Name: mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)
Uploaded: 2020-06-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Biz Model Hayvan Araştırma Merkezi' nde Chao-Jun Li teşekkür, Nanjing Üniversitesi kütle spektrometresi analizi için. Yanmini Dalal, Tatsuo Fukagawa ve Model Hayvan Araştırma Merkezi, Nanjing Üniversitesi ve Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'ndeki mevcut araştırmacılara yararlı tartışmaları, deneysel rehberlikleri ve reaktifleri için teşekkür ederiz. Don W. Cleveland, Daniele Fachinetti, Yanmini Dalal, Minh Bui, Gustavo W. Leone, John Thompson, Lawrence S. Kirschner, Amruta Ashtekar, Ben E. Black, Glennis A. Logsdon, Kenji Tago ve Dawn S. Chandler'a cömert reaktif hediyeleri için teşekkür ederiz. Y.N., Jiangsu Eyaleti ''Double- First-Class'' İnşaat Fonu tarafından desteklendi. Jiangsu Eyaleti Doğa Bilimleri Fonu (SBK2019021248), Jiangsu Eyaleti 16Altı Büyük Yetenek Peaks Fonu (TD-SWYY-001), Jiangsu Eyaleti "Yabancı Uzman Yüz Yetenekler Programı" Fonu (SBK2019010048) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31970665). Bu çalışma kısmen NCI hibe R21 CA205659 tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü ve pBabe-EYFP-CENP-A yapılarının retrovirüs transfeksiyonu
NOT: EYFP-CENP-A, pBabe-EYFP-CENP-A'dan benzer protein düzeyinde endojen CENP-A'ya kadar ifade edilir. Toplam hücresel CENP-A proteini, CENP-A-/F alelinin CRE rekombinaz ile bozulmasından sonra bu EYFP-CENP-A iledeğiştirilir.
<ol><li>293T ambalaj hücreleri kullanılarak retrovirüs içeren supernatant hazırlanması.<ol>
<li>0. Gün: 6 kuyulu kültür plakası (1.0 x 1...

<ol>
	<li>Dunleavy, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HJURP+is+a+cell-cycle-dependent+maintenance+and+deposition+factor+of+CENP-A+at+centromeres.">HJURP is a cell-cycle-dependent maintenance and deposition factor of CENP-A at centromeres.</a> Cell. 137 (3), 485-497 (2009).</li><li>Foltz, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centromere-specific+assembly+of+CENP-a+nucleosomes+is+mediated+by+HJURP.">Centromere-specific assembly of CENP-a nucleosomes is mediated by HJURP.</a> Cell. 137 (3), 472-484 (2009).</li><li>Bernad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+HJURP+and+condensin+II+are+required+for+CENP-A+assembly.">Xenopus HJURP and condensin II are required for CENP-A assembly.</a> J Cell Biol. 192 (4), 569-582 (2011).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Inherited+through+Dimerization+between+Cell+Divisions.">CENP-A Ubiquitylation Is Inherited through Dimerization between Cell Divisions.</a> Cell Reports. 15 (1), 61-76 (2016).</li><li>Fachinetti, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Modifications+on+Ser68+and+Lys124+Are+Dispensable+for+Establishment,+Maintenance,+and+Long-Term+Function+of+Human+Centromeres.">CENP-A Modifications on Ser68 and Lys124 Are Dispensable for Establishment, Maintenance, and Long-Term Function of Human Centromeres.</a> Developmental Cell. 40 (1), 104-113 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 40 (1), 7-8 (2017).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, R., Fang, L., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+Ubiquitylation+Is+Indispensable+to+Cell+Viability.">CENP-A Ubiquitylation Is Indispensable to Cell Viability.</a> Developmental Cell. 50 (6), 683-689 (2019).</li><li>Srivastava, S., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+modifications+of+CENP-A:+marks+of+distinction.">Posttranslational modifications of CENP-A: marks of distinction.</a> Chromosoma. 127 (3), 279-290 (2018).</li><li>Srivastava, S., Zasadzinska, E., Foltz, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Posttranslational+mechanisms+controlling+centromere+function+and+assembly.">Posttranslational mechanisms controlling centromere function and assembly.</a> Current Opinion in Cell Biology. 52, 126-135 (2018).</li><li>Ohkuni, K., Takahashi, Y., Basrai, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+purification+technique+that+allows+detection+of+sumoylation+and+ubiquitination+of+budding+yeast+kinetochore+proteins+Ndc10+and+Ndc80.">Protein purification technique that allows detection of sumoylation and ubiquitination of budding yeast kinetochore proteins Ndc10 and Ndc80.</a> Journal of Visualized Experiment. (99), e52482 (2015).</li><li>Niikura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CENP-A+K124+Ubiquitylation+Is+Required+for+CENP-A+Deposition+at+the+Centromere.">CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere.</a> Developmental Cell. 32 (5), 589-603 (2015).</li><li>Niikura, Y., Kitagawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescence+Analysis+of+Endogenous+and+Exogenous+Centromere-kinetochore+Proteins.">Immunofluorescence Analysis of Endogenous and Exogenous Centromere-kinetochore Proteins.</a> Journal of Visualized Experiment. (109), e53732 (2016).</li><li>Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tetratrico+peptide+repeat+interactions:+to+TPR+or+not+to+TPR.">Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR.</a> Trends in Biochemical Sciences. 20 (7), 257-259 (1995).</li><li>Leopold, A. V., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetically+controlled+protein+kinases+for+regulation+of+cellular+signaling.">Optogenetically controlled protein kinases for regulation of cellular signaling.</a> Chemical Society Reviews. 47 (7), 2454-2484 (2018).</li><li>. Protein gel electrophoresis technical handbook Available from: <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf">https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/Forms/PDF/protein-gel-electrophoresis-technical-handbook.pdf</a> (2015)</li></ol>

