Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
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Les auteurs aimeraient reconnaître que cette recherche a reçu des fonds du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne pour le projet PATROLS, en vertu de l’accord de subvention n° 760813

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Les applications pour les modèles hépatiques 3D varient considérablement selon le point de terminaison biochimique particulier ou la voie défavorable de résultats étant visée. Chaque modèle a ses avantages et ses limites, de la variation interdonor dans les modèles primaires d’hépatocyte humain (PHH) à l’activité réduite de cytochrome p450 dans les modèles basés sur la ligne cellulaire, mais tous sont valables dans leur propredroit 6,12,18,19. Lors de l’évaluation de la génotoxicité, il y a des limites dans la compatibilité des modèles avec les critères d’évaluation approuvés par la réglementation tels que l’analyse in vitro du micronucléus, car la prolifération active est nécessaire. Ceci est nécessaire, car l’évaluation de génotoxicité exige la quantification des dommages fixes d’ADN pour être évaluée division de poteau de cellule quand il y a l’occasion pour la réparation d’ADN pour corriger des lésions passagères. Malheureusement, les hépatocytes à base d’hépatocytes hautement différenciés (c.-à-d. les sphéroïdes à base d’HépaRG) ou microtissues PHH, qui sont réputés présenter les caractéristiques hépatiques les plus pertinentes sur le plan physiologique, forment des modèles statiques (non prolifératifs)12,19,20. En conséquence, le modèle sphéroïde 3D HepG2 présenté ici fournit un modèle alternatif approprié capable de soutenir les tests de génotoxicité. Les sphéroïdes à base de lignée cellulaire HepG2 ont suffisamment de cellules de division active sur la surface externe des sphéroïdes tout en conservant des caractéristiques hépatiques de base, telles que la production d’albumine et d’urée et certaines activités CYP4505,12,19. Principalement ce modèle de foie in vitro a été développé pour compléter l’analyse de micronucléus, car c’est l’un des deux essais in vitro recommandés dans la batterie pour l’essai de génotoxicité8,10,11,21. Cependant, le modèle peut être facilement appliqué aux technologies d’analyse du séquençage de l’ADN et d’expression des gènes (ARN), alors qu’il a le potentiel d’être davantage adapté et utilisé pour d’autres critères d’évaluation des dommages à l’ADN, tels que l’analyse de la comète. Néanmoins, il est important de tenir compte du rôle que joue l’interférence ENM dans certaines analyses de points de terminaison. Par exemple, les analyses basées sur la cytométrie de flux peuvent ne pas convenir à l’évaluation de la génotoxicité enM spécifiquement en raison de l’interférence desparticules 22.
Un facteur limitant des modèles sphéroïdes qui subissent activement la division cellulaire est leur taille. L’optimisation de la densité d’ensemencement est essentielle car il doit y avoir suffisamment de cellules qui permettent au modèle de continuer à proliférer; mais pas trop élevé un nombre de cellules, ce qui entraîne le sphéroïde devient trop compact, conduisant à un noyau nécrotique accru. La cause de cette nécrose est considérée comme limitant la diffusion de l’oxygène et des nutriments, car la limite de cette diffusion est considérée comme environ 100 - 150 μm de tissu23,24. Toutefois, cela dépend du type de cellule, du numéro de cellule, des interactions d’échafaudage et des conditions de culture25. Depuis, il a été démontré qu’environ 700 μm de diamètre est la limite pour éviter l’apparition prématurée de la nécrose au centre des sphéroïdes C3A, l’ensemencement de 4000 cellules HepG2 par sphéroïde assure le diamètre du modèle au moment de l’exposition est de ≤500 μm26. En outre, Shah et coll. ont établi que les cellules HepG2 ensemencées au-dessus de 5000 cellules par sphéroïde présentaient une réduction de 25 % de la viabilité après 7 jours de culture, ce qui pourrait se rapporter au diamètre moyen de 680 μm et à la disponibilité limitée des nutriments dans une goutte suspendue de 20 μL5. Pour surmonter cela, le modèle conçu dans le présent protocole subit une étape critique où la goutte suspendue est transférée dans des puits recouverts d’agarose après la formation initiale du sphéroïde. Cela garantit un plus grand volume de milieu de culture est présent pour soutenir le nombre sans cesse croissant de cellules dans les sphéroïdes. En conséquence, le modèle sphéroïde HepG2 reste plus de 70% viable après 10 jours en culture et peut être utilisé pour l’évaluation des risques à long terme in vitro. 
Tandis que le modèle sphéroïde d’HepG2 peut soutenir des régimes aigus et à long terme d’exposition, le milieu rafraîchissant de culture cellulaire pendant des périodes prolongées de culture est limité pour ce modèle car le remplacement complet du milieu n’est pas conseillé en raison de la perte potentielle des sphéroïdes. On présume qu’avec les expositions à l’ENM, la tendance à des dispersions homogènes de l’ENM à l’aggloméate et aux sédiments est élevée. Toutefois, il est à noter que la vitesse à laquelle un ENM sédimente peut varier en fonction des paramètres des particules (p. ex., taille, forme et densité) et peut être déterminée théoriquement à l’aide du modèle de sédimentation, de diffusion et de dosimétrie in vitro (DISD), ou de ses dérivés récents, souvent mentionnés lorsqu’il s’agit de l’exposition à l’ENM (suspension),approche 27,28. Avec ceci est esprit, on suppose que si seulement 50% du milieu de culture cellulaire est soigneusement enlevé de la surface de la culture cellulaire, la perturbation et l’enlèvement ultérieur de la dose d’ENM devraient en théorie être minimes. Toutefois, avec le mouvement brownien en jeu, ce n’est peut-être pas strictement le cas et d’autres travaux de dépôt et de sédimentation de chaque ENM à tester devraient être entrepris pour s’assurer que la dosimétrie correcte est conservée tout au long des régimes d’exposition à long terme27. Il s’agit principalement d’une limitation potentielle à considérer lors de l’exécution de régimes de dosage répétés, car cela pourrait être essentiel à la concentration finale accumulée. Les expositions à base de produits chimiques, d’autre part, bien que non sans leurs propres limites à considérer, offrent une approche plus simpliste en ce que les substances chimiques ont tendance à rester en solution et donc un remplacement direct de la concentration chimique d’origine en plus de la concentration nouvellement ajoutée garantit que tout produit chimique perdu lors du rafraîchissement des médias est remplacéen conséquence 29. Les applications futures comprendraient l’évaluation de l’adéquation du modèle pour les régimes d’exposition répétés sur des périodes de culture à long terme, car les stratégies de dosage répétées sont d’une importance cruciale pour évaluer la capacité d’un système d’organes particulier à améliorer ou à surmonter les effets indésirables, le cas échéant, induits par la bioaccumulation d’une substance xénobiobiotique.
En conclusion, ce modèle hépatique in vitro 3D a la capacité d’être utilisé pour évaluer une gamme de scénarios d’exposition réalistes, offrant ainsi une approche in vitro future pour mieux soutenir l’ENM et l’évaluation des risques chimiques d’une manière routinière et facilement accessible.

