Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Forfatterne vil gerne anerkende, at denne forskning har modtaget støtte fra EU's Horizon 2020-forsknings- og innovationsprogram for PATROLS-projektet i henhold til tilskudsaftale nr.

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Ansøgninger om 3D-levermodeller varierer betydeligt afhængigt af det særlige biokemiske slutpunkt eller den negative resultatvej, der målrettes mod. Hver model har sine fordele og begrænsninger, fra interdonor variation i primære menneskelige hepatocyt (PHH) modeller til reduceret cytochrom p450 aktivitet i celle-line baserede modeller, men alle er værdifulde i deres egen ret6,12,18,19. Ved vurdering af genotoksicitet er der begrænsninger i modellernes kompatibilitet med regulatoriske godkendte slutpunkter såsom in vitro-mikrokerneanalysen, da aktiv spredning er påkrævet. Dette er nødvendigt, da genotoksicitetsvurdering kræver kvantificering af fast DNA-skade, der skal vurderes efter celledeling, når der er mulighed for DNA-reparation for at korrigere forbigående læsioner. Desværre, meget differentieret hepatocyt (dvs. HepaRG) baseret sfæroider eller PHH mikrotissues, som anses for at udvise de mest fysiologisk relevante lever-lignende egenskaber form statisk (ikke-proliferative) modeller12,19,20. Som et resultat giver 3D HepG2-kugleformet model præsenteret her en passende, alternativ model, der er i stand til at understøtte genotoksicitetstest. HepG2 celle-line baseret sfæroider har tilstrækkelig aktivt dividere celler på ydersiden af spheroids samtidig opretholde grundlæggende lever-lignende egenskaber, såsom albumin og urinstof produktion og nogle CYP450 aktivitet5,12,19. Hovedsagelig denne in vitro lever model er blevet udviklet til at supplere micronucleus assay, da dette er en af de to in vitro assays anbefales i batteriet til genotoksicitet test8,10,11,21. Modellen kan dog let anvendes til DNA-sekventeringsanalyse og RNA-teknologier (Gene Expression), mens den har potentialet til at blive yderligere tilpasset og udnyttet til andre DNA-skadesslutpunkter, såsom kometanalysen. Ikke desto mindre er det vigtigt at overveje den rolle, som ENM-interferens spiller i nogle slutpunktsanalyser. F.eks. er flowcytometribaserede analyser muligvis ikke egnede til ENM-genotoksicitetsvurdering specifikt på grund af partikelinterferens22.
En begrænsende faktor for sfæroide modeller, der aktivt gennemgår celledeling, er deres størrelse. Optimering af såningstætheden er kritisk, da der skal være nok celler, der gør det muligt for modellen at fortsætte med at formere sig; men ikke for højt et cellenummer, hvilket resulterer i, at kugleformet bliver alt for kompakt, hvilket fører til en øget nekrotisk kerne. Årsagen til denne nekrose menes at være begrænset ilt og næringsstof diffusion, som grænsen for denne diffusion menes at være ca 100 – 150 μm væv23,24. Dette afhænger dog af celletype, cellenummer, stilladsinteraktioner og kulturforhold25. Siden har det vist sig, at ca. 700 μm diameter er grænsen for at undgå for tidlig nekrose i midten af C3A-sfæroider, såning 4000 HepG2-celler pr. kugleform sikrer, at modellens diameter på eksponeringstidspunktet er ≤500 μm26. Desuden fastslog Shah et al., at HepG2-celler, der var seedet over 