Burada EYFP-CENP-A K124R mutant ın ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi yöntemleri açıklanan EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Sonuçlarımızda, EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) üzerinde, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lisin 56 (K56) ile karşılık gelen her yerde başarılı bir şekilde saptandı. Burada açıklanan kütle spektrometresi analizi, daha önce CENP-A WT-Flag<su...

Ökaryotların çoğunda, iğ mikrotübülleri sentromer olarak adlandırılan her kromozomun tek bir bölgesine bağlanmalıdır. Kinetochore sentromere bulunan proteinlerin bir komplekstir. Sentromer ve kinetokore proteininin hareketlerinin zamanlaması ile kinetokore ve sentromerlerin yapısının incelenmesi kromozom instabilitesi (CIN) ve kanser ilerlemesini anlamak için önemlidir. Önemli sorular, bir sentromerin kromozom konumunun ve işlevinin (yani sentromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldıklarıdır. Çoğu türde, CENP-A adı verilen özel histon benzeri protein içeren özel bir nükleozomun varlığı sentromer kimliğini tanımlar. Bu nedenle CENP-A'nın sentromer kimliğin DNA olmayan göstergesi (epigenetik işareti) olduğu öne sürüldü. CENP-A'nın insanlardaki centromer kimliğini nasıl tanımladığımekanizmasını açıklamak önemlidir.
Holliday kavşak tanıma proteini (HJURP) CENP-A-spesifik şaperon hangi mevduat CENP-A centromeric nükleozomlar1,2,3. Daha önce CUL4A-RBX1-COPS8 E3 ligase lisenin üzerinde CENP-A ubiquitylation için gerekli olduğunu bildirdik 124 (K124) ve centromere lokalizasyon4. Ayrıca, sonuçlarımız yeni sentezlenen CENP-A centromere işe önceden varolan her yerde CENP-A5gerektirdiğini gösterdi. Böylece, CENP-A ubiquitylation hücre bölünmeleri arasında dimerization yoluyla kalıtsal olduğunu düşündüren bir model sağlanmıştır.
Bulgularımız ve Yu ve ark.'nın bulgularının aksine, CENP-A ve merkezsel lokalizasyonu ile ilgili olumsuz sonuçlar son zamanlarda6yayınlanmıştır. Makalede, Lizin 124 (K124) üzerinde CENP-A modifikasyonları kurulması için vazgeçilebilir olduğunu iddia etti, bakım, ve insan centromeres uzun vadeli fonksiyonu, K124R mutasyonu CENP-A centromere lokalizasyonu etkilemediğini gösteren olumsuz sonuçlara dayanarak ne hücre canlılığı6. Ancak, onların sonuçları ve sonuçları tartışma için yeterli oda var, ve biz zaten ne sorun var onların önceki yayın7olabilir açıklanmıştır . Endojen CENP-A boyutundan çok daha büyük molekül ağırlıklarına sahip olan CENP-A ile proteinleri eritmiş olmaları dikkat edilmelidir: örneğin, ~30 kDa geliştirilmiş sarı floresan proteini (EYFP) ile ~16 kDa CENP-A'ya eritmiş ve RPE-1CENP-A-Fout sisteminde EYFP-CENP-A K124R füzyon proteinini analiz ettiler. K124 ubiquitin yapısaltahminleredayalı hjurp doğrudan bağlamak için beklenmez 4 , Ancak, mono-ubikitin eklenmesi CENP-A protein konformasyonu üzerinde bir etkisi olduğu tahmin edilmektedir. CENP-A konformasyonunun proteini büyük bir füzyon proteininin varlığı ile değiştirilebilir ve bu konformasyonel değişim ubikilasyon kaybının neden olduğu yapısal değişiklikleri maskeleyebilir. Büyük boyutlu proteinfüzyonunun EYFP-CENP-A K124R mutantında K124 dışındaki bir lizinde ubiquitylation'ı indüklemesini ve başka bir sitedeki bu ubiquitylation'ın orijinal K124R tek mutant fenotipini inhibe ettiğini/maskelediğini öneriyoruz. Cenp-A K124R mutant proteininde büyük etiketli protein (EYFP) ile farklı lizinde ubiquitylation'ın meydana geldiğine dair kanıtlar 8. EYFP etiketlemenin EYFP-CENP-A K124R'ın başka bir lizin bölgesinin her yerde bulunmasına neden olduğu ve EYFP-CENP-A K124R mutantının HJURP'ye bağladığı saptandı. Sonuç olarak, başka bir sitede bu ubiquitylation inhibe / maskeler orijinal K124R tek mutant fenotip, ve hem EYFP-CENP-A WT ve K124R mutantlar centromere lokalizasyon gösterdi (biz kullanılan ve pBabe-EYFP-CENP-A WT ve K124R mutant karşılaştırıldı, birlikte pBabe-EY controlFP.). Sonuçlar, Bayrak etiketli veya etiketsiz CENP-A K124R mutantlarının ölümcül olduğunu ancak monoubiquitin füzyonu ile kurtarılabilen leri gösterdi, bu da CENP-A ubiquitylation'ın hücre canlılığı için vazgeçilmez olduğunu düşündürüyor.
Son yıllarda, birçok çalışma da in vivo ve in vitro9,,10,,11HEM CENP-A protein ve diğer centromere-kinetochore proteinlerin posttranslational değişiklikler (PTMs) tanımlamak için farklı tahliller geliştirdik. Kromatin fonksiyonlarını düzenleyen önemli bir mekanizma olan histon proteinlerinin PTM'lerine benzer olarak, sentromerik kromatin bileşenlerinin PTM'leri de sentromerlerin genel yapısını ve işlevini düzenleyen önemli bir mekanizmada yer almaktadır. CENP-A PTM bölgelerinin çoğu CENP-A içeren nükleozomlara özgüdür, ancak bunlardan birkaçı histon H3'te korunmuştur, bu kalıntıların modifikasyonunun sentromere özgü fonksiyona katkıda bulunduğu ileri sürülmektedir. Fosforilasyon, asetilasyon, metilasyon ve ubikitlasyon da dahil olmak üzere CENP-A PTMs daha önce bildirilmiştir9, CENP-A ptms çeşitli tabi olduğunu düşündüren ve amino terminus ve C-terminus histon-fold etki alanında onların kombinatoryal dizileri. Birden fazla fonksiyonda CENP-A modifikasyonlarının önemi bizimki de dahil olmak üzere birçok grup tarafından ortaya kondu. Bu fonksiyonlar centromerlerde CENP-A birikimini, protein stabilitesini ve CCAN'ın (kurucu sentromer ilişkili ağ) işe alınmasını içerir9. Ancak, cenp-A PtM'lerin sınırlı çalışmaları ve bulguları, işlevlerini doğrudan veya dolaylı olarak düzenleyen kanonik histones biri ile karşılaştırmalar yapıldığı nda önceden oluşturulmuştur. Bu CENP-A PTM'lerini tanımlamak için metodolojiye odaklanan teknik raporlar da sınırlıdır.
