Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Agradecemos a Chao-Jun Li en el Model Animal Research Center de la Universidad de Nanjing por el análisis de espectrometría de masas. Agradecemos a Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa y a los investigadores actuales del Model Animal Research Center, Nanjing University y Greehey Children's Cancer Research Institute por su útil discusión, orientación experimental y reactivos. Agradecemos a Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago y Dawn S. Chandler por sus generosos dones de reactivos. Y.N. con el apoyo fue apoyado por el Fondo de Construcción de la Provincia de Jiangsu ''Doble- Primera Clase'', Fondo de Ciencias Naturales de la Provincia de Jiangsu (SBK2019021248), Fondo deSeis Picos de Talento Grande de la Provincia de Jiangsu (TD-SWYY-001), Fondo "Programa de Expertos Cien Talentos" de la Provincia de Jiangsu (SBK2019010048) y National Natural Science Foundation in China (31970665). Este estudio fue apoyado en parte por la subvención NCI R21 CA205659.

1. Cultivo celular y transfección de retrovirus de las construcciones pBabe-EYFP-CENP-A
NOTA: EYFP-CENP-A se expresa desde pBabe-EYFP-CENP-A a un nivel de proteína similar al CENP-A endógeno. La proteína CENP-A celular total se sustituye por esta EYFP-CENP-A después de la interrupción del alelo CENP-A-/F por Cre recombinase como en las células RPE-1 CENP-A-/-6.
<ol><li>Preparación del sobrenadante que contiene retrovirus utilizando células de envas...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Aquí describimos métodos de análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. En nuestros resultados, identificamos con éxito la ubiculación en lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en CENP-A a través del análisis de espectrometría de masas. El análisis de espectrometría de masas de...

