Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Мы благодарим Чао-Джун Ли в Центре исследований моделей животных, Нанкинский университет для анализа масс-спектрометрии. Мы благодарим Янмини Далал, Тацуо Фукагава и нынешних исследователей из Центра исследований проблем животных, Нанкинского университета и Детского научно-исследовательского института рака Грейхи за их полезное обсуждение, экспериментальное руководство и реагенты. Мы благодарим Дона У. Кливленда, Даниэле Фачинетти, Янмини Далала, Мина Буя, Густаво В. Леоне, Джона Томпсона, Лоуренса С. Киршнера, Амруту Аштекар, Бена Э. Блэка, Гленниса А. Логсдона, Кэндзи Таго и Дон С. Чендлера за их щедрые подарки реагентов. Y.N. была поддержана Цзянсу провинции "двойной первый класс" Строительный фонд, Цзянсу провинции естественных наук фонда (SBK2019021248), провинция Цзянсу16-й Шесть больших талантов Пики фонда (TD-SWYY-001), провинция Цзянсу "Иностранный эксперт Сто талантов программа" Фонд (SBK2019010048), и Национальный фонд естественных наук в Китае (31970665). Это исследование было частично поддержано грантом NCI R21 CA205659.

1. Культура клеток и ретровирусная трансфекция конструкций pBabe-EYFP-CENP-A
ПРИМЕЧАНИЕ: EYFP-CENP-A выражается от pBabe-EYFP-CENP-A на аналогичном уровне белка до эндогенного CENP-A. Общий клеточный белок CENP-A заменяется этим EYFP-CENP-A после нарушения CENP-A-/F аллеля кре рекомбиназа, как в RPE-1 CENP-A...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Здесь мы описали методы анализа масс-спектрометрии для выявления повсеместного EYFP-CENP-A K124R мутант, предполагая, что EYFP пометки вызывает вездесущность на другой лизин в CENP-A K124R мутант белка8. В наших результатах мы успешно определили повсеместное ubiquitylation на лизине 306 (K306) в EYFP-C...