CENP-A ubiquitylation centromere12de CENP-A birikimi için gerekli olduğundan , hücre bölünmesi arasında dimerization yoluyla kalıtsal5, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez8, CENP-A ubikirlasyon belirlemek için yöntem fonksiyonel aktivite, konumlandırma ve centromere yapısını incelemek için gelecekte gerekli olacaktır. Bu nedenle, burada EYFP-CENP-A K124R mutant ubiquitylation tanımlamak için kütle spektrometresi analizi açıklar EYFP etiketleme CENP-A K124R mutant protein8farklı bir lizin de ubiquitylation indükler düşündüren . Diğer kontrol tahlil ve analizlerinin protokolleri (immünofloresan analizi, koloni büyüme dışı tahlil ve in vivo ubiquitition tahlil) ayrıca büyük kütle spektrometresi analizinin sonuçlarını doğru bir şekilde tartışmak için sunulmuştur.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equpiments/Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 ml protein low binding tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022431064</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10cm cell culture dish</td>
			<td>BIOFIL/JET, China</td>
			<td>700224</td>
			<td>10 cm tissue culture dish (Yohei lab, PN63)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well Cell Culture Cluster</td>
			<td>Fisher/Corning Incorporated</td>
			<td>07-200-83</td>
			<td>6-well culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CentriVap</td>
			<td>LABCONCO</td>
			<td>-</td>
			<td>Benchtop vacuum concentrator for vaccum dry peptides for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChromXP C18CL, 120A, 15 cm x 75 &#956;m</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>805-00120</td>
			<td>Liquid chromatography (RPLC) column for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 100x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE</td>
			<td>100X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX PL APO 63x oil immersion lens</td>
			<td>Leica</td>
			<td>LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS</td>
			<td>63X Oil immersion lens</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immobilon-FL PVDF Transfer Membrane</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>For western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DM IRE2 motorized fluorescence microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>-</td>
			<td>motorized fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EL6000 compact light source</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>External light source for fluorescent excitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
			<td>Surgipath</td>
			<td>105</td>
			<td>Cover glass (22 mm x 22 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Model V16-2 polyacrylamide gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Apogee Electrophoresis/CORE Life Sciences</td>
			<td>31071010</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus I to apply bigger SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nanoLC.2D</td>
			<td>Eksigent Technologies</td>
			<td>-</td>
			<td>liquid chromatography system for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuPAGE 4%-12% Bis-Tris Protein Gels</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>NP0335BOX</td>
			<td>The commercially available 4%-12% Bis-Tris protein gels for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus FLUOVIEW FV3000 confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Confocal laser scanning microscope (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ORCA-R2 Degital CCD camera</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C10600-10B</td>
			<td>CCD camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP Pen</td>
			<td>Binding Site</td>
			<td>AD100.1</td>
			<td>For a water repellant barrier in immunofluorescent staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE CULTURE DISHES 10CM</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-166</td>
			<td>10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vertical electrophoresis for gel running (big size)</td>
			<td>Junyi, China</td>
			<td>JY-SCZ6+</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus II to apply bigger SDS-PAGE gel (Yohei lab, PE23)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR Micro Slides, Frosted</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>48312-013</td>
			<td>Micro slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-A antibody</td>
			<td>Stressgen/Enzo Life Sciences</td>
			<td>KAM-CC006</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-CENP-B antibody</td>
			<td>Novus Biologicals</td>
			<td>H00001059-B01P</td>
			<td>Mouse monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>ABCAM</td>
			<td>ab37168</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GAPDH</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PA1987</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP antibody</td>
			<td>ANTI #76 (Homemade antibody)</td>
			<td></td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HA (3F10)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11815016001</td>
			<td>Rat monoclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-HJURP</td>
			<td>Proteintech Group</td>
			<td>15283&#8211;1-AP</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-Ubiquitin</td>
			<td>Bethyl Laboratories</td>
			<td>A300-317A-1</td>
			<td>Rabbit polyclonal antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Commercial protein assay reagent I for measurement of protein concentration (compatible with 0.1% SDS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SONIFIER 450</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Step, Solid, Threaded 9.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33995-325</td>
			<td>Disruptor horn for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson Ultrasonics sonicator Microtip Tapered 6.5 mm</td>
			<td>VWR Scientific Products Inc.</td>
			<td>33996-185</td>
			<td>Microtip for sonication</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer A1</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>20 mM Tris-HCl, pH 7.4; 50 mM NaCl; 0.5% Nonidet P-40; 0.5% deoxycholate; 0.5% SDS; 1 mM EDTA; complete EDTA-free protease inhibitor reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11-873-580-001</td>