En la mayoría de los eucariotas, los microtúbulos del husillo deben adherirse a una sola región de cada cromosoma, llamado centromere. El kinetochore es un complejo de proteínas que se encuentran en el centromere. Estudiar el momento de los movimientos de la proteína centromere y kinetochore y la estructura de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. Las preguntas clave son cómo se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y cómo participan en la segregación cromosómica precisa. En la mayoría de las especies, la presencia de un nucleosoma especial que contiene una proteína específica similar a la histona llamada CENP-A define la identidad centromere. Por lo tanto, se propone que el CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere. Es importante dilucidar el mecanismo de cómo CENP-A define la identidad centromere en los seres humanos.
La proteína de reconocimiento de unión Holliday (HJURP) es el chaperon específico de CENP-A que deposita CENP-A en nucleosomas centroméricos1,,2,,3. Hemos informado previamente que la ligasa CUL4A-RBX1-COPS8 E3 es necesaria para la ubiculación CENP-A en la lisina 124 (K124) y la localización de centromere4. Además, nuestros resultados mostraron que el reclutamiento de centromere de CENP-A recién sintetizado requiere una ubicuidad preexistente CENP-A5. Por lo tanto, se proporcionó un modelo que sugiere que la ubicuidad CENP-A se hereda a través de la dimerización entre divisiones celulares.
En contraste con nuestros hallazgos y los de Yu et al., los resultados negativos sobre el CENP-A y su localización centromérica se publicaron recientemente6. El artículo afirmaba que las modificaciones CENP-A en la lisina 124 (K124) son prescindibles para el establecimiento, mantenimiento y función a largo plazo de los centromeres humanos, basándose en sus resultados negativos que demuestran que la mutación de K124R no afectó a la localización del centromere CENP-A ni la viabilidad celular6. Sin embargo, hay suficiente margen para el debate en sus resultados y conclusiones, y ya hemos descrito qué problema podría haber en su publicación anterior7. Se debe prestar atención a que fusionaron proteínas con CENP-A, que tienen pesos moleculares mucho mayores que el tamaño de CENP-A endógeno: por ejemplo, fusionaron la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) de 30 kDa a 16 kDa CENP-A y analizaron la proteína de fusión EYFP-CENP-A K124R en su sistema RPE-1 CENP-A-/F knockout. No se espera que la ubiquitina K124 se una directamente al HJURP sobre la base de las predicciones estructurales4,sin embargo, se prevé que la adición de monoubiquitina tenga un impacto en la conformación proteica de CENP-A. La proteína de la conformación CENP-A puede ser cambiada por la presencia de una gran proteína de fusión, y este cambio conformacional puede enmascarar los cambios estructurales causados por la pérdida de ubiculación. Sugerimos que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de la K124 en el mutante EYFP-CENP-A K124R y esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único original K124R. La evidencia de que la ubicuidad ocurre en diferentes lisina en la proteína mutante CENP-A K124R con una proteína de etiqueta grande (EYFP) fue reportada en nuestra publicación anterior8. Se encontró que el etiquetado EYFP induce la ubiquitinación de otro sitio de lisina de EYFP-CENP-A K124R y que el mutante EYFP-CENP-A K124R se une a HJURP. Como resultado, esta ubiculación en otro sitio inhibe/enmascara el fenotipo mutante único K124R original, y tanto los mutantes EYFP-CENP-A WT como K124R mostraron localización de centromere (usamos y comparamos pBabe-EYFP-CENP-A WT y mutante K124R, junto con el control pBabe-EYFP.). Los resultados demostraron que los mutantes CENP-A K124R con etiqueta de bandera o sin etiquetar son letales, pero pueden ser rescatados por una fusión monoubiquitina, lo que sugiere que la ubicuidad CENP-A es indispensable para la viabilidad celular.
En los últimos años, muchos estudios han desarrollado diferentes ensayos para identificar las modificaciones posttranslacionales (PTM) de la proteína CENP-A y otras proteínas centromere-kinetochore tanto in vivo como in vitro9,,10,,11. Análogos a los PTM de las proteínas histonas que son un mecanismo importante que regula la función de la cromatina, los PTM de los componentes centroméricos de cromatina también participan en un mecanismo esencial para regular la estructura general y la función de los centromeros. La mayoría de los sitios CENP-A PTM son específicos de los nucleosomas que contienen CENP-A, aunque algunos de ellos se conservan en la histona H3, lo que sugiere que la modificación de estos residuos contribuye a la función específica del centromere. Las PTM de CENP-A, incluyendo la fosforilación, la acetilación, la metilación y la ubicuidad, se notificaron previamente9, lo que sugiere que CENP-A está sujeta a una variedad de TPM y sus matrices combinatorias en su dominio amino terminus y C-terminus histone-fold. La importancia de las modificaciones CENP-A en múltiples funciones fue revelada por muchos grupos, incluyendo el nuestro. Estas funciones implican la deposición CENP-A en los centromeres, la estabilidad proteica y el reclutamiento de la CCAN (red asociada al centromere constitutivo)9. Sin embargo, los estudios y hallazgos limitados de las PTM CENP-A se preforman cuando se realizan comparaciones con una de las histonas canónicas que regulan directa o indirectamente su función. Los informes técnicos centrados en la metodología para identificar estos PTM CENP-A también son limitados.
Debido a que se requiere la ubicuidad CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere12,heredada a través de la dimerización entre la división celular5,e indispensable para la viabilidad celular8, el método para identificar la ubiculación CENP-A sería esencial en el futuro para estudiar la actividad funcional, el posicionamiento y la estructura del centromere. Por lo tanto, aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que el etiquetado EYFP induce la ubiculación en una lisina diferente en la proteína mutante CENP-A K124R8. También se presentan protocolos de otros ensayos y análisis de control (análisis de inmunofluorescencia, ensayo de crecimiento de colonias y ensayo de ubicuidad in vivo) para discutir el resultado del análisis de espectrometría de masas importante correctamente.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

El estudio de la estructura y la dinámica de los quinetocoros y centromeres es importante para entender la inestabilidad cromosómica (CIN) y la progresión del cáncer. La forma en que se determina la ubicación cromosómica y la función de un centromere (es decir, identidad centromere) y participan en la segregación cromosómica precisa es una cuestión fundamental. Se propone que CENP-A sea el indicador no ADN (marca epigenética) de la identidad centromere, y se requiere la ubicuación CENP-A para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular.
Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación del mutante EYFP-CENP-A K124R sugiriendo que la ubicuidad en una lisina diferente se induce debido al etiquetado EYFP en la proteína mutante CENP-A K124R. Se identificó con éxito la ubiquilación de lisina 306 (K306) en EYFP-CENP-A K124R, que corresponde a la lisina 56 (K56) en el ANálisis de espectrometría de masas CENP-A. Una advertencia se discute en el uso de GFP/EYFP o el etiquetado de proteína de alto peso molecular como herramienta para analizar la función de una proteína. También se discute el límite técnico actual para la detección de bandas ubiquitidas, la identificación de la ubiculación específica del sitio y la visualización de la ubicuidad en células vivas o una sola célula específica durante todo el ciclo celular.
El método de análisis de espectrometría de masas presentado aquí se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes etiquetas y otras proteínas centromere-kinetochore. Estos métodos combinatorios que consisten en varios ensayos/análisis podrían recomendarse a los investigadores que estén interesados en identificar funciones funcionales de ubiculación.

