Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

המחברים מבקשים להכיר בכך שמחקר זה קיבל מימון מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי לפרויקט PATROLS, במסגרת הסכם מענק מס' 760813

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

יישומים עבור דגמי הכבד 3D להשתנות במידה ניכרת בהתאם לנקודת הקצה הביוכימית מסוימת או מסלול תוצאה שלילית להיות ממוקד. לכל דגם יש את היתרונות והמגבלות שלו, החל מווריאציות בין-תאיות במודלים ראשוניים של הפטוציטים אנושיים (PHH) וכלה בפעילות ציטוכרום p450 מופחתת במודלים מבוססי קו תא, אך כולם בעלי ערך בזכות עצמם6,12,18,19. בעת הערכת genotoxicity יש מגבלות בתאימות מודלים עם נקודות קצה שאושרו רגולטורית כגון במבחנה micronucleus assay, כמו התפשטות פעילה נדרשת. זה הכרחי, כמו הערכת genotoxicity דורש כימות של נזק DNA קבוע כדי להיות מוערך לאחר חלוקת התא כאשר יש הזדמנות לתיקון DNA לתקן נגעים חולפים. למרבה הצער, hepatocyte מובחן מאוד (כלומר, HepaRG) מבוסס ספרואידים או microtissues PHH, אשר נחשבים להפגין את המאפיינים הרלוונטיים ביותר מבחינה פיזיולוגית דמויי כבד טופס סטטי (לא שגשוג) מודלים12,19,20. כתוצאה מכך, דגם הכדוריד 3D HepG2 המוצג כאן מספק מודל מתאים ואלטרנטיבי המסוגל לתמוך בבדיקות גנוטוקסיות. Spheroids מבוססי קו התא HepG2 יש מספיק תאים מפרידