Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يعترفوا بأن هذا البحث قد تلقى تمويلا من برنامج الاتحاد الأوروبي للأبحاث والابتكار في أفق 2020 لمشروع PATROLS، بموجب اتفاق المنح رقم 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

تختلف تطبيقات النماذج الكبدية ثلاثية الأبعاد بشكل كبير اعتمادا على نقطة النهاية الكيميائية الحيوية الخاصة أو مسار النتائج السلبية المستهدف. كل نموذج له فوائده وحدوده، من الاختلاف بين الدونور في الخلايا الكبدية البشرية الأولية (PHH) نماذج لخفض نشاط السيتوكروم P450 في النماذج القائمة على خط الخلية، ولكن كلها قيمة في حد ذاتها6،12،18،19. عند تقييم السمية الجينية هناك قيود في النماذج التوافق مع نقاط النهاية المعتمدة التنظيمية مثل المقايسة النووية الدقيقة في المختبر، كما هو مطلوب الانتشار النشط. وهذا ضروري، حيث يتطلب تقييم السمية الجينية تقييم كمية تلف الحمض النووي الثابت بعد انقسام الخلايا عندما تكون هناك فرصة لإصلاح الحمض النووي لتصحيح الآفات العابرة. لسوء الحظ، خلايا الكبد المتباينة للغاية (أي هيبارج) القائمة على كرويدات أو الخلايا المجهرية PHH، والتي تعتبر لإظهار الخصائص الأكثر صلة من الناحية الفسيولوجية تشبه الكبد تشكل نماذج ثابتة (غير التكاثرية)12،19،20. ونتيجة لذلك، يوفر نموذج كروية HepG2 ثلاثي الأبعاد المعروض هنا نموذجا بديلا مناسبا قادرا على دعم اختبار السمية الجينية. HepG2 الخلية خط القائم على كرويدات لديها ما يكفي من الخلايا تقسيم بنشاط على السطح الخارجي للسفيرويدات مع الحفاظ على خصائص أساسية تشبه الكبد، مثل إنتاج الألبومين واليوريا وبعض النشاط CYP4505،12،19. أساسا هذا النموذج في الكبد المختبر وقد وضعت لاستكمال المقايسة micronucleus، وهذا هو واحد من اثنين في المختبر المقايسات الموصى بها في البطارية لاختبار السمية الجينية8،10،11،21. ومع ذلك، يمكن تطبيق النموذج بسهولة على تحليل تسلسل الحمض النووي وتقنيات التعبير الجيني (RNA)، في حين أن لديه القدرة على زيادة تكييفه واستخدامه لنقاط نهائية أخرى لتلف الحمض النووي، مثل فحص المذنب. ومع ذلك، من المهم النظر في الدور الذي يلعبه تدخل ENM في بعض تحليلات نقاط النهاية. على سبيل المثال، قد لا تكون التحليلات المستندة إلى قياس التدفق الخلوي مناسبة لتقييم السمية الجينية ENM على وجه التحديد بسبب تداخل الجسيمات22.
أحد العوامل المقيدة لنماذج كروية تخضع بنشاط لتقسيم الخلايا هو حجمها. تحسين كثافة البذر أمر بالغ الأهمية حيث يجب أن يكون هناك ما يكفي من الخلايا التي تسمح للنموذج بالاستمرار في الانتشار؛ ولكن ليس عدد الخلايا عالية جدا، مما يؤدي إلى كروية تصبح مدمجة بشكل مفرط، مما يؤدي إلى زيادة النواة النخرية. ويعتقد أن سبب هذا النخر هو تقييد الأكسجين ونشر المواد الغذائية ، حيث يعتقد أن الحد الأقصى لهذا الانتشار هو حوالي 100 - 150 ميكرومتر من الأنسجة23،24. ومع ذلك، هذا يعتمد على نوع الخلية، رقم الخلية، التفاعلات سقالة وظروف الثقافة25. منذ ذلك الحين ، فقد ثبت أن قطرها حوالي 700 ميكرومتر هو الحد الأقصى لتجنب ظهور مبكر للنخر في وسط كرويدات C3A ، البذر 4000 خلايا HepG2 لكل كروية يضمن قطر