El mutante EYFP-CENP-A K124 muestra ubiculación, interacción con HJURP y ningún defecto en la localización de centromere ni la letalidad celular. Aquí se re-constituyó el sistema reportado por Fachinetti et al. (2017)6: en células humanas diploides (RPE-1) que transportaban un interrumpido y un ''floxed'' CENP-A alelo (CENP-A-/F), EYFP-CENP-A se expresó desde el vector retrovirus pBabe-EYFP. En este sistema, la expresión de CENP-A endógeno de...

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

La ubicuidad CENP-A es un requisito importante para la deposición CENP-A en el centromere, heredada a través de la dimerización entre la división celular, e indispensable para la viabilidad celular. Aquí describimos el análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiculación de la proteína CENP-A (EYFP-CENP-A) etiquetada por EYFP.

Análisis de espectrometría de masas para identificar la ubiquitylación de CENP-A con etiqueta EYFP (EYFP-CENP-A)

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Este método permite identificar la ubiculación de la proteína CENP-A etiquetada por EYFP. También se puede aplicar a la proteína humana CENP-A con diferentes pruebas y otras proteínas. La principal ventaja de esto es que se puede utilizar para identificar EYFP CENP-A K124R sitios ubicuos con significado biológico crucial.Podría ampliarse para investigar las modificaciones post-traduccionales de una amplia gama de proteínas funcionales. Comience preparando las proteínas A cuentas unidas con anticuerpos anti-GFP. Lavar 25 microlitros de proteína A perlas por reacción de inmunoprecipitación con tampón A1 al menos tres veces para eliminar el etanol.A continuación, haga una solución de 50% de cordón con el búfer A1. Añadir dos microlitros de anticuerpos anti-GFP a las perlas. A continuación, agregue el búfer A1 a 20 veces el volumen neto del cordón. Realice una rotación de extremo a extremo a cuatro grados centígrados durante cuatro a 18 horas.La duración óptima de la rotación debe determinarse empíricamente en función de la eficiencia de la inmunoprecipitación. Después de la rotación, centrifugar las perlas a 100 veces g durante un minuto y retire el sobrenadante no enlazado. Añadir buffer A1 para hacer una solución del 50% de perlas y utilizar 25 microlitros de esta solución para cada reacción de inmunoprecipitación.Para realizar la inmunoprecipitación, licenciar las células en el tampón A1 a través de sonicación y congelación/descongelación. Mida las concentraciones de proteínas y normalice las cantidades de proteínas entre las diferentes muestras de IP. A continuación, retire el 5% de la muestra de cada tubo para que se ejecute en la página SDS.Mezclar el resto del anate con 25 microlitros de proteína A cuentas unidas a anticuerpos anti-GFP y realizar rotación de extremo a extremo a cuatro grados Celsius durante cuatro a 18 horas. Después de la eliminación de las células en el tampón A y la realización de la inmunoprecipitación como se ha descrito anteriormente, mantenga el 10% de los inmunoprecipitantes totales para confirmar la ubiculación EYFP CENP-A y para determinar con precisión la posición de EYFP CENP-A ubiquitida. Utilice el otro 90% para el análisis de espectrometría de masas.Ejecute la muestra de espectrometría de masas en un gel proteico 4-12%Bis-Tris disponible comercialmente. A continuación, realice la tinción azul de Coomassie e exprima la región de gel de 50-70 kilodalton para el análisis de espectrometría de masas. Corta cada rebanada de gel en trozos pequeños y colólas en un tubo de unión baja a proteínas de 0,5 mililitros.Lavar las piezas de gel con 100 microlitros de 50% acetonitrilo en bicarbonato de amonio de 25 milimolares. Vórtices durante 10-15 minutos. Luego gírelos hacia abajo y deseche el sobrenadante.Después del último lavado, seque las piezas de gel con un concentrador de vacío de sobremesa durante 30 minutos. Añadir 10 microlitros de 10 nanogramos por microlitros de grado de secuenciación de microlitros grado trippsina y dejar que las piezas de gel se rehidraten durante cinco minutos. A continuación, añadir 25 bicarbonato de amonio milimolar, lo suficiente para cubrir las piezas de gel y digerir a 37 grados Centígrados durante la noche.Al día siguiente, transfiera el sobrenadante digerido a un tubo siliconizado limpio de 0,65 mililitros y agregue 50%acetonitrilo y 5% solución de ácido fórmico. Vórtice la muestra durante 10 minutos. A continuación, gire hacia abajo y transfiera el sobrenadante a un tubo de extracción.Concentre la muestra de nuevo en dos microlitros. A continuación, agregue ocho microlitros de 3%acetonitrilo y 2%solución de ácido fórmico. Vórtice durante 15 minutos y gírtelo a 16.000 veces g durante 30 minutos.Realice la adquisición de datos MS con LC-MS/MS utilizando un sistema de cromatografía líquida junto con un instrumento de espectrometría de masas. Inyectar ocho