localização do centromere4. Além disso, nossos resultados mostraram que o recrutamento centralizado do CENP-A recém-sintetizado requer ubiquização pré-existente CENP-A5. Assim, foi fornecido um modelo sugerindo que a ubiquização CENP-A é herdada por meio da dimerização entre as divisões celulares.
Em contraste com nossos achados e os de Yu et al., os resultados negativos relativos ao CENP-A e sua localização centromérica foram publicados recentemente6. O artigo alegou que as modificações do CENP-A na lysina 124 (K124) são dispensáveis para o estabelecimento, manutenção e função de longo prazo dos centrosmers humanos, com base em seus resultados negativos mostrando que a mutação do K124R não afetou a localização do centromere CENP-A nem a viabilidadecelular 6. No entanto, há espaço suficiente para debate em seus resultados e conclusões, e já descrevemos que problema poderia haver em sua publicação anterior7. Atenção deve ser dada que eles fundiram proteínas com CENP-A, que têm pesos moleculares muito maiores do que o tamanho do CENP-A endógeno: por exemplo, fundiram ~30 kDa proteína fluorescente amarela aumentada (EYFP) para ~16 kDa CENP-A e analisaram a proteína de fusão EYFP-CENP-A K124R em seu sistema de eliminação RPE-1 CENP-A-/F. A ubiquitina K124 não deverá se ligar diretamente ao HJURP com base nas previsões estruturais4, no entanto, prevê-se que a adição de mono-ubiquitina tenha um impacto na conformação proteica do CENP-A. A proteína da conformação CENP-A pode ser alterada pela presença de uma grande proteína de fusão, e essa mudança conformacional pode mascarar as alterações estruturais causadas pela perda da ubiquidade. Sugerimos que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma lise diferente do K124 no mutante EYFP-CENP-A K124R e esta ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R. Evidências de que a ubiquização ocorre em diferentes lisesinas na proteína mutante CENP-A K124R com uma grande proteína de etiqueta (EYFP) foi relatada em nossa publicação anterior8. Verificou-se que a marcação EYFP induz a ubiquização de outro local de lise de EYFP-CENP-A K124R e que o mutante EYFP-CENP-A K124R se liga ao HJURP. Como resultado, essa ubiquização em outro local inibe/mascara o fenótipo mutante original K124R, e tanto os mutantes EYFP-CENP-A WT e K124R mostraram localização de centromere (usamos e comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT e K124R mutantes, juntamente com pBabe-EFPYFP control.). Os resultados demonstraram que os mutantes CENP-A K124R marcados por bandeiras são letais, mas podem ser resgatados por uma fusão de monoubiquidade, sugerindo que a ubiquização CENP-A é indispensável à viabilidade celular.
Nos últimos anos, muitos estudos desenvolveram diferentes ensaios para identificar modificações pós-transacionais (PTMs) da proteína CENP-A e outras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo quanto in vitro9,,10,,11. Análogos aos PTMs de proteínas histonas que são um dos principais mecanismos que regulam a função da cromatina, PTMs de componentes centromericos de cromatina também estão envolvidos em um mecanismo essencial para regular a estrutura geral e a função dos centromers. A maioria dos sítios CENP-A PTM são específicos para nucleosómos contendo CENP-A, embora alguns deles sejam conservados em histona H3, sugerindo que a modificação desses resíduos contribuem para a função específica do centromere. Os PTMs de CENP-A, incluindo fosforilação, acetilação, metilação e ubiquização foram relatados anteriormente9, sugerindo que o CENP-A é submetido a uma variedade de PTMs e suas matrizes combinatórias em seu domínio amino terminus e C-terminus histone-fold. A importância das modificações do CENP-A em múltiplas funções foi revelada por muitos grupos, incluindo o nosso. Essas funções envolvem deposição do CENP-A em centrosmers, estabilidade proteica e recrutamento da CCAN (rede constitutiva associada ao centromere)9. No entanto, estudos limitados e achados de PTMs CENP-A são pré-formados onde comparações são feitas com uma das histonas canônicas que regulam direta ou indiretamente sua função. Relatórios técnicos com foco na metodologia de identificação desses PTMs CENP-A também são limitados.
Como a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere12, herdada por dimerização entre a divisãocelular 5, e indispensável à viabilidade celular8,o método para identificar a ubiquização CENP-A seria essencial no futuro para estudar a atividade funcional, o posicionamento e a estrutura do centromere. Portanto, aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a marcação EYFP induz a ubiquização em uma ubiquização diferente na proteína mutante CENP-A K124R8. Protocolos de outros ensaios e análises de controle (análise de imunofluorescência, ensaio de crescimento de colônias e ensaio de onipresençação in vivo) também são apresentados para discutir o resultado da análise de espectrometria de massa corretamente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Estudar a estrutura e a dinâmica das cinetochores e centrosmers é importante na compreensão da instabilidade cromossômica (CIN) e da progressão do câncer. Como a localização cromossômica e a função de um centromere (ou seja, identidade centromere) são determinadas e participar da segregação precisa do cromossomo é uma questão fundamental. O CENP-A é proposto para ser o indicador não-DNA (marca epigenética) da identidade do centromere, e a ubiquização CENP-A é necessária para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular.
Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização do mutante EYFP-CENP-A K124R sugerindo que a ubiquização em uma lise diferente é induzida por causa da marcação do EYFP na proteína mutante CENP-A K124R. A ubiquização de Lysine 306 (K306) no EYFP-CENP-A K124R foi identificada com sucesso, o que corresponde à lise 56 (K56) no CENP-A através da análise de espectrometria de massa. Uma ressalva é discutida no uso de GFP/EYFP ou na marcação de proteína de alto peso molecular como ferramenta para analisar a função de uma proteína. Também é discutido o limite técnico atual para a detecção de bandas ubiquadas, identificação de ubiquização específica do local e visualização de ubiquização em células vivas ou uma única célula específica durante todo o ciclo celular.
O método de análise de espectrometria de massa aqui apresentado pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes tags e outras proteínas centromere-kinetochore. Esses métodos combinatórios que consistem em vários ensaios/análises poderiam ser recomendados para pesquisadores interessados em identificar funções funcionais de ubiquização.