النموذج في وقت التعرض هو ≤500 ميكرومتر26. وعلاوة على ذلك، أثبت شاه وآخرون أن خلايا HepG2 المصنفة فوق 5000 خلية لكل كروية أظهرت انخفاضا بنسبة 25٪ في الجدوى بعد 7 أيام في الثقافة، والتي يمكن أن تتعلق بمتوسط قطر 680 ميكرومتر والتوافر المحدود للمغذيات في قطرة معلقة 20 ميكرولتر5. للتغلب على ذلك ، يخضع النموذج الذي تم وضعه في البروتوكول الحالي لخطوة حاسمة حيث يتم نقل قطرة الشنق إلى آبار مغلفة ب agarose بعد التكوين الأولي للسفيرويد. وهذا يضمن وجود حجم أكبر من وسيط الثقافة للحفاظ على العدد المتزايد من الخلايا داخل كرويدات. ونتيجة لذلك، فإن نموذج كروية HepG2 لا يزال أكثر من 70٪ قابلة للحياة بعد 10 أيام في الثقافة ويمكن استخدامها لتقييم المخاطر على المدى الطويل في المختبر. 
في حين أن نموذج كروية HepG2 يمكن أن يدعم أنظمة التعرض الحادة والطويلة الأجل ، فإن متوسط ثقافة الخلايا المنعشة خلال فترات الثقافة الممتدة مقيد لهذا النموذج حيث لا ينصح باستبدال الوسط بالكامل بسبب الخسارة المحتملة للشفرات. ومن المفترض أنه مع التعرض ل ENM، فإن الميل إلى تشتت ENM متجانس للتكتجمعات والرواسب مرتفع. ومع ذلك، فمن الجدير بالذكر أن المعدل الذي يمكن أن تختلف به رواسب ENM اعتمادا على معلمات الجسيمات (على سبيل المثال، الحجم والشكل والكثافة) ويمكن تحديده نظريا باستخدام نموذج الترسيب في المختبر ونشره وقياس الجرعات (ISDD)، أو مشتقاته الحديثة، والتي يشار إليها غالبا عند اقتراب التعرض ل ENM (التعليق)من 27و28. مع هذا هو العقل, ومن المفترض أنه إذا كان فقط 50٪ من الخلايا ثقافة المتوسطة تتم إزالتها بعناية من سطح ثقافة الخلية, وينبغي تعطيل وإزالة لاحقة من جرعة ENM يكون الحد الأدنى من الناحية النظرية. ومع ذلك ، مع الحركة براونيان في اللعب ، وهذا قد لا يكون هو الحال تماما ، وينبغي القيام بمزيد من العمل في ترسب وترسب كل ENM معينة لاختبارها لضمان الاحتفاظ قياس الجرعات الصحيح في جميع أنحاء أنظمة التعرض على المدى الطويل27. وهذا أساسا قيد محتمل ينبغي النظر فيه عند تنفيذ نظم الزم المتكررة لأن ذلك يمكن أن يكون حاسما بالنسبة للتركيز النهائي المتراكم. التعرض على أساس المواد الكيميائية من ناحية أخرى، في حين لا يخلو من القيود الخاصة بهم للنظر، وتقديم نهج أكثر تبسيطا في أن المواد الكيميائية تميل إلى البقاء في الحل، وبالتالي استبدال مباشر للتركيز الكيميائي الأصلي بالإضافة إلى تركيز المضافة حديثا يضمن أن يتم استبدال أي مادة كيميائية فقدت خلال المرطبات وسائل الإعلام وفقا لذلك29. وتشمل التطبيقات المستقبلية تقييم مدى ملاءمة النموذج لنظم التعرض المتكررة على مدى فترات الثقافة الطويلة الأجل، حيث أن استراتيجيات التعاطي المتكررة ذات أهمية حاسمة لتقييم قدرة نظام عضوي معين على تحسين أو التغلب على الآثار الضارة، إن وجدت، الناجمة عن التراكم البيولوجي لمادة زينوبيوتية.
وفي الختام، فإن هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم مجموعة من سيناريوهات التعرض الواقعية، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم أفضل لكل من ENM وتقييم المخاطر الكيميائية بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