5000 celler pr. kugleformet, udviste en 25% reduktion i levedygtigheden efter 7 dage i kultur, hvilket kunne vedrøre den gennemsnitlige diameter på 680 μm og begrænset tilgængelighed af næringsstoffer i en 20 μL hængende dråbe5. For at overvinde dette gennemgår modellen, der er udtænkt i denne protokol, et kritisk trin, hvor den hængende dråbe overføres til agarosebelagte brønde efter den første dannelse af kugleformet. Dette sikrer en større mængde af kultur medium er til stede for at opretholde det stadigt stigende antal celler i spheroids. Som følge heraf forbliver HepG2-kugleformet model over 70% levedygtig efter 10 dage i kultur og kan bruges til langsigtet farevurdering in vitro. 
Mens HepG2 sfæroid model kan støtte både akut og langsigtet eksponering regimer, forfriskende cellekultur medium i længere kultur perioder er begrænset til denne model som fuldstændig udskiftning af mediet anbefales ikke på grund af det potentielle tab af spheroids. Det antages, at med ENM-eksponeringer er tendensen til homogene ENM-dispersioner til agglomerat og sediment høj. Det er imidlertid bemærkelsesværdigt, at den hastighed, hvormed en ENM-sedimenter kan variere afhængigt af partikelparametrene (f.eks. størrelse, form og tæthed) og kan bestemmes teoretisk ved hjælp af in vitro-sedimentations-, diffusions- og dosimetrimodellen (ISDD) eller dens nylige derivater, der ofte henvises til, når det drejer sig om ENM-eksponering (suspension) nærmer sig27,28. Med dette er sind, antages det, at hvis kun 50% af cellekulturmediet forsigtigt fjernes fra overfladen af cellekulturen, bør forstyrrelsen og den efterfølgende fjernelse af ENM-dosis i teorien være minimal. Med Brownian-bevægelse på spil er dette dog muligvis ikke strengt tilfældet, og der bør arbejdes videre med depositionen og sedimenteringen af hver enkelt ENM, der skal testes, for at sikre, at den korrekte dosimetri bevares under hele de langsigtede eksponeringsordninger27. Dette er hovedsagelig en potentiel begrænsning at overveje, når der udføres gentagne doseringsordninger, da dette kan være afgørende for den endelige akkumulerede koncentration. Kemisk baserede eksponeringer giver på den anden side, selv om de ikke er uden deres egne begrænsninger at overveje, en mere forenklet tilgang, idet kemiske stoffer har tendens til at forblive i opløsning, og en direkte erstatning af den oprindelige kemiske koncentration ud over den nyligt tilsatte koncentration sikrer, at ethvert kemikalie, der går tabt under medieforfriskning, erstattes i overensstemmelse hermed29. Fremtidige anvendelser vil omfatte en vurdering af modellens egnethed til gentagne eksponeringsordninger over længerevarende kulturperioder, da gentagne doseringsstrategier er af afgørende betydning for vurderingen af et bestemt organsystems evne til at forbedre eller overvinde eventuelle negative virkninger som følge af bioakkumulering af et xenobiotisk stof.
Afslutningsvis vil jeg sige, at denne 3D-in vitro-levermodel har kapacitet til at blive anvendt til at evaluere en række realistiske eksponeringsscenarier, hvilket giver en fremtidig in vitro-tilgang til bedre støtte til både ENM og kemikalierisikovurdering på en rutinemæssig og lettilgængelig måde.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