O mutante EYFP-CENP-A K124 mostra ubiquização, interação com HJURP, e sem defeitos na localização do centromere nem letalidade celular. Aqui o sistema relatado por Fachinetti et al. (2017)6 foi restituído: em células humanas diploides (RPE-1) transportando uma interrompida e uma alelo CENP-A (CENP-A-/F),EYFP-CENP-A foi expressa do vetor retrovírus pBabe-EYFP. Neste sistema, a expressão do CENP-A endógeno do CENP-A-/F alel...

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

A ubiquização CENP-A é um importante requisito para a deposição do CENP-A no centromere, herdada por dimerização entre divisão celular e indispensável à viabilidade celular. Aqui descrevemos a análise da espectrometria em massa para identificar a ubiquização da proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) marcada pela EYFP.

Análise de espectrometria de massa para identificar a ubiquização do CENP-A marcado pelo EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Este método permite identificar a ubiquização da proteína CENP-A marcada pela EYFP. Também pode ser aplicado à proteína CENP-A humana com diferentes testes e outras proteínas. A principal vantagem disso é que ele pode ser usado para identificar locais onipresentes EYFP CENP-A K124R com significado biológico crucial.Poderia ser estendido para investigar as modificações pós-translacionais de uma ampla gama de proteínas funcionais. Comece preparando proteínaSas a amarradas com anticorpo anti-GFP. Lave 25 microliters de proteína A contas por reação de imunoprecipitação com tampão A1 pelo menos três vezes para remover o etanol.Em seguida, faça uma solução de contas de 50% com buffer A1. Adicione dois microliters de anticorpo anti-GFP às contas. Em seguida, adicione o buffer A1 a 20 vezes o volume líquido de contas. Realize rotação de ponta a ponta a quatro graus Celsius durante quatro a 18 horas.A duração ideal para a rotação deve ser determinada empiricamente com base na eficiência da imunoprecipitação. Após a rotação, centrifufique as contas a 100 vezes g por um minuto e remova o supernatante sem saída. Adicione o buffer A1 para fazer uma solução de 50% de contas e use 25 microliters desta solução para cada reação de imunoprecipitação.Para realizar a imunoprecipitação, as células de lise no buffer A1 através da sônicação e congelam/descongelam. Medir concentrações proteicas e normalizar as quantidades de proteína entre as diferentes amostras de IP. Em seguida, remova 5% da amostra de cada tubo para ser executada na página SDS.Misture o resto do liseto com 25 microlitadores de proteína A contas ligadas ao anticorpo anti-GFP e realize rotação de ponta a ponta a quatro graus Celsius por quatro a 18 horas. Após a lise de células no buffer A e a realização de imunoprecipitação como descrito anteriormente, mantenha 10% do total de imunoprecipitantes para confirmar a ubiquização EYFP CENP-A e determinar precisamente a posição do CENP-A ubinciado ubiquílico. Use os outros 90% para análise de espectrometria de massa.Execute a amostra de espectrometria de massa em um gel de proteína Bis-Tris comercialmente disponível de 4-12%. Em seguida, realize a coloração azul Coomassie e extirpar a região de gel de 50-70 kilodalton para análise de espectrometria de massa. Pique cada fatia de gel em pequenos pedaços e coloque-os em um tubo de ligação de baixa proteína de 0,5 mililitro.Lave as peças de gel com 100 microlitadores de 50% de acetonitrilo em 25 milimônios bicarbonato de amônio. Vórtice por 10-15 minutos. Em seguida, gire-os para baixo e descarte o supernante.Após a última lavagem, seque as peças de gel com um concentrador de vácuo superior de banco por 30 minutos. Adicione 10 microliters de 10 nanogramas por trippsina de grau de sequenciamento microliter e deixe as peças de gel se reidratar por cinco minutos. Em seguida, adicione 25 milimônios bicarbonato, apenas o suficiente para cobrir as peças de gel e digeri-las a 37 graus Celsius durante a noite.No dia seguinte, transfira o supernanato digerido para um tubo silício limpo de 0,65 mililitro e adicione 50% de acetonitrila