В большинстве эукариот, спиндельные микротрубочки должны прикрепляться к одной области каждой хромосомы, называется центрометр. Кинетохор представляет собой комплекс белков, которые расположены в центрометре. Изучение времени движения центрального и кинетохорного белка и структуры кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания нестабильности хромосом (CIN) и прогрессирования рака. Ключевыми вопросами являются то, как определяются хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) и как они участвуют в точной хромосомной сегрегации. У большинства видов наличие специального нуклеосомы, содержащего специфический гистоноподобный белок под названием CENP-A, определяет центральномерную идентичность. Поэтому предполагается, что CENP-A является индикатором не ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности. Важно выяснить механизм того, как CENP-A определяет центрометрию идентичности у людей.
Холлидей соединения распознавания белка (HJURP) является CENP-A-специфический сопровождатель, который депозиты CENP-A в центрометрических нуклеосом1,2,3. Ранее мы сообщали, что CUL4A-RBX1-COPS8 E3 лигаза необходима для CENP-A вездесущность на лизине 124 (K124) и центрромной локализации4. Кроме того, наши результаты показали, что центрометричный набор вновь синтезированных CENP-A требует уже существующих вездесущих CENP-A5. Таким образом, была представлена модель, предполагающая, что вездесущность CENP-A наследуется путем димеризации между делениями клеток.
В отличие от наших выводов и выводов Yu et al., отрицательные результаты относительно CENP-A и его центрометрической локализации были недавно опубликованы6. В статье утверждалось, что ceNP-A изменения на лизине 124 (K124) являются необязательными для создания, обслуживания и долгосрочной функции человеческих центромерес, на основе их негативных результатов, показывающих, что мутация K124R не влияет на локализацию CENP-A centromere ни жизнеспособность клеток6. Тем не менее, есть достаточно места для обсуждения в их результатах и выводах, и мы уже описали, какая проблема может быть в их предыдущей публикации7. Следует обратить внимание на то, что они сплавили белки с CENP-A, которые имеют гораздо большие молекулярные веса, чем размер эндогенного CENP-A: например, они сплавили 30 кДа повышенного желтого флуоресцентного белка (EYFP) до 16-/F kDa CENP-A и проанализировали EYFP-CENP-A K124R в их протеине слияния Е.1. K124 убиквитин, как ожидается, не связывать непосредственно с HJURP на основе структурных прогнозов4, однако, добавление моно-убиквитин, по прогнозам, будет иметь влияние на протеиновую конформацию CENP-A. Белок конформации CENP-A может быть изменен наличием большого синтезного белка, и это конформационное изменение может замаскировать структурные изменения, вызванные потерей вездесущности. Мы предполагаем, что слияние крупногабаритного белка вызывает повсеместное распространение в лизине, кроме K124 в EYFP-CENP-A K124R мутант и это вездесущность на другом сайте ингибирует / маски оригинального K124R одного мутанта фенотипа. Доказательства того, что вездесущность происходит при различных лизинах в CENP-A K124R мутантный белок с большим протеином тега (EYFP) было сообщено в нашей предыдущей публикации8. Было установлено, что пометка EYFP вызывает повсеместное распространение другого лизинового сайта EYFP-CENP-A K124R и что мутант EYFP-CENP-A K124R связывается с HJURP. В результате, эта вездесущность на другом сайте ингибирует/маски оригинального фенотипа-мутанта K124R, и оба мутанта EYFP-CENP-A WT и K124R показали центрометрию локализации (мы использовали и сравнивали pBabe-EYFP-CENP-A WT и K124R-мутант, вместе с контролем pBabe-EYFP). Результаты показали, что помеченные флагом или немаркированные CENP-A K124R мутанты смертельно опасны, но могут быть спасены моноубиквитином синтезом, что свидетельствует о том, что вездесущение CENP-A является необходимым для жизнеспособности клеток.
В последние годы, многие исследования разработали различные анализы для выявления постпереводных модификаций (PTMs) белка CENP-A и других центрально-кинетохоровых белков как in vivo и in vitro9,10,11. По аналогии с ПТС гистоновых белков, которые являются основным механизмом, регулирующим функцию хроматина, ПТМ центрометрических компонентов хроматина также участвуют в важном механизме регулирования общей структуры и функции центрометров. Большинство сайтов CENP-A PTM специфичны для ceNP-A-содержащих нуклеосом, хотя некоторые из них сохраняются в гистон H3, что свидетельствует о том, что модификация этих остатков способствует функции центрометра. PTMs CENP-A, включая фосфорилирование, ацетилирование, метилирование, и вездесущность были ранее сообщалось9, предполагая, что CENP-A подвергается различным ПТМ и их комбинаторных массивов на его аминокислотной конечной и C-термин гистон-фолд домена. Важность модификаций CENP-A в различных функциях была выявлена многими группами, включая нашу. Эти функции включают осаждение CENP-A на центромерах, стабильность белка, и набор CCAN (составная центрометрическая связанная сеть)9. Тем не менее, ограниченные исследования и выводы CENP-A PTMs заранее, где сравнения сделаны с одним из канонических гистонов, которые прямо или косвенно регулируют их функцию. Технические доклады, посвященные методологии выявления этих ПТС CENP-A, также ограничены.
Потому что CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A в центрометре12, унаследованной через димеризацию между делением клеток5, и необходимым для жизнеспособности клеток8, метод для определения CENP-A вездесущность будет иметь важное значение в будущем для изучения функциональной активности, позиционирования и структуры центрометра. Поэтому здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ания мутанта EYFP-CENP-A K124R, предполагающего, что пометка EYFP вызывает убиквитирование в другом лизине в мутантном белке CENP-A K124R8. Протоколы других контрольных анализов и анализов (анализ иммунофлуоресценции, анализ нароста, и ин vivo ubiquitylation analysissay) также представлены для обсуждения результатов анализа крупной масс-спектрометрии должным образом.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Изучение структуры и динамики кинетохоров и центромер имеет важное значение для понимания хромосомной нестабильности (CIN) и прогрессирования рака. Как хромосомное расположение и функция центрометра (т.е. центрометрической идентичности) определяются и участвуют в точной хромосомной сегрегации является фундаментальным вопросом. CENP-A предлагается быть индикатором не-ДНК (эпигенетический знак) центрометрической идентичности, и CENP-A вездесущность требуется для осаждения CENP-A на центрроме, унаследованном через димеризацию между делением клеток, и незаменима для жизнеспособности клеток.
Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного eyFP-CENP-A K124R мутанта, предполагающего, что повсеместное распространение в другом лизине индуцируется из-за пометки EYFP в мутантном белке CENP-A K124R. Была успешно выявлена вездесущность Lysine 306 (K306) в EYFP-CENP-A K124R, что соответствует лизину 56 (K56) в CENP-A с помощью анализа масс-спектрометрии. Предостережение обсуждается при использовании GFP/EYFP или маркировке белка с высоким молекулярным весом в качестве инструмента для анализа функции белка. Текущий технический предел также обсуждается для обнаружения вездесущих полос, идентификации конкретного места вездесущности (ы), а также визуализации вездесущности в живых клетках или конкретной одной клетке в течение всего клеточного цикла.
Метод анализа масс-спектрометрии, представленный здесь, может быть применен к человеческому белку CENP-A с различными тегами и другими белками центрометрии. Эти комбинированные методы, состоящие из нескольких анализов/анализов, могут быть рекомендованы исследователям, заинтересованным в определении функциональных ролей вездесущности.