microlitros de la muestra en una columna de cromatografía líquida de fase inversa y separar los péptidos con un gradiente de 2-80% de disolvente B en 60 minutos después de las instrucciones del manuscrito. Recopile datos de espectrometría de masas utilizando el modo de adquisición dependiente de datos.Abra el software comercial para analizar los datos de espectrometría de masas en el escritorio. Para iniciar una nueva búsqueda, haga clic en el botón LC del menú superior. A continuación, haga clic en el botón Agregar para cargar los archivos de datos sin procesar de MS originales.Seleccione el ID de proteína humana en el método paragon como método de búsqueda de base de datos y busque los archivos de datos sin procesar de MS originales en la base de datos UniProt homo sapiens. Seleccione la trippsina como enzima de digestión y establezca el resto de los parámetros de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Introduzca el nombre de archivo de los resultados y haga clic en el botón Guardar como situado a la derecha del menú.A continuación, seleccione una carpeta para almacenar los resultados de la búsqueda y haga clic en el botón Guardar. Haga clic en el botón de proceso para iniciar la búsqueda. Una vez finalizada la búsqueda, los datos con el nombre de búsqueda introducido se almacenarán automáticamente en la carpeta seleccionada.Para obtener los espectros de MS/MS de cualquier péptido específico, abra los resultados de búsqueda en el software F.A continuación, haga clic en la proteína en la lista de proteínas en el menú superior y haga clic en el péptido en el menú central. El MS/MS de este péptido aparecerá en la parte inferior del menú. Para exportar y guardar los espectros de MS/MS, copie los espectros y péguelos en un formato de archivo adecuado.Las construcciones genéticas de EYFP CENP-A tipo salvaje o mutante K124R que rescata la pérdida de CENP-A endógeno se expresaron de forma estable cuando se realizó la integración retroviral. La expresión de CENP-A endógeno no se detectó siete días después de la inducción de Cre recombinase. Se encontró que tanto el tipo salvaje EYFP CENP-A como la expresión de proteína K124R estaban en un nivel similar a la proteína CENP-A endógena inicial.Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron localización de centromere a los siete días después de la interrupción de la expresión restante de CENP-A endógeno. El tipo salvaje EYFP CENP-A y el mutante K124R mostraron ubiquitylation e interacción con HJURP a diferencia del caso para el tipo salvaje CENP-A marcado o sin etiquetar y el mutante K124R. La viabilidad celular se evaluó realizando el ensayo de crecimiento de la colonia 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante.Tanto los mutantes EYFP CENP-A como los mutantes K124R mostraron un número similar de colonias rescatadas 14 días después de la interrupción del alelo cenp-A endógeno restante. La espectrometría de masas IP reveló la ubiculación a la lisina 306 en EYFP CENP-A K124R en células CENP-A menos F. En conjunto, estos resultados sugirieron que la fusión de proteína de gran tamaño induce la ubiculación a una lisina distinta de K124R en CENP-A que inhibe el fenotipo mutante único K124R original.Al intentar este protocolo, utilice los geles de proteína 4%12%Bis-Tris disponibles comercialmente para ejecutar las muestras de espectrometría de masas. Añadir la tripina adecuada a las piezas de gel y rehidratarlas hasta que todas las enzimas hayan sido absorbidas. En realidad, se requiere una técnica de etiquetado o sondeo de menor peso molecular para visualizar la ubiculación e investigar la señalización de la ubicuación de proteínas temporales espaciales a niveles y a niveles completos del organismo.

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Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

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MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI preparación de la muestra: el método de ultra capa fina

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Investigación

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Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

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Captura compuesto Espectrometría de Masas - Una herramienta de gran alcance para identificar nuevos c-di-GMP efectoras Proteínas

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Screening siRNA para identificar ubiquitina y reguladores del sistema ubiquitina-como de las vías biológicas en células de mamífero en cultivo

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The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

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Aplicaciones de la sonda: Single-Imaging espectrometría de masas y análisis de celda única bajo condiciones ambientales

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...