			<td>Complete EDTA-free protease inhibitor reagent for buffer A1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie brilliant blue R-250</td>
			<td>BBI Life Sciences</td>
			<td>CAS 6104-59-2</td>
			<td>Coomassie blue solution for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution (2.3% crystal violet, 0.1% ammonium oxylate, 20% ethanol)</td>
			<td>SigmaI-Aldrich</td>
			<td>HT90132-1L</td>
			<td>For colony staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>D9542</td>
			<td>For nuclear staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-2006</td>
			<td>DMEM: F12 Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
			<td>Life Technologies/Gibco</td>
			<td>10082</td>
			<td>FBS (fetal bovine serum)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-glucose DMEM (Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium)</td>
			<td>Life Technologies/BioWhittaker</td>
			<td>12-604</td>
			<td>high-glucose DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent I for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamin 3000, P3000 solution</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>L3000</td>
			<td>Transfection reagent II for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A412-4</td>
			<td>Fixation reagant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non fat powdered milk (approved substitution for carnation powdered milk)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9255871 (Reorder No. 190915; Lot# 90629)</td>
			<td>Non-fat skim milk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM I</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>31985</td>
			<td>Reduced serum media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-phenylenediamine</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P6001</td>
			<td>For mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin, Streptomycin; Liquid</td>
			<td>Fisher/Gibco</td>
			<td>15-140</td>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-Lysine SOLUTION</td>
			<td>SIGMA-SLDRICH</td>
			<td>P 8920</td>
			<td>Poly-L-Lysine, 0.1% w/v, in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethyleneimine [PEI]; 1.0 mg/ml</td>
			<td>Polysciences</td>
			<td>23966&#8211;2</td>
			<td>Transfection reagent III for chemical transfection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads</td>
			<td>GE Healthcare/Amersham</td>
			<td>17-0963-03</td>
			<td>Protein A sepharose CL-4B beads for in vivo ubiquitylation assays using pQCXIP-EYFP-CENP-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Restore Western Blot Stripping Buffer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>PI21059</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing grade trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>For mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>34095</td>
			<td>Ultra-sensitive enhanced chemiluminescent (ECL) substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Distilled Water</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen/Gibco</td>
			<td>10977</td>
			<td>Sterile tissue culture grade water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II ((50 mM Tris-HCl, pH 6.85; 2% SDS; 50 mM DTT; 100 mM 2-Mercaptoethanol)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>Western Blot Stripping Buffer II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td>Life Technologies/Invitrogen</td>
			<td>A11005</td>
			<td>fluorophore-conjugated secondary antibody (Affinity-purified secondary antibody)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Softwares</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquisition FV31S-SW software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C1 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis FV31S-DT software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C2 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/support/ downloads/#!dlOpen=%23detail847250519)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens Dimension software Ver. 1. 18</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>-</td>
			<td>Sofware C3 (https://www.olympus-lifescience.com.cn/en/ software/cellsens/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Studio Analysis Software Ver 4.0</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Software D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular Imager Versadoc MP4000 System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Chemiluminescence imager for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Odyssey CLx Infrared imaging System</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td>-</td>
			<td>Infrared imaging system for immunoblot detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenCFU saftware</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>For colony counting (http://opencfu.sourceforge.net/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Openlab version 5.5.2. Scientific Imaging Software</td>
			<td>Improvision/PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteinPilot Software version 4.5</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Software F for mass spectrometry analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantity One 1-D analysis software</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>-</td>
			<td>Software E</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TripleTOF 5600+ System</td>
			<td>AB SCIEX</td>
			<td>-</td>
			<td>Mass spectrometry instrument</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Acquisition)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volocity version 6.3 3D Image Analysis Software (Volocity Quantification)</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>-</td>
			<td>Software B2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mass spectrometry analysis to identify ubiquitylation of eyfp-tagged cenp-a (eyfp-cenp-a)