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Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

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Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

En raison du développement et de la mise en œuvre rapides d’un large éventail de nanomatériaux d’ingénierie (ENM) dans une pléthore d’applications à base humaine (p. ex., alimentation, cosmétiques, vêtements, équipements sportifs, électronique, transport et médecine), il est inévitable que les humains soient exposés régulièrement à l’ENM. Avec cela, on s’inquiète de plus en plus du fait que les caractéristiques physiochimiques nouvelles et spécifiques à la taille qui jugent ces matériaux avantageux dans de nombreuses applications pourraient avoir des effets néfastes sur la santé humaine et l’environnement simultanément. À l’heure actuelle, de nombreuses activités internationales sont en place pour refléter activement des expositions plus pertinentes sur le plan physiologique à ces ENM et évaluer la toxicité potentielle de ces matériaux par rapport aux scénarios d’exposition aiguë, à long terme et répétées à faible dose.
La toxicologie hépatique est essentielle lors de l’examen de l’exposition à l’ENM, car il est largement connu que le foie est un site majeur de l’accumulation ENM aprèsexposition 1,2. En outre, le foie est le système principal d’organe pour le métabolisme et la désintoxication des substances qui entrent dans la circulation systémique3. Sur la base de la compréhension acceptée que les modèles d’hépatocytes 2D n’imitent pas exactement les complexités des interactions multicellulaires complexes ou représentent de manière appropriée l’activité métabolique observée in vivo, un plus grand accent a été mis sur le développement de modèles hépatiques 3D in vitro robustes et physiologiquement pertinents pour les technologies de substitution in vivo aété établi 4,5. L’utilisation de technologies avancées de culture 3D améliore la longévité des modèles hépatiques in vitro, ce qui permet d’étudier des régimes d’exposition répétés à long terme. En outre, ce format de culture avancée favorise la formation de caractéristiques physiologiques et organotypiques améliorées telles que le canaliculi biliaire, les processus de transport actif et l’amélioration des capacités de métabolisation des médicaments CYP450, améliorant ainsi la prévisibilité des modèles6. Les modèles hépatiques 3D actuels, composés de monocultures (hépatocytes seulement) ou de co-cultures (hépatocytes avec cellules non paroenchymales) existent sous plusieurs formats, allant des microtissues ou sphéroïdes dans des plaques d’adhérence ultralow, sphéroïdes suspendus goutte, cellules intégrées dans les matrices et / ou échafaudages et plates-formes de culture cellulaire microfluidique, qui sont tous considérés comme efficaces modèles avancés in vitro pour l’évaluation de la toxicité hépatique6,7. Cependant, la majorité de ces systèmes modèles sont à entretien élevé, nécessitent de l’équipement spécialisé et sont coûteux. En outre, ces modèles sont souvent statiques (c.-à-d. modèles cellulaires non divisés) qui empêchent leur utilisation dans l’évaluation des points de terminaison des dangers, tels que les tests de génotoxicité utilisant des méthodes qui quantifient les dommages fixes à l’ADN. La génotoxité est une condition essentielle à la toxicologie réglementaire, et elle est un élément essentiel de l’évaluation des risques de tout toxicant8. Il n’y a pas de seul essai qui peut être appliqué pour quantifier toutes les formes de dommages à l’ADN qui peuvent survenir après l’exposition à un agent exogène. Cependant, un composant central de la batterie d’essai de génotoxicité in vitro est l’essai de micronucléus, qui est une technique fiable et multifacetted qui mesure les dommages chromosomiques bruts9. Il s’agit d’une technique d’étalon-or décrite par la Ligne directrice 487 de l’OCDE sur les tests, pour évaluer les dommages et la génotoxicité de l’ADN in vitro, et elle fait partie de l’exigence relative à la batterie d’essaipour l’évaluation réglementaire des risques 10,11.
La lignée cellulaire du carcinome hépatocellulaire humain, HepG2, est largement utilisée pour le dépistage initial de l’évaluation des dangers, car les cellules sont facilement disponibles, relativement peu coûteuses à la source, simples à la culture et à un criblage à hautdébit 12,13. Lorsqu’ils sont cultivés dans des structures sphériques 3D, il a été démontré qu’ils récapitulent bien le microenvironnement hépatique et offrent un modèle hépatique avec des capacités prolifératives suffisantes pour soutenir l’analyse de micronucléus3. D’autres développements des modèles sphéroïdes HepG2 ont été mis en place pour améliorer la longévité et la fonctionnalité hépatique du modèle afin de soutenir l’évaluation des risques de génotoxicité sur les régimes d’exposition répétés à long terme (≤14 jours). Ainsi, conformément aux principes des 3R pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale, le protocole actuel a été établi pour fournir un modèle hépatique in vitro avancé en 3D capable d’évaluer de manière fiable de multiples critères toxicologiques (p. ex., fonctionnalité hépatique, marqueurs inflammatoires (pro)inflammatoires, cytotoxicité et génotoxicité) suivant des expositions chimiques aiguës, à long terme et répétées et enm d’une manière routinière et facilement accessible.
Ici, nous présentons une méthode pour établir une lignée physiologiquement pertinente de cellules d’hépatocyte 3D basée le système in vitro de modèle pour l’évaluation de danger de génotoxicité suivant les expositions aiguës ou à long terme, répétées d’ENM. Le protocole peut être décomposé en 6 étapes clés : la culture des cellules hepG2 cryopréservées; Préparation sphéroïde HepG2; Transfert de sphéroïdes HepG2 de la chute suspendue à la suspension agarose; Récolte de sphéroïdes HepG2; analyse et notation de micronucléus ; et l’analyse des données.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

En raison du développement et de la mise en œuvre rapides d’un large éventail de nanomatériaux d’ingénierie (ENM), l’exposition à l’ENM est inévitable et le développement de systèmes de test in vitro robustes et prédictifs est essentiel. La toxicologie hépatique est essentielle lors de l’examen de l’exposition à l’ENM, car le foie joue un rôle vital dans l’homéostasie métabolique et la désintoxication, en plus d’être un site majeur d’accumulation enM après exposition. Sur la base de ceci et de la compréhension acceptée que les modèles d’hépatocyte 2D n’imitent pas exactement les complexités des interactions multicellulaires complexes et de l’activité métabolique observée in vivo, il y a un plus grand accent sur le développement des modèles physiologiquement pertinents de foie 3D adaptés aux buts in vitro d’évaluation de danger d’ENM. Conformément aux principes des 3R pour remplacer, réduire et affiner l’expérimentation animale, un modèle hépatique à base de lignée cellulaire 3D HepG2 a été développé, qui est un système convivial et rentable qui peut prendre en charge les régimes d’exposition à la FOIS prolongés et répétés en MATIÈRE (≤14 jours). Ces modèles sphéroïdes (≥500 μm de diamètre) conservent leur capacité proliférative (c.-à-d. les modèles cellulaires de division) leur permettant d’être couplés à l’analyse micronucléus « étalon-or » pour évaluer efficacement la génotoxicité in vitro. Leur capacité de rendre compte d’une gamme de critères d’évaluation toxicologiques (p. ex., fonction hépatique, réponse (pro)inflammatoire, cytotoxicité et génotoxicité) a été caractérisée à l’aide de plusieurs ENM dans les régimes d’exposition aigus (24 h) et à long terme (120 h). Ce modèle hépatique in vitro 3D a la capacité d’être utilisé pour évaluer des expositions enM plus réalistes, offrant ainsi une approche in vitro future pour mieux soutenir l’évaluation des risques ENM d’une manière routinière et facilement accessible.