På grund af den hurtige udvikling og implementering af en bred vifte af manipulerede nanomaterialer (ENM) på tværs af en overflod af menneskebaserede applikationer (f.eks. fødevarer, kosmetik, tøj, sportsudstyr, elektronik, transport og medicin) er det uundgåeligt, at mennesker regelmæssigt vil blive udsat for ENM. Med dette er der øget bekymring for, at de nye, størrelsesspecifikke fysiokemiske egenskaber, der anser disse materialer for fordelagtige i mange applikationer, kan forårsage negative virkninger på menneskers sundhed og miljøet samtidig. I øjeblikket er der mange internationale aktiviteter på plads for aktivt at afspejle mere fysiologisk relevante eksponeringer for disse ENM og vurdere disse materialers potentielle toksicitet i scenarier med akut, langvarig og gentagen lavdosiseksponering.
Levertoksikologi er nøglen, når man overvejer ENM-eksponering, da det er almindeligt kendt, at leveren er et vigtigt sted for ENM-akkumulering efter eksponering1,2. Desuden er leveren det primære organsystem til metabolisme og afgiftning af stoffer, der kommer i systemiskcirkulation 3. Baseret på den accepterede forståelse af , at 2D hepatocytmodeller ikke nøjagtigt efterligner kompleksiteten af indviklede flercellede interaktioner eller passende repræsenterer metabolisk aktivitet observeret in vivo , er der etableret et større fokus på at udvikle robuste og fysiologisk relevante in vitro 3D-levermodeller for in vivo-erstatningsteknologier4,5. Brug af avancerede 3D-kulturteknologier forbedrer levetiden af in vitro-levermodeller, hvilket giver mulighed for langsigtede, gentagne eksponeringsordninger, der skal undersøges. Derudover fremmer dette avancerede kulturformat dannelsen af forbedrede fysiologiske, organotypiske træk som galdekanaliculi, aktive transportprocesser og forbedrede CYP450-lægemiddelmetaboliseringsfunktioner, hvilket forbedrer forudsigeligheden af modellerne6. Nuværende 3D-in vitro-levermodeller bestående af monokulturer (kun hepatocytter) eller samkulturer (hepatocytter med ikke-parenchymale celler) findes i flere formater, lige fra mikrotissuer eller sfæroider i ultralow vedhæftningsplader, hængende dråbesprædroider, celler indlejret i matricer og/eller stilladser og mikrofluidiske cellekulturplatforme, som alle anses for effektive avancerede in vitro-modeller til vurdering af levertoksicitet6,7. Men de fleste af disse modelsystemer er høj vedligeholdelse, kræver specialiseret udstyr og er dyre. Desuden er disse modeller ofte statiske (dvs. ikke-opdelte cellemodeller), der forhindrer deres anvendelse i vurderingen af fareslutpunkter, såsom genotoksicitetstest ved hjælp af metoder, der kvantificerer fast DNA-skade. Genotoksicitet er en central forudsætning for lovgivningsmæssig toksikologi, og det er en vigtig del af risikovurderingen af ethvert toksiksmiddel8. Der er ingen enkelt analyse, der kan anvendes til at kvantificere alle former for DNA-skader, der kan opstå efter eksponering for et eksogent middel. En kernekomponent i in vitro-genotoksicitetstestbatteriet er imidlertid mikrokerneanalysen, som er en pålidelig og mangefacetteret teknik, der måler bruttokromosomskader9. Det er en guldstandardteknik, der er beskrevet i OECD's testretningslinje 487 til vurdering af in vitro-DNA-skader og genotoksicitet og er en del af kravet om testbatterier til lovgivningsmæssig farevurdering10,11.
Den menneskelige hepatocellulære karcinomcellelinje, HepG2, anvendes bredt til indledende risikovurderingsscreening, da cellerne er let tilgængelige, relativt billige at købe, enkle at kultur og modtagelige for høj gennemløbsscreening12,13. Når de dyrkes i 3D-sfæriske strukturer, har de vist sig at opsummere levermikromiljøet godt og tilbyde en levermodel med tilstrækkelige proliferative evner til at understøtte mikrokerneanalysen3. Yderligere udvikling af HepG2-sfæroidmodellerne blev etableret for at forbedre modellens levetid og leverlignende funktionalitet for at understøtte vurdering af genotoksicitetsfare over langsigtede, gentagne eksponeringsordninger (≤14 dage). I overensstemmelse med principperne i 3R'erne til erstatning, reduktion og forfinelse af dyreforsøg er denne protokol således blevet udarbejdet for at tilvejebringe en avanceret 3D-in vitro-levermodel, der er i stand til pålideligt at evaluere flere toksikologiske slutpunkter (f.eks. leverfunktionalitet, (pro-)inflammatoriske markører, cytotoksicitet og genotoksicitet) efter akut, langvarig og gentagen kemisk og ENM-eksponering på en rutinemæssig og let tilgængelig måde.
Her præsenterer vi en metode til at etablere et fysiologisk relevant 3D-hepatocytcellelinjebaseret in vitro-modelsystem til vurdering af genotoksicitetsfare efter akutte eller langsigtede, gentagne ENM-eksponeringer. Protokollen kan opdeles i 6 centrale faser: dyrkning cryopreserved HepG2 celler; HepG2 sfæroid forberedelse; HepG2 sfæroid overførsel fra hængende dråbe til agarose suspension; HepG2 sfærisk høst; mikrokerneanalyse og -scoring og dataanalyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