نظرا للتطور السريع والتنفيذ السريع لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) عبر عدد كبير من التطبيقات البشرية (مثل الطعام ومستحضرات التجميل والملابس والمعدات الرياضية والإلكترونيات والنقل والطب) ، فمن المحتم أن يتعرض البشر لENM على أساس منتظم. مع هذا، هناك مخاوف متزايدة من أن الرواية، وحجم الخصائص الفيزيائية الكيميائية المحددة التي تعتبر هذه المواد مفيدة في العديد من التطبيقات يمكن أن يسبب آثارا سلبية على صحة الإنسان والبيئة في الوقت المناسب. ويوجد حاليا العديد من الأنشطة الدولية التي تعكس بفعالية التعرض الأكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية لهذه المعدات وتقييم السمية المحتملة لهذه المواد على سيناريوهات التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكررة للجرعات المنخفضة.
السموم الكبدية هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما هو معروف على نطاق واسع أن الكبد هو موقع رئيسي لتراكم ENM بعد التعرض1،2. وعلاوة على ذلك، فإن الكبد هو الجهاز الأساسي لنظام التمثيل الغذائي وإزالة السموم من المواد التي تدخل الدورة الدموية الجهازية3. استنادا إلى الفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا أو تمثل بشكل مناسب النشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، فقد تم إنشاء تركيز أكبر على تطوير نماذج كبد 3D قوية و ذات صلة فسيولوجية في المختبر لتقنيات استبدال الجسم الحي4،5. إن استخدام تقنيات متطورة في مجال الثقافة ثلاثية الأبعاد يحسن من طول عمر النماذج الكبدية في المختبر مما يسمح بإجراء دراسة لأنظمة التعرض المتكررة على المدى الطويل. بالإضافة إلى ذلك، هذا الشكل ثقافة متقدمة يعزز تشكيل تعزيز الفسيولوجية، والميزات العضوية مثل canaliculi الصفراء، وعمليات النقل النشط وتحسين قدرات استقلاب المخدرات CYP450، وبالتالي تحسين التنبؤية للنماذج6. نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد الحالية في المختبر التي تتكون من ثقافات أحادية (خلايا الكبد فقط) أو الثقافات المشتركة (خلايا الكبد مع الخلايا غير الحيوية) موجودة في عدة أشكال، بدءا من microtissues أو كرويات في لوحات التصاق فائقة التوهج، شنقا قطرة كرويدات، والخلايا جزءا لا يتجزأ من المصفوفات و / أو السقالات ومنصات ثقافة الخلايا microfluidic، وكلها تعتبر فعالة متقدمة في نماذج المختبر لتقييم السمية الكبدية6،7. ومع ذلك، فإن غالبية هذه النظم النموذجية هي صيانة عالية، وتتطلب معدات متخصصة ومكلفة. وعلاوة على ذلك، فإن هذه النماذج غالبا ما تكون ثابتة (أي نماذج الخلايا الناندية) التي تمنع استخدامها في تقييم نقاط نهاية الخطر، مثل اختبار السمية الجينية باستخدام أساليب تحدد حجم تلف الحمض النووي الثابت. السمية الجينية هي شرط أساسي في علم السموم التنظيمي ، وهو عنصر حيوي في تقييم المخاطر لأيمادة سامة 8. لا يوجد أي فحص واحد يمكن تطبيقه لتحديد جميع أشكال تلف الحمض النووي التي قد تنشأ بعد التعرض لعامل خارجي. ومع ذلك ، فإن المكون الأساسي لبطارية اختبار السمية الجينية في المختبر هو المقايسة النووية الدقيقة ، وهي تقنية موثوقة ومتعددة الأوجه تقيس الضرر الكروموسومي الإجمالي9. وهو تقنية معيار الذهب التي وصفها اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي المبدأ التوجيهي 487، لتقييم تلف الحمض النووي في المختبر والسمية الجينية وجزء من متطلبات بطارية الاختبار لتقييم المخاطر التنظيمية10،11.
يستخدم خط الخلية السرطانية الكبدية البشرية ، HepG2 ، على نطاق واسع لفحص تقييم المخاطر الأولي حيث أن الخلايا متاحة بسهولة ، وغير مكلفة نسبيا للمصدر ، وبسيطة للثقافة وقابلة لفحص الإنتاجية العالية12،13. عندما مثقف في الهياكل كروية 3D، وقد ثبت أن تلخيص البيئة الدقيقة الكبد بشكل جيد وتقديم نموذج كبدي مع قدرات الانتشار كافية لدعم المقايسة micronucleus3. 10- وقد أنشئ مزيد من التطوير لنماذج كروية HepG2 لتحسين طول العمر والأداء الوظيفي الشبيه بالكبد للنموذج من أجل دعم تقييم مخاطر السمية الجينية على مدى نظم التعرض المتكررة الطويلة الأجل (≤14 يوما). وهكذا، وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات، تم وضع هذا البروتوكول لتوفير نموذج متقدم ثلاثي الأبعاد في المختبر الكبدي قادر على تقييم نقاط النهاية السمية المتعددة بشكل موثوق (على سبيل المثال، وظائف الكبد، (المؤيدة) علامات الالتهاب، السمية الخلوية والسمية الجينية) بعد التعرض الحاد والطويل الأجل والمتكرر للمواد الكيميائية وENM بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.
هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلايا كبدية ثلاثية الأبعاد ذات صلة من الناحية الفسيولوجية تستند إلى نظام نموذج المختبر لتقييم مخاطر السمية الجينية بعد التعرض الحاد أو الطويل الأجل ل ENM المتكرر. يمكن تقسيم البروتوكول إلى 6 مراحل رئيسية: زراعة خلايا HepG2 المبردة؛ وزراعة خلايا 10000000000000000000000000000000000000000000000000 إعداد كروية HepG2; نقل كروية HepG2 من إسقاط شنقا لتعليق agarose; حصاد كروية HepG2; المقايسة micronucleus والتهديف؛ وتحليل البيانات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