L’adéquation de ce modèle sphéroïde hépatique 3D basé sur la lignée cellulaire pour la culture à long terme et l’évaluation des risques génotoxiques a été évaluée en effectuant une caractérisation de base pour déterminer la viabilité et la fonctionnalité hépatique du modèle sur une durée de 14 jours en culture ainsi que son applicabilité pour l’essai de micronucléus.
Caractérisation de base du modèle sphéroïde hépatique 3D HepG2 Avant toute évaluation toxicologique in vitro, il est important de vérifier que les sphéroïdes 3D HepG2 se sont formés correctement avant d’effectuer le transfert d’agarose ou le traitement chimique/ENM. Les sphéroïdes HepG2 produits selon la méthode de chute suspendue prennent habituellement de 2 à 3 jours après l’ensemencement (4 000 cellules/sphéroïdes) pour former des sphéroïdes compacts en forme de sphérique d’un diamètre moyen de 495,52 μm W x 482,69 μm H, comme le montre la figure 5A-5C. Les sphéroïdes HepG2 qui se sont formés correctement et qui sont acceptables pour l’évaluation toxicologique in vitro doivent avoir une structure compacte en forme sphérique avec une surface lisse et aucune projection visuelle. La figure 5 fournit des exemples de sphéroïdes de bonne qualité (figure 5D-F) et de mauvaise qualité (figure5G-I). Ces derniers devraient être jetés. En règle générale, 90-95% des sphéroïdes formés par plaque se formeront correctement et seront viables pour d’autres expérimentations.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figure 5: Images de microscopie légère montrant la morphologie naturelle des sphéroïdes HepG2 formés par la méthode de la chute suspendue. (A-C) montrent jour 2 et (D-I) Jour 4 HépG2 sphéroïdes hépatiques après l’ensemencement. (D-F) sont des exemples de sphéroïdes HepG2 de bonne qualité tandis que (G-I) montre sphéroïdes mal formés. Toutes les images ont été prises sur un objectif X20 à l’aide d’un microscope. La barre d’échelle représente 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Pour confirmer davantage la viabilité sphéroïde hepG2, un test d’analyse ou d’urea de base de Bromocresol Green Albumin (BCG) peut être effectué pour évaluer leur fonctionnalité hépatique. La fonctionnalité de base du foie a été évaluée en fonction de la viabilité à l’aide de l’essai trypan blue exclusion sur une période de culture de 14 jours afin de déterminer la longévité du modèle sphéroïde hépatique et d’établir si elle pouvait soutenir l’évaluation à long terme ou répétée des risques à base d’ENM/produits chimiques (figure 6). La concentration d’albumine est restée constante pendant toute la durée de la période culturelle. La production d’urée affiche une augmentation de la concentration d’urée produite par sphéroïde sur une semaine en culture avant d’atteindre un plateau au jour 7. Il est important de noter que les niveaux d’albumine et d’urée produits dans les sphéroïdes 3D HepG2 sont sensiblement plus élevés que ceux observés dans la même lignée cellulaire cultivé dans un format 2D. En effet, les cultures 2D des cellules HepG2, des niveaux d’albumine et d’urée de pointe étaient respectivement de 0,001 mg/mL et de 0,010 ng/μL. En outre, dans des travaux antérieurs publiés par Shah et coll. utilisant un système sphéroïde HepG2 presque identique, les auteurs soulignent une amélioration notable de l’activité métabolique (CYP1A1 et CYP1A2) dans les systèmes de modèle in vitro 3D HepG2 par rapport aux cellules hepG22D cultivés 5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figure 6 : Données de caractérisation de base de 14 jours pour les sphéroïdes hépatiques HepG2. Après le transfert de la chute suspendue, (A) met en évidence la viabilité du modèle sphéroïde HepG2 sur une période de 14 jours tandis que (B) et (C) mettre en évidence le foie comme l’albumine et l’urée fonctionnalité respectivement. Données ± SEM présentées, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