På grund af den hurtige udvikling og implementering af en bred vifte af manipulerede nanomaterialer (ENM) er eksponering for ENM uundgåelig, og udviklingen af robuste, prædiktive in vitro-testsystemer er afgørende. Levertoksikologi er nøglen, når man overvejer ENM eksponering, som leveren tjener en afgørende rolle i metaboliske homøostase og afgiftning samt at være et vigtigt sted for ENM akkumulering post eksponering. Baseret på dette og den accepterede forståelse af, at 2D-hepatocytmodeller ikke nøjagtigt efterligner kompleksiteten af indviklede multicellulære interaktioner og metabolisk aktivitet observeret in vivo, er der større fokus på udviklingen af fysiologisk relevante 3D-levermodeller skræddersyet til ENM-farevurderingsformål in vitro. I overensstemmelse med principperne i 3R'erne til at erstatte, reducere og forfine dyreforsøg er der udviklet en 3D HepG2 cellelinjebaseret levermodel, som er et brugervenligt og omkostningseffektivt system, der kan understøtte både udvidede og gentagne ENM-eksponeringsordninger (≤14 dage). Disse sfæroide modeller (≥ 500 μm i diameter) bevarer deres proliferative kapacitet (dvs. dividere cellemodeller), så de kan kombineres med mikrokerneanalysen »guldstandard« for effektivt at vurdere genotoksicitet in vitro. Deres evne til at rapportere om en række toksikologiske endpoints (f.eks. leverfunktion, (pro)inflammatorisk respons, cytotoksicitet og genotoksicitet) er blevet karakteriseret ved hjælp af flere ENMs på tværs af både akutte (24 h) og langsigtede (120 h) eksponeringsregimer. Denne 3D-in vitro-levermodel har kapacitet til at blive anvendt til at evaluere mere realistiske ENM-eksponeringer, hvilket giver en fremtidig in vitro-tilgang til bedre at understøtte ENM-farevurdering på en rutinemæssig og lettilgængelig måde.