e 5% solução de ácido fórmico. Vórtice a amostra por 10 minutos. Em seguida, gire-o para baixo e transfira o supernante em um tubo de extração.Concentre a amostra novamente em dois microliters. Em seguida, adicione oito microliters de 3%de acetonitrila e 2% solução de ácido fórmico. Vórtice por 15 minutos e gire-o para baixo a 16.000 vezes g por 30 minutos.Realize a aquisição de dados de MS com LC-MS/MS utilizando um sistema de cromatografia líquida aliado a um instrumento de espectrometria de massa. Injete oito microliters da amostra em uma coluna de cromatografia líquida de fase inversa e separe os peptídeos com um gradiente de 2-80% de solvente B em 60 minutos após as instruções do manuscrito. Colete dados de espectrometria em massa usando o modo de aquisição dependente de dados.Abra o software comercial para analisar dados de espectrometria em massa na área de trabalho. Para iniciar uma nova pesquisa, clique no botão LC no menu superior. Em seguida, clique no botão adicionar para carregar os arquivos de dados brutos ms originais.Selecione o ID de proteína humana no método de paragon como o método de pesquisa de banco de dados e pesquise os arquivos originais de dados brutos do MS contra o banco de dados UniProt homo sapiens. Selecione trippsina como enzima de digestão e defina o resto dos parâmetros de acordo com as instruções do manuscrito. Digite o nome do arquivo de resultados e clique no botão salvar como botão à direita do menu.Em seguida, selecione uma pasta para armazenar os resultados de pesquisa e clique no botão salvar. Clique no botão de processo para iniciar a pesquisa. Após o término da pesquisa, os dados com o nome de pesquisa inserido serão armazenados automaticamente na pasta selecionada.Para obter espectros de MS/MS de qualquer peptídeo específico, abra os resultados da pesquisa no software F.Em seguida, clique na proteína na lista de proteínas no menu superior e clique no peptídeo no menu do meio. O MS/MS deste peptídeo aparecerá na parte inferior do menu. Para exportar e salvar o espectro MS/MS, copie o espectro e cole-o em um formato de arquivo adequado.Construções genéticas do tipo selvagem EYFP CENP-A ou mutante K124R que resgata a perda do CENP-A endógeno foram expressas com facadas quando a integração retroviral foi realizada. A expressão do CENP-A endógeno não foi detectada sete dias após a indução de Cre recombinase. Tanto o tipo selvagem EYFP CENP-A quanto a expressão proteica K124R foram encontrados em um nível semelhante à proteína CENP-A endógena inicial.Tanto os mutantes EYFP CENP-A quanto os mutantes K124R mostraram localização de centmere aos sete dias após o rompimento da expressão remanescente do CENP-A endógeno. O tipo selvagem EYFP CENP-A e o mutante K124R mostraram ubiquização e interação com HJURP ao contrário do caso para o tipo selvagem CENP-A marcado ou não e o mutante K124R. A viabilidade celular foi avaliada pela realização do ensaio de crescimento da colônia 14 dias após o rompimento do alelo CENP-A endógeno restante.Tanto os mutantes EYFP CENP-A quanto os mutantes K124R mostraram um número semelhante de colônias resgatadas 14 dias após o rompimento do alelo CENP-A endógeno restante. A espectrometria de massa IP revelou a ubiquização na lysina 306 em EYFP CENP-A K124R em células CENP-A menos F. Todos juntos, esses resultados sugeriram que a fusão de proteínas de grande porte induz a ubiquização em uma linfótipo diferente do K124R no CENP-A que inibe o fenótipo mutante único K124R original.Ao tentar este protocolo, use os géis de proteína Bis-Tris disponíveis comercialmente 4%12% para executar as amostras de espectrometria de massa. Adicione trippsina adequada às peças de gel e reidrate-as até que todas as enzimas tenham sido absorvidas. A técnica de marcação ou sondagem de menor peso molecular é realmente necessária para visualizar a ubiquização e investigar a sinalização de ubiquização de proteínas temporais espaciais nos níveis e inteiros do organismo.

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

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