نظرا للتطور السريع والتنفيذ لمجموعة متنوعة من المواد النانوية المهندسة (ENM) ، فإن التعرض ل ENM أمر لا مفر منه وتطوير أنظمة اختبار قوية وتنبئية في المختبر أمر ضروري. علم السموم الكبدي هو المفتاح عند النظر في التعرض ENM، كما الكبد يخدم دورا حيويا في التوازن الأيضي وإزالة السموم، فضلا عن كونها موقعا رئيسيا لتراكم ENM بعد التعرض. وبناء على هذا والفهم المقبول بأن نماذج خلايا الكبد 2D لا تحاكي بدقة تعقيدات التفاعلات المعقدة متعددة الخلايا والنشاط الأيضي الملاحظ في الجسم الحي ، هناك تركيز أكبر على تطوير نماذج الكبد ثلاثية الأبعاد ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية المصممة لأغراض تقييم مخاطر ENM في المختبر. وتمشيا مع مبادئ 3Rs لاستبدال وتقليل وصقل التجارب على الحيوانات ، وقد تم تطوير نموذج الكبد 3D HepG2 خط الخلية القائمة ، وهو نظام سهل الاستخدام وفعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تدعم كل من نظم التعرض الموسعة والمتكررة ENM (≤14 يوما). تحتفظ هذه النماذج الكروية (قطرها ≥500 ميكرومتر) بقدرتها التكاثرية (أي تقسيم نماذج الخلايا) مما يسمح لها بالاقترن بمسيح النوى الدقيق "القياسي الذهبي" لتقييم السمية الجينية في المختبر بشكل فعال. وقد تميزت قدرتها على الإبلاغ عن مجموعة من نقاط النهاية السمية (مثل وظائف الكبد والاستجابة الالتهابية (المؤيدة) والسمية الخلوية والسمية الجينية باستخدام عدة تدابير تحديد النمس عبر كل من نظم التعرض الحادة (24 ساعة) وطويلة الأجل (120 ساعة). هذا النموذج الكبدي ثلاثي الأبعاد في المختبر لديه القدرة على الاستفادة منه لتقييم التعرض ل ENM أكثر واقعية ، وبالتالي توفير نهج مستقبلي في المختبر لدعم تقييم مخاطر ENM بشكل أفضل بطريقة روتينية وسهلة الوصول إليها.