Egnetheden af denne celle-line baseret 3D lever sfæroid model for langsigtet kultur og genotoksisk fare vurdering blev evalueret ved at gennemføre baseline karakterisering at bestemme levedygtigheden og lever-lignende funktionalitet af modellen i løbet af 14 dage i kultur samt dens anvendelighed for micronucleus assay.
Baseline Karakterisering af 3D HepG2 Lever Sfæroid Model Forud for enhver in vitro toksikologisk vurdering er det vigtigt at kontrollere, at 3D HepG2-sfæroiderne er dannet korrekt, før de udfører agaroseoverførslen eller kemisk /ENM-behandling. HepG2-sfæroider, der produceres ved hjælp af den hængende dråbemetode, tager normalt 2 - 3 dage efter såning (4000 celler / sfæroid) for at danne kompakte, sfæriske formede sfæroider med en gennemsnitlig diameter på 495,52 μm W x 482,69 μm H som vist i figur 5A-5C. HepG2-sfæroider, der er dannet korrekt og kan accepteres anvendt til in vitro-toksikologisk vurdering, skal have en kompakt, sfærisk formet struktur med en glat overflade og ingen visuelle fremskrivninger. Figur 5 giver eksempler på god kvalitet (figur 5D-F) og spadseroider af dårlig kvalitet ( figur5G-I). Sidstnævnte bør kasseres. Typisk vil 90-95% af sfæroider dannet pr plade dannes korrekt og være levedygtige for yderligere eksperimenter.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figur 5: Lysmikroskopibilleder, der viser hepG2-sfæroidernes naturlige morfologi dannet ved hjælp af den hængende dråbemetode. (A-C) viser dag 2 og (D-I) Dag 4 HepG2 lever sfæroider efter såning. (D-F) er eksempler på hepG2-sfæroider af god kvalitet, mens (G-I) viser dårligt dannede sfæroider. Alle billeder blev taget på et X20 mål ved hjælp af et mikroskop. Skalalinjen repræsenterer 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
For yderligere at bekræfte HepG2 sfæroid levedygtighed, en grundlæggende colorimetric Bromocresol Green Albumin (BCG) Assay eller Urea Assay kan udføres for at vurdere deres lever-lignende funktionalitet. Leverlignende funktionalitet blev vurderet i overensstemmelse med levedygtigheden ved hjælp af Trypan Blue Exclusion Assay over en 14-dages kulturperiode for at bestemme levetiden af leverspærremodellen og fastslå, om den kunne understøtte langsigtet eller gentagen ENM/kemisk baseret farevurdering (Figur 6). Albuminkoncentrationen forblev konsistent i kulturperiodens varighed. Urinstofproduktionen viser en stigning i koncentrationen af urinstof produceret pr. kugleformet over en uge i kultur, før den når et plateau dag 7. Det er vigtigt at bemærke, at niveauet af albumin og urinstof produceret i 3D HepG2-sfæroiderne er væsentligt højere end det, der observeres i samme cellelinje dyrket i et 2D-format. Faktisk var 2D-kulturer af HepG2-celler, peak albumin og urinstofniveauer henholdsvis 0,001 mg / mL og 0,010 ng / μL. Desuden, i tidligere arbejde udgivet af Shah et al. ved hjælp af en næsten identisk HepG2 sfæroid system, forfatterne fremhæve en bemærkelsesværdig forbedring i metabolisk aktivitet (CYP1A1 og CYP1A2) i 3D HepG2 in vitro model systemer i forhold til 2D dyrkede HepG2 celler5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figur 6: 14-dages basiskarakteriseringsdata for HepG2-leverspærreoider. Efter overførsel fra hængende dråbe fremhæver (A) levedygtigheden af HepG2-kugleformet model over en 14-dages periode, mens (B) og (C) fremhæver henholdsvis leverlignende albumin- og urinstoffunktionalitet. Gennemsnitsdata ± præsenteret for SEM, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Med den uundgåelige udvikling af en nekrotisk kerne, en kendt begrænsning af 3D-lever sfæroid kulturer, levedygtigheden af denne HepG2 baseret model skulle etableres for at påvise, at det var i stand til at opretholde langsigtede (5-10 dage) eksponering regimer og samtidig opretholde den proliferative kapacitet, der kræves for at støtte mikrokerne assay5. Faktisk har denne 3D-lever sfæroid model vist sig at bevare 70% levedygtighed over 10 dage i kultur. Baseret på dette og i forbindelse med den vedvarende leverlignende funktionalitet observeret i løbet af ≥14 dages kulturperiode kan denne 3D-leverspærremodel således understøtte langsigtede, gentagne ENM-eksponeringsordninger op til 10 dage lange (dvs. før sfæroidernes levedygtighed falder til under 70%). Til reference anbefales det, at albuminniveauerne for HepG2-sfæroider, der er seedet ved 4000 celler/sfæroide, skal ≥20,0 ng/μL, mens urinstofproduktionen skal ≥0,25 ng/μL, før der foretages en in vitro-toksikologisk vurdering med denne model.