Avec le développement inévitable d’un noyau nécrotique, une limitation connue des cultures sphéroïdes hépatiques 3D, la viabilité de ce modèle basé sur l’hépatite 2 a dû être établie pour démontrer qu’il était capable de maintenir des régimes d’exposition à long terme (5-10 jours) tout en maintenant la capacité proliférative nécessaire pour soutenir l’essai de micronucléus5. En effet, ce modèle sphéroïde hépatique 3D a été montré pour conserver >70% viabilité sur 10 jours en culture. Sur cette base et en conjonction avec la fonctionnalité soutenue de type foie observée au cours de la période de culture de 14 jours ≥, ce modèle sphéroïde hépatique 3D peut ainsi soutenir à long terme, les régimes répétés d’exposition en MEN jusqu’à 10 jours (c.-à-d., avant que la viabilité des sphéroïdes ne tombe en dessous de 70 %). À titre de référence, il est conseillé que les niveaux d’albumine pour les sphéroïdes HepG2 ensemencés à 4000 cellules/sphéroïdes devraient être ≥20,0 ng/μL tandis que la production d’urée devrait être de ≥0,25 ng/μL avant d’effectuer une évaluation toxicologique in vitro avec ce modèle.
Évaluation de la génotoxicité des nanomatériaux d’ingénierie Pour l’évaluation de génotoxicité, l’essai de micronucléus a été employé pour déterminer la présence des micronucléi suivant des expositions aiguës (24 h) et à long terme (120 h) d’ENM. Aflatoxin B1 est un carcinogène connudu foie 16,17 et est un contrôle positif recommandé pour l’analyse micronucléus. Des expériences d’optimisation ont montré que 0,1 μM d’Alfatoxin B1 induit une réponse génotoxique positive significative (≥ 2,0 fois plus) dans les sphéroïdes hépatiques 3D HepG2 et est donc utilisé dans chaque analyse micronucléaire menée avec ce modèle. Pour assurer la validité des résultats de l’analyse micronucléus à l’aide du modèle sphéroïde HepG2, la fréquence micronucléus de fond pour les cellules HepG2 utilisées dans ce modèle in vitro 3D devrait se situer dans une fourchette de 0,6 % à 1,2 %. En conséquence, Alfatoxin B1 devrait induire une réponse génotoxique d’au moins deux fois plus élevé que celle observée avec le contrôle négatif; ainsi, 0,1 μM d’Alfatoxin B1 devrait induire une fréquence de micronucléi entre 1,5% - 3,0%. À l’aide de ces paramètres de contrôle, la génotoxicité associée à l’ENM in vitro peut ensuite être évaluée de manière fiable. D’après la Ligne directrice 487 de l’OCDE sur les essais, il est important de noter que lors de l’essai d’un ENM ou d’un produit chimique, les concentrations sélectionnées ne devraient pas induire plus de 55 % ± une cytotoxicité de 5 % (indiquée par une réduction des valeurs cpbi ou rvcc par rapport au contrôle négatif)11. La figure 7 illustre les données générées lorsque l’Aflatoxine B1 et deux ENM (dioxyde de titane (TiO2) et ruban (Ag)) ont été évalués à la suite d’expositions aiguës et à long terme dans les sphéroïdes HepG2, et le potentiel génotoxique subséquent a été analysé à l’aide de l’analyse du micronucléus. Les deux ENM évalués ont été testés à une faible dose noncytotoxique de 5,00 μg/mL au cours d’une exposition aiguë (24 h) et d’un régime d’exposition à long terme (120 h). On peut observer une tendance similaire à la génotoxicité chez les ENM TiO2 et Ag, selon laquelle la réponse élevée de génotoxicité qui a résulté après une exposition de 24 h n’était pas évidente après une exposition à long terme de 5 jours. Ceci en dépit de la génotoxicité soutenue induite par le contrôle positif d’Aflatoxin B1 aux deux points de temps.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figure 7 :Évaluation de la génotoxité à la suite de l’exposition de TiO2 et ag ENM sur les sphéroïdes hépatiques HepG2. Évaluation de la génotoxité (fréquence micronucléus) à l’aide du poste d’analyse micronucléus (A) aiguë (24heures)et ( B ) exposition à long terme (120 heures) à 5,00 μg/mL de TiO2 et Ag ENM. Le contrôle négatif est un média seulement, tandis que le contrôle positif est de 0,1 μM d’Aflatoxine B1. Données moyennes (n=2) présentées ± SD. Importance indiquée par rapport au contrôle négatif : * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>