Kinetokoreve sentromerlerin yapısı ve dinamiklerinin incelenmesi kromozomal instabilite (CIN) ve kanser ilerlemesini n anlaşılmasında önemlidir. Bir sentromerin kromozom yerinin ve işlevinin (yani centromer kimliğinin) nasıl belirlendiği ve doğru kromozom ayrımına nasıl katıldığı temel bir sorudur. CENP-A sentromer kimliğinin DNA olmayan indikatörü (epigenetik işareti) olarak önerilmektedir ve cenp-A ubiquitition centromere de CENP-A birikimi için gereklidir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez.
Burada, EYFP-CENP-A K124R mutantının ubiquitylation'ını tanımlamak için kütle spektrometresi analizini açıklıyoruz ve cenp-A K124R mutant proteinindeki EYFP etiketlemesi nedeniyle farklı bir lizinde ubiquitylation indüklenmiş olduğunu öne sürüyoruz. EYFP-CENP-A K124R'da lizin 306 (K306) ubiquitylation başarıyla tanımlanmış, kütle spektrometresi analizi ile CENP-A'da lizin 56 (K56) ile karşılık gelmektedir. Bir uyarı GFP / EYFP kullanımı veya bir proteinin işlevini analiz etmek için bir araç olarak yüksek molekül ağırlıklı protein etiketleme tartışılır. Mevcut teknik sınır da her yerde bantların tespiti, siteye özgü ubiquitylation(lar) belirlenmesi ve canlı hücrelerde veya belirli bir hücrede tüm hücre döngüsü boyunca ubikitlasyon görselleştirme için tartışılmıştır.
Burada sunulan kütle spektrometresi analizi yöntemi farklı etiketleri ve diğer sentromer-kinetokore proteinleri ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Çeşitli tahliller/analizlerden oluşan bu kombinatory yöntemler, her yerde bulunan işlevsel rollerini belirlemek isteyen araştırmacılar için önerilebilir.