Мутант EYFP-CENP-A K124 показывает повсеместное распространение, взаимодействие с HJURP, и никаких дефектов в локализации центрометра ни летальности клеток. Здесь система, о которой сообщили Фачинетти и др. (2017)6 была переобочена: в диплоидных клетках человека (RPE-1) с одним н?...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A вездесущность является важным требованием для осаждения CENP-A в центрометре, унаследованного через димеризацию между делением клеток, и необходимым для жизнеспособности клеток. Здесь мы описываем анализ массовой спектрометрии для выявления повсеместного ирования белка CENP-A (EYFP-CENP-A).

Анализ масс-спектрометрии для выявления повсеместного ания метеоуожего тега CENP-A (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Этот метод позволяет определить повсеместность белка CENP-A с тегами EYFP. Он также может быть применен к человеческому белку CENP-A с различными тестами и другими белками. Основным преимуществом этого является то, что он может быть использован для выявления EYFP CENP-A K124R вездесущие сайты с критическим биологическим значением.Она может быть расширена для изучения пост-трансляционных модификаций широкого спектра функциональных белков. Начните с подготовки белка бисера связаны с анти-GFP антитела. Вымойте 25 микролитров белка А шарики на иммунопреципиентную реакцию с буфером А1 по крайней мере три раза, чтобы удалить этанол.Затем сделайте 50%-бисерное решение с буфером A1. Добавьте в бисер два микролитров антитела против GFP. Затем добавьте буфер A1 в 20 раз больше объема чистого шарика. Выполните постепенное вращение при четырех градусах по Цельсию в течение четырех-18 часов.Оптимальная продолжительность вращения должна определяться эмпирически на основе эффективности иммунопреципиентации. После вращения центрифуга бусы 100 раз г в течение одной минуты и удалите несъеверхающий супернатант. Добавьте буфер А1, чтобы сделать 50%-решение бисера и использовать 25 микролитров этого решения для каждой реакции иммунопреципиентации.Для выполнения иммунопреципиентации, лизировать клетки в буфере A1 через sonication и замораживания / оттепели. Измерьте концентрацию белка и нормализует количество белка среди различных образцов ИС. Затем удалите 5% образца из каждой трубки для запуска на странице SDS.Смешайте остальную часть лизата с 25 микролитров белка бусинки связаны с анти-GFP антитела и выполнять все-к-конец вращения на четыре градуса по Цельсию в течение четырех до 18 часов. После лизирования клеток в буфере А и выполнения иммунопреципиентации, как описано ранее, сохранить 10% от общего числа иммунопрециентов, чтобы подтвердить EYFP CENP-A повсеместности и точно определить положение вездесущности EYFP CENP-A. Используйте остальные 90% для анализа масс-спектрометрии.Вы запустите образец масс-спектрометрии в коммерчески доступных 4-12%Bis-Tris белковый гель. Затем выполните Coomassie голубое окрашивание и акциз 50-70 килодальтон гель области для анализа масс-спектрометрии. Нарезать каждый гель ломтиком на мелкие кусочки и поместить их в 0,5 миллилитров низким содержанием белка связывания трубки.Вымойте кусочки геля 100 микролитров 50%ацетонитрила в 25 миллимолярный бикарбонат аммония. Вихрь их в течение 10-15 минут. Затем спина их вниз и отказаться от супернатанта.После последней стирки высушите кусочки геля с помощью вакуумного концентратора на скамейке в течение 30 минут. Добавьте 10 микролитров по 10 нанограмм на микролитер секвенирования трипсина и дайте кусочкам геля регидратироваться в течение пяти минут. Затем добавьте 25 миллимолярия бикарбоната, как раз достаточно, чтобы покрыть кусочки геля и переварить их при 37 градусов по Цельсию в одночасье.На следующий день перенесите переваренный супернатант в чистую силиконовую трубку на 0,65 миллилитра и добавьте 50%ацетонитрил и 5%formic кислотный раствор. Вихрь образца в течение 10 минут. Затем закрути его вниз и перенесите супернатант в извлечения трубки.Сосредоточьте образец снова на два микролитера. Затем добавьте восемь микролитров 3%ацетонитрила и 2%formic кислотный раствор. Вихрь его в течение 15 минут и спина его вниз на 16000 раз г в течение 30 минут.Выполняйте сбор данных MS с помощью LC-MS/MS с помощью жидкой хроматографической системы в сочетании с инструментом масс-спектрометрии. Введи восемь микролитров образца в колонку жидкой хроматографии обратной фазы и разделив пептиды с 2-80%-градиентом растворителя В в течение 60 минут, следуя рукописным указаниям. Сбор данных о масс-спектрометрии с использованием режима приобретения, зависящего от данных.