تم تقييم مدى ملاءمة نموذج كروية الكبد ثلاثي الأبعاد القائم على خط الخلية للثقافة طويلة الأجل وتقييم المخاطر الجينية من خلال إجراء توصيف أساسي لتحديد صلاحية النموذج ووظائفه الشبيهة بالكبد على مدى 14 يوما في الثقافة بالإضافة إلى إمكانية تطبيقه على فحص الميكرونوكليوس.
التوصيف الأساسي لنموذج كرويد الكبد ثلاثي الأبعاد HepG2 قبل أي تقييم سمية في المختبر، من المهم التحقق من أن كرويدات HepG2 ثلاثية الأبعاد قد تشكلت بشكل صحيح قبل إجراء نقل الآغاروز أو العلاج الكيميائي/ENM. عادة ما تستغرق كرويات HepG2 المنتجة باستخدام طريقة الإسقاط المعلق 2 - 3 أيام بعد البذر (4000 خلية / كروية) لتشكيل كرويات صغيرة كروية الشكل يبلغ متوسط قطرها 495.52 ميكرومتر W × 482.69 ميكرومتر H كما هو موضح في الشكل 5A-5C. يجب أن يكون للشفرات HepG2 التي تشكلت بشكل صحيح ومقبولة لاستخدامها في التقييم السمية المختبرية هيكل صغير على شكل كروي مع سطح أملس ولا توجد إسقاطات بصرية. الشكل 5 يقدم أمثلة من نوعية جيدة (الشكل 5D -F) ونوعية رديئة (الشكل 5G-I) كرويدات. وينبغي التخلص من هذه الأخيرة. عادة، 90-95٪ من كرويات شكلت لكل لوحة سوف تشكل بشكل صحيح وتكون قابلة للحياة لمزيد من التجارب.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> الشكل 5: صور المجهر الخفيفة التي تعرض مورفولوجيا الطبيعية للكرويدات HepG2 شكلت عن طريق طريقة إسقاط شنقا. (A-C) تظهر اليوم 2 و (D-I) اليوم 4 كرويدات الكبد HepG2 بعد البذر. (D-F) هي أمثلة على نوعية جيدة من كرويدات HepG2 بينما (G-I) يظهر كرويات سيئة التشكيل. تم التقاط جميع الصور على هدف X20 باستخدام المجهر. يمثل شريط المقياس 20 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
لمزيد من تأكيد قدرة هيب جي 2 على البقاء، يمكن إجراء فحص بروموبريسول الأخضر للألبومين (BCG) أو تقييم اليوريا لتقييم وظائفها الشبيهة بالكبد. تم تقييم وظائف تشبه الكبد بما يتماشى مع الجدوى باستخدام المقايسة استبعاد الأزرق تريبان على مدى فترة الثقافة 14 يوما لتحديد طول عمر نموذج كروية الكبد وتحديد ما إذا كان يمكن أن تدعم على المدى الطويل أو المتكرر ENM / تقييم المخاطر الكيميائية القائمة (الشكل 6). وظل تركيز الألبومين ثابتا طوال فترة الثقافة. إنتاج اليوريا يعرض زيادة في تركيز اليوريا المنتجة لكل كروية على مدى أسبوع في الثقافة قبل الوصول إلى هضبة بحلول اليوم 7. من المهم ملاحظة أن مستويات الألبومين واليوريا المنتجة في كرويات HepG2 ثلاثية الأبعاد أعلى بكثير من تلك التي لوحظت في نفس خط الخلية المستزرع في شكل 2D. في الواقع، كانت الثقافات 2D من خلايا HepG2، ذروة مستويات الألبومين واليوريا 0.001 ملغم / مل و 0.010 نانوغرام / ميكرولتر على التوالي. وعلاوة على ذلك، في العمل السابق الذي نشرته شاه وآخرون باستخدام نظام كروي HepG2 متطابقة تقريبا، والكتاب تسليط الضوء على تحسن ملحوظ في النشاط الأيضي (CYP1A1 و CYP1A2) في 3D HepG2 في أنظمة نموذج المختبر بالمقارنة مع خلايا 2D مثقف HepG25.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> الشكل 6: بيانات توصيف خط الأساس لمدة 14 يوما ل كرويات الكبد HepG2. بعد نقل من قطرة شنقا،(أ)يسلط الضوء على جدوى نموذج كروية HepG2 على مدى فترة 14 يوما في حين (ب) و (ج) تسليط الضوء على وظائف الزلال واليوريا تشبه الكبد على التوالي. متوسط البيانات ± SEM المقدمة، n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
مع التطور الحتمي لنواة نخرية ، وهو قيد معروف من ثقافات كروية الكبد ثلاثية الأبعاد ، كان لا بد من تأسيس صلاحية هذا النموذج القائم على HepG2 لإثبات أنه قادر على الحفاظ على أنظمة التعرض طويلة الأجل (5-10 أيام) مع الحفاظ على القدرة التكاثرية المطلوبة لدعم المقايسة الدقيقة5. في الواقع، وقد ثبت هذا النموذج كروية الكبد 3D للاحتفاظ > 70٪ الجدوى على مدى 10 أيام في الثقافة. وبناء على ذلك وبالتزامن مع الأداء الوظيفي المستمر الشبيه بالكبد الذي لوحظ خلال فترة الثقافة ≥14 يوما، يمكن لهذا النموذج الكروي للكبد ثلاثي الأبعاد أن يدعم أنظمة التعرض المتكررة ل ENM على المدى الطويل لمدة تصل إلى 10 أيام (أي قبل أن تنخفض صلاحية الكرويات إلى أقل من 70٪). كمرجع، ينصح بأن تكون مستويات الألبومين ل كرويدات HepG2 المصنفة في 4000 خلية /كروية ≥20.0 نانوغرام/ميكرولتر بينما يجب أن يكون إنتاج اليوريا ≥0.25 نانوغرام/ميكرولتر قبل إجراء تقييم سمية في المختبر مع هذا النموذج.
تقييم السمية الجينية للمواد النانوية المهندسة 10- وفيما يتعلق بتقييم السمية الجينية، استخدم المقايسة النووية الدقيقة لتحديد وجود النوى الدقيقة في أعقاب التعرض الحاد (24 ساعة) والتعرض الطويل الأجل (120 ساعة) للنواقص النمومية. أفلاتوشين B1 هو مادة مسرطنة معروفة للكبد16،17 وهو عنصر تحكم إيجابي موصى به لإجراء فحص النوى الدقيقة. وقد أظهرت تجارب التحسين أن 0.1 ميكرومتر من الفاتوشين B1 يحفز إيجابية كبيرة (≥2.0 أضعاف زيادة) استجابة جنوة في كرويدات الكبد 3D HepG2 وبالتالي يستخدم في كل المقايسة النويدات الدقيقة التي أجريت مع هذا النموذج. لضمان صحة نتائج فحص النويدات الدقيقة باستخدام نموذج كروية HepG2 ، يجب أن يقع تردد النوى الدقيق الخلفي لخلايا HepG2 المستخدمة في هذا النموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر ضمن نطاق 0.6٪ - 1.2٪. ونتيجة لذلك، ينبغي أن يؤدي الفاتوكسيين B1 إلى استجابة سمية جينية أعلى مرتين على الأقل من تلك التي شوهدت مع السيطرة السلبية؛ وبالتالي، فإن 0.1 ميكرومتر من الفاتوكسيين B1 يجب أن تحفز تردد النوكل الدقيق بين 1.5٪ - 3.0٪. وباستخدام معلمات التحكم هذه، يمكن بعد ذلك تقييم السمية الجينية المرتبطة ب ENM في المختبر تقييما موثوقا به. استنادا إلى المبدأ التوجيهي 487 اختبار منظمة التعاون والتنمية في الميدان الاقتصادي، من المهم أن نلاحظ أنه عند اختبار ENM أو مادة كيميائية، والتركيزات المختارة لا ينبغي أن تحفز أكثر