Genotoksicitet Vurdering af manipulerede nanomaterialer Ved vurdering af genotoksicitet blev mikrokerneanalysen anvendt til at bestemme tilstedeværelsen af mikrokerner efter både akutte (24 h) og langsigtede (120 h) ENM-eksponeringer. Aflatoksin B1 er en kendt lever kræftfremkaldende16,17 og er en anbefalet positiv kontrol for micronucleus assay. Optimeringseksperimenter har vist, at 0,1 μM Alfatoxin B1 fremkalder en betydelig positiv (≥2,0 fold stigning) genotoksisk respons i 3D HepG2 leverspærre og dermed anvendes i hver mikrokerneanalyse udført med denne model. For at sikre gyldigheden af mikrokerneanalyseresultaterne ved hjælp af HepG2-kugleformen skal baggrundsmikrokernefrekvensen for HepG2-celler, der anvendes i denne 3D-in vitro-model, ligge inden for et interval på 0,6% – 1,2%. Som følge heraf bør Alfatoxin B1 fremkalde en genotoksisk reaktion, der er mindst dobbelt højere end den, der ses med den negative kontrol; Således bør 0,1 μM Alfatoxin B1 fremkalde en mikrokernefrekvens mellem 1,5% – 3,0%. Ved hjælp af disse kontrolparametre kan enm-associeret genotoksicitet in vitro derefter vurderes pålideligt. På grundlag af OECD's testretningslinje 487 er det vigtigt at bemærke, at de udvalgte koncentrationer ved test af en ENM eller et kemikalie ikke må fremkalde mere end 55 % ± 5 % cytotoksicitet (angivet ved en reduktion i CPBI- eller RVCC-værdierne i forhold til den negative kontrol)11. Figur 7 illustrerer de data, der genereres, når aflatoksin B1 og to ENMs (titandioxid (TiO2) og splint (Ag)) blev evalueret efter både akutte og langsigtede eksponeringer i HepG2-sfæroiderne, og efterfølgende genotoksisk potentiale blev analyseret ved hjælp af mikrokerneanalysen. Begge vurderede ENM'er blev testet ved en ikke-cytotoksisk, lav dosis på 5,00 μg/mL over en akut (24 h) eksponering og langvarig (120 h) eksponeringsordning. En lignende tendens til genotoksicitet på tværs af både TiO2 og Ag ENMs kan observeres, hvorved den forhøjede genotoksicitetsrespons, der resulterede efter 24 timers eksponering, ikke var tydelig efter en langvarig 5-dages eksponering. Dette var på trods af vedvarende genotoksicitet forårsaget af aflatoksin B1 positiv kontrol på begge tidspunkter.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figur 7: Genotoksicitetsvurdering efter TiO2- og Ag ENM-eksponering på HepG2-leversprædroider. Vurdering af genotoksicitet (mikrokernefrekvens) ved hjælp af mikrokerneanalyseposten (A) akut (24 timer) og (B) langvarig (120 timer) eksponering for 5,00 μg/mL TiO2 og Ag ENM. Negativ kontrol er kun et medie, mens den positive kontrol er 0,1 μM af aflatoksin B1. Gennemsnitlige data (n=2), der præsenteres ± SD. Betydning angivet i forhold til den negative kontrol: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Denne procedure blev indført for at udvikle avancerede 3D-leverkulturer in vitro, som kan give en mere fysiologisk relevant vurdering af de genotoksiske farer, der er forbundet med nanomaterialeeksponering over både en akut eller langvarig, gentagen dosis regimer.

Avancerede 3D-levermodeller til in vitro genotoksicitetstest efter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro-cellekultur Model for Toxic Inhaleret Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensanalyse af gentagen eksponering af organotypisk 3D bronchiale og Nasal vævskultur Modeller til Whole Cigarette Smoke

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En Mikrofluid platform for langsigtet Multi-væv cokultur

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øjenirritation Test (EIT) for Hazard Identifikation af Eye Irriterer Kemikalier hjælp rekonstrueret human Cornea-lignende Epithelial (RHCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedring 2D og 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modeller Brug Macromolecular Fortrængning

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese af Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetisk modificerede 3D-PLGA/nHAp stillads til Calvarial kritiske knogle defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Langsigtet Live Imaging enhed for forbedret eksperimentelle manipulering af zebrafisk larver

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer af primære Glial celler for In Vitro modellering af Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Anvende avancerede In Vitro dyrkning teknologi for at studere den menneskelige Gut mikrobiota

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Celle-kulturperlede arterielle modeller til at studere vaskulære Drug Targeting Under Flow

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...