EYFP-CENP-A K124 mutant her yerde gösterir, HJURP ile etkileşim, ve centromere lokalizasyonunda hiçbir kusur ne hücre öldürücü. Burada Fachinetti et al. (2017)6 tarafından bildirilen sistem yeniden oluşturuldu: diploid insan (RPE-1) hücrelerinde bir bozulmuş ve bir ''floxed'' CENP-A alel(CENP-A-/F),EYFP-CENP-A pBabe-EYFP retrovirus vektörü ifade edildi. Bu sistemde, CENP-A-/F alel endojen CENP-A ifadesi Cre rekombinaz<...

Watch this Scientific Journal Video about Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A at JoVE.com

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A EYFP-CENP-A

CENP-A ubiquitylation centromere DE CENP-A birikimi için önemli bir gerekliliktir, hücre bölünmesi arasında dimerizasyon yoluyla kalıtsal, ve hücre canlılığı için vazgeçilmez. Burada EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) proteininin ubiquitylation belirlemek için kütle spektrometresi analizi ni tanımlıyoruz.

EYFP etiketli CENP-A (EYFP-CENP-A) Ubiquitylation tanımlamak için Kütle Spektrometresi Analizi

Studying the structure and the dynamics of kinetochores and centromeres is important in understanding chromosomal instability (CIN) and cancer ...