من 55٪ ± 5٪ السمية الخلوية (المشار إليها من خلال انخفاض في القيم CPBI أو RVCC فيما يتعلق بالسيطرة السلبية)11. ويوضح الشكل 7 البيانات التي تم توليدها عندما تم تقييم الأفلاتوكسيين B1 واثنين من ENMs (ثاني أكسيد التيتانيوم (TiO2)والشظية (Ag)) بعد التعرض الحاد والطويل الأجل في كرويدات HepG2 ، وتم تحليل إمكانات السمية الجينية اللاحقة باستخدام اختبار النوكلية الدقيقة. وقد تم اختبار كل من ENMs تقييمها في غير السموم، جرعة منخفضة من 5.00 ميكروغرام / مل على التعرض الحاد (24 ساعة) وطويلة الأجل (120 ساعة) نظام التعرض. ويمكن ملاحظة اتجاه مماثل للسمية الجينية عبر كل من TiO2 وAg ENMs ، حيث لم تكن الاستجابة المرتفعة للسمية الجينية التي نتجت عن التعرض لمدة 24 ساعة واضحة بعد التعرض لمدة 5 أيام على المدى الطويل. وكان هذا على الرغم من السمية الجينية المستمرة الناجمة عن السيطرة الإيجابية Aflatoxin B1 في كلتا النقطتين الزمنيتين.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> الشكل 7: تقييم السمية الجينية بعد التعرض TiO2 وAG ENM على كرويدات الكبد HepG2. تقييم السمية الجينية (تردد النويدات الدقيقة) باستخدام وظيفة المقايسة النووية الدقيقة(A)الحادة (24 ساعة) و(ب)التعرض طويل الأجل (120 ساعة) إلى 5.00 ميكروغرام / مل من TiO2 وAg ENM. السيطرة السلبية هي وسائل الإعلام فقط، في حين أن السيطرة الإيجابية هي 0.1 ميكرومتر من أفلاتوشين B1. متوسط البيانات (n=2) المقدمة ± SD. الأهمية المشار إليها فيما يتعلق بالتحكم السلبي: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

وقد ثبت أن هذا الإجراء يستخدم لتطوير ثقافات كبدية ثلاثية الأبعاد متقدمة في المختبر، والتي يمكن أن توفر تقييما أكثر ملاءمة من الناحية الفسيولوجية للمخاطر الجينية المرتبطة بالتعرض للمواد النانوية على حد سواء على المدى الحاد أو الطويل، نظم الجرعة المتكررة.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

في المختبر خلية الثقافة نموذج لاستنشاق الفحوصات الكيميائية السامة

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

تقييم تأثير التعرض المتكرر من عضوي النمط 3D الشعبي والأنف زراعة الأنسجة نماذج لكامل دخان السجائر

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

تحسين 2D و 3D الجلد<em&gt; في المختبر</em&gt; نماذج عن طريق الجزيئات الازدحام

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

تحسين 3D المائية الثقافات من الخلايا الدبقية الأولية لنمذجة في المختبر نيوروينفلاميشن

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

تطبيق متقدم في المختبر استزراع التكنولوجيا لدراسة الحجمية القناة الهضمية البشرية

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

في المختبر 3D نماذج الشرايين الخلية المستزرعة لدراسة استهداف المخدرات الأوعية الدموية تحت التدفق

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...