Откройте коммерческое программное обеспечение для анализа данных масс-спектрометрии на рабочем столе. Чтобы начать новый поиск, нажмите кнопку LC в верхнем меню. Затем нажмите кнопку добавления, чтобы загрузить исходные файлы необработанных данных MS.Выберите идентификатор человеческого белка в методе paragon в качестве метода поиска базы данных и ищите исходные файлы необработанных данных MS в базе данных UniProt homo sapiens. Выберите трипсин в качестве фермента пищеварения и установите остальные параметры в соответствии с рукописными направлениями. Введите имя файла результатов и нажмите кнопку сохранения справа от меню.Затем выберите папку для хранения результатов поиска и нажмите кнопку сохранения. Нажмите кнопку процесса, чтобы начать поиск. После окончания поиска данные с введенным именем поиска будут автоматически храниться в выбранной папке.Чтобы получить СПЕКТР MS/MS любого конкретного пептида, откройте результаты поиска в программном обеспечении F.Then нажмите на белок в списке белков в верхнем меню и нажмите на пептид в среднем меню. MS/MS этого пептида появится в нижней части меню. Для экспорта и сохранения спектра MS/MS скопировать спектры и вставить их в подходящий формат файла.Генные конструкции дикого типа EYFP CENP-A или мутанта K124R, который спасает потерю эндогенного CENP-A, были стабилико выражены при ретровирусной интеграции. Выражение эндогенной CENP-A не было обнаружено через семь дней после индукции Cre рекомбиназы. Было установлено, что и дикий тип EYFP CENP-A, и экспрессия белка K124R находятся на том же уровне, что и первоначальный эндогенный белок CENP-A.Как EYFP CENP-A дикого типа, так и мутанты K124R показали локализацию центромера через семь дней после нарушения оставшегося выражения эндогенного CENP-A. Дикий тип EYFP CENP-A и мутант K124R показали повсеместность и взаимодействие с HJURP в отличие от случая для помеченного помеченного или нетегированного дикого типа CENP-A и мутанта K124R. Жизнеспособность клеток оценивалась путем проведения анализа нарастание колонии через 14 дней после нарушения оставшегося эндогенного аллеля CENP-A.Как EYFP CENP-A дикий тип, так и мутанты K124R показали аналогичное количество спасенных колоний через 14 дней после нарушения оставшегося эндогенного аллеля CENP-A. Масс-спектрометрия ИС выявила повсеместность лизина 306 в EYFP CENP-A K124R в клетках CENP-A минус F. Все вместе эти результаты показали, что слияние крупносерийного белка вызывает повсеместное распространение на лизин, кроме K124R в CENP-A, который подавляет оригинальный один мутантный фенотип K124R.При попытке этого протокола, использовать коммерчески доступные 4%12%Bis-Tris белковые гели для запуска образцов масс-спектрометрии. Добавьте адекватный трипсин к кусочкам геля и регидратировать их до тех пор, пока все ферменты не будут поглощены. Более низкий молекулярный вес пометки или зондирования техники на самом деле требуется для визуализации повсеместности и исследовать пространственные временные повсеместности белка сигнализации на и весь уровень организма.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI пробоподготовки: ультра тонкий слой Метод

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Анализ Большие белковые комплексы структурных масс-спектрометрии

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

Т-волны ионной подвижности-масс-спектрометрии: Основные экспериментальные процедуры для комплексного анализа белков

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Прямой анализ отдельных клеток методом масс-спектрометрии при атмосферном давлении

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Амид водород / дейтерий бирже и MALDI-TOF масс-спектрометрии Анализ Pak2 активации

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Профилирование тиоловых Редокс Протеом Использование изотопной масс-спектрометрии тегов

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Захват соединения масс-спектрометрия - мощный инструмент для идентификации новых гр-ди-GMP эффекторных белков

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

миРНК Скрининг для идентификации Убиквитин и Убиквитин-подобной системе регуляторов биологических путей в культивируемых клетках млекопитающих

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Обогащение белков внеклеточного матрикса из тканей и пищеварения в пептидов для анализа масс-спектрометрии

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Применения с одним зондом: Масс-спектрометрия и цифровой обработки изображений Single Cell Анализ в условиях окружающей среды

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...