Bu yöntem, EYFP etiketli CENP-A proteininin ubiquitylation'ını belirlemeyi mümkün kAlmaktadır. Ayrıca farklı testler ve diğer proteinler ile insan CENP-A protein uygulanabilir. Bunun en büyük avantajı, çok önemli biyolojik önemi olan EYFP CENP-A K124R her yerde bulunan siteleri tanımlamak için kullanılabilmedir.Çok çeşitli fonksiyonel proteinlerin çeviri sonrası modifikasyonlarını araştırmak için genişletilebilir. Protein hazırlayarak başlayın Anti-GFP antikor ile bağlı boncuklar. Yıkama 25 protein Etanol kaldırmak için tampon A1 ile immünopremasyon reaksiyonu başına boncuk lar.Sonra tampon A1 ile% 50 boncuk çözüm yapmak. Boncuklara iki mikrolitre anti-GFP antikor ekleyin. Ardından arabellek A1'i net boncuk hacminin 20 katına ekleyin. Dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uç-uç döndürme gerçekleştirin.Rotasyon için en uygun süre immünopresipitasyonun etkinliğine göre ampirik olarak belirlenmelidir. Döndükten sonra boncukları 100 kez g'de bir dakika santrifüj edin ve bağlanmamış süpernatantı çıkarın. Boncuk% 50 çözüm yapmak için tampon A1 ekleyin ve her immünopresidreaksiyonu için bu çözeltinin 25 mikrolitre kullanın.İmmünenenan,liyada hücrelerinin sonication ve freeze/hawai ile tampon A1'de yer alan hücreleri gerçekleştirmesi. Protein konsantrasyonlarını ölçün ve farklı IP örnekleri arasındaki protein miktarlarını normalleştirin. Ardından, SDS sayfasında çalıştırmak için her tüpten numunenin %5'ini çıkarın.Lysat'ın geri kalanını 25 mikrolitre proteinle karıştırın Anti-GFP antikora bağlı boncuklar ve dört ila 18 saat boyunca dört santigrat derecede uçtan uca dönüş yapın. Tampon A'daki hücreleri lysing ve daha önce açıklandığı gibi immünopresipitasyon yaptıktan sonra, TOPLAM immünopprepititantların %10'unu saklayarak EYFP CENP-A ubiquitylation'ı doğrulayın ve ubikitileted EYFP CENP-A'nın konumunu tam olarak belirleyin. Kütle spektrometresi analizi için diğer %90'ı kullanın.Kütle spektrometresi örneğini ticari olarak mevcut olan %4-12 Bis-Tris protein jelinde çalıştırın. Sonra Coomassie mavi boyama gerçekleştirmek ve kütle spektrometresi analizi için 50-70 kilodalton jel bölge çıkarmak. Küçük parçalar halinde her jel dilim zar ve 0,5 mililitre düşük protein bağlayıcı tüp yerleştirin.Jel parçalarını 25 milimolar amonyum bikarbonatta %50 asetonitit 100 mikrolitre ile yıkayın. 10-15 dakika girdap onları. Sonra onları aşağı spin ve supernatant atın.Son yıkamadan sonra, 30 dakika boyunca bir tezgah üst vakum konsantratörü ile jel parçaları kuru. Mikrolitre sıralama sınıf trippsin başına 10 nanogram 10 mikrolitre ekleyin ve jel parçaları beş dakika için rehydrate sağlar. Sonra 25 milimolar amonyum bikarbonat ekleyin, jel parçaları kapsayacak kadar ve bir gecede 37 derece santigrat onları sindirmek için yeterli.Ertesi gün, temiz bir 0.65 mililitre silikonlu tüp içine sindirilmiş supernatant aktarın ve% 50 asetonitril ve% 5 formik asit çözeltisi ekleyin. 10 dakika boyunca örnek girdap. Sonra aşağı spin ve bir ekstraksiyon tüpü içine supernatant aktarın.Numuneyi tekrar iki mikrolitreye yoğunlaştırın. Daha sonra %3 asetonitril ve %2 formik asit çözeltisi sekiz mikrolitre ekleyin. 15 dakika girdap ve 30 dakika boyunca 16,000 kez g aşağı spin.Kütle spektrometresi aleti ile birleşen sıvı kromatografi sistemi kullanarak LC-MS/MS ile MS veri toplama gerçekleştirin. Numunenin sekiz mikrolitresini ters faz sıvı kromatografi sütununa enjekte edin ve yazı mevzisi yönergelerini takip eden 60 dakika içinde peptidleri %2-80 degradeli B çözücü ile ayırın. Veriye bağımlı edinme modunu kullanarak kütle spektrometresi verilerini toplayın.Masaüstünde kütle spektrometresi verilerini analiz etmek için ticari yazılımı açın. Yeni bir arama başlatmak için üst menüdeki LC düğmesini tıklatın. Ardından orijinal MS ham veri dosyalarını yüklemek için ekle düğmesini tıklatın.Paragon yönteminde veritabanı arama yöntemi olarak insan protein kimliğini seçin ve orijinal MS ham veri dosyalarını UniProt homo sapiens veritabanına karşı arayın. Sindirim enzimi olarak tripsin'i seçin ve geri kalan parametreleri el yazması talimatlara göre ayarlayın. Sonuç dosya adını girin ve menünün sağındaki kaydet düğmesine tıklayın.Ardından arama sonuçlarını depolamak için bir klasör seçin ve kaydet düğmesini tıklatın. Aramayı başlatmak için işlem düğmesini tıklatın. Arama sona erdikten sonra, girilen arama adı içeren veriler otomatik olarak seçili klasörde depolanır.Herhangi bir spesifik peptidIN MS/MS spektrumlarını elde etmek için, arama sonuçlarını f.Then üst menüdeki protein listesindeki proteine tıklayın ve orta menüdeki peptid'e tıklayın. Bu peptidin MS/MS'si menünün alt kısmında görünür. MS/MS spektrumunu dışa aktarmak ve kaydetmek için, spektrumları kopyalayın ve uygun bir dosya biçimine yapıştırın.Endojen CENP-A kaybını kurtaran EYFP CENP-A yabani tipi veya K124R mutantının gen yapıları retroviral entegrasyon yapıldığında stably ifade edildi. Endojen CENP-A ekspresyonu Cre rekombinazin indüksiyonundan yedi gün sonra saptanmadı. Hem EYFP CENP-A yabani tip hem de K124R protein ekspresyonu ilk endojen CENP-A proteinine benzer düzeyde bulunmuştur.Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar endojen CENP-A kalan ifade bozulmasından sonra yedi gün centromere lokalizasyon gösterdi. EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutant bayraklı etiketli veya etiketsiz CENP-A vahşi türü ve K124R mutant için durumda aksine HJURP ile ubiquitylation ve etkileşim gösterdi. Hücre canlılığı, kalan endojen CENP-A alelinin bozulmasından 14 gün sonra koloni büyüme çıktısı gerçekleştirerek değerlendirildi.Hem EYFP CENP-A vahşi tip ve K124R mutantlar kurtarılan koloniler benzer sayıda gösterdi 14 gün kalan endojen CENP-A alel bozulmasından sonra. IP kütle spektrometresi, CENP-A eksi F hücrelerinde EYFP CENP-A K124R'da lizin 306'da ubiquitylation saptandı. Bu sonuçlar birlikte, büyük boyutlu protein füzyon orijinal K124R tek mutant fenotip inhibe CENP-A K124R dışında bir lizin de ubiquitylation indükler önerdi.Bu protokolü denerken, kütle spektrometresi örneklerini çalıştırmak için ticari olarak mevcut olan %4%12 Bis-Tris protein jellerini kullanın. Jel parçaları için yeterli tripsin ekleyin ve tüm enzimler emilir kadar onları rehydrate. Daha düşük molekül ağırlığı etiketleme veya sondalama tekniği aslında ubiquitylation görselleştirmek ve uzaysal zamansal protein ubiquitylation sinyal araştırmak için gereklidir ve tüm organizma düzeylerinde.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Analytical Chemistry