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Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Cette procédure a été établie pour être utilisée pour développer des cultures hépatiques 3D avancées in vitro, ce qui peut fournir une évaluation plus physiologiquement pertinente des dangers génotoxiques associés aux expositions aux nanomatériaux sur un régime de dose répété aigu ou à long terme.

Modèles hépatiques 3D avancés pour les tests de génotoxicité in vitro après une exposition à long terme aux nanomatériaux

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cellulaire in vitro modèle de culture pour le contrôle des produits chimiques toxiques inhalés

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Évaluation de l&#39;impact de l&#39;exposition répétée de organotypiques 3D bronchiques et nasales Tissue Culture modèles Whole fumée de cigarette

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Le Multi-Chip organes - Une plate-forme microfluidique à long terme Coculture multi-tissus

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Irritation des yeux Test (IET) pour l&#39;identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Améliorer 2D et 3D Skin<em&gt; In vitro</em&gt; Modèles utilisant macromoléculaire Crowding

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisation de l’angiogenèse par microscopie Multiphoton In Vivo en échafaudage de 3D-PLGA/PNVS génétiquement modifiés pour la réparation osseuse défaut critique substance

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Amélioré l’Hydrogel 3D des Cultures de cellules gliales primaires pour In Vitro la modélisation du neuro-inflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Appliquer des avancées In Vitro culture technologie afin d’étudier la microflore intestinale humaine

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

Modèles artériels 3D cultivés en cellules in vitro pour l’étude du ciblage de médicaments vasculaires sous flux

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...