Biology

Unit 1

Mass Spectrometry Analysis to Identify Ubiquitylation of EYFP-tagged CENP-A (EYFP-CENP-A)

Principles of Mass Spectrometry

SCIENTISTS IN ACTION

MALDI Sample Preparation: the Ultra Thin Layer Method

MALDI Numune Hazırlama: Ultra İnce Tabaka Yöntemi

This video demonstrates the preparation of an ultra-thin matrix/analyte layer for analyzing peptides and proteins by Matrix-Assisted Laser Desorption ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

T-wave Ion Mobility-mass Spectrometry: Basic Experimental Procedures for Protein Complex Analysis

T-dalgası İyon Hareketlilik-Kütle Spektrometresi: Protein Karmaşık Analiz Temel Deneysel Prosedürler

Ion mobility (IM) is a method that measures the time taken for an ion to travel through a pressurized cell under the influence of a weak electric field. ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Doğrudan Atmosferik Basınç Kütle Spektrometresi Tek Hücre Analizi

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange &amp; MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Amide Hydrogen/Deuterium Exchange & MALDI-TOF Mass Spectrometry Analysis of Pak2 Activation

Pak2 Etkinleştirme Amid Hidrojen / Döteryum Alım Satım &amp; MALDI-TOF Kütle Spektrometre Analiz

Amide hydrogen/deuterium exchange (H/D exchange) coupled with mass spectrometry has been widely used to analyze the interface of protein-protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Capture Compound Mass Spectrometry - A Powerful Tool to Identify Novel c-di-GMP Effector Proteins

Yakalama Bileşik Kütle Spektrometre - Roman c-di-GMP Efektör Proteinler tanımlamak için güçlü bir araç

Considerable progress has been made during the last decade towards the identification and characterization of enzymes involved in the synthesis ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Enrichment of Extracellular Matrix Proteins from Tissues and Digestion into Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Kütle Spektrometresi Analizi için Peptitler içine Dokular ve Sindirim gelen Ekstrasellüler Matriks Proteinleri zenginleştirilmesi

The extracellular matrix (ECM) is a complex meshwork of cross-linked proteins that provides biophysical and biochemical cues that are major regulators of ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Tek prob Uygulamalar: Ortam Koşullarında Kütle Spektrometre Görüntüleme ve Tek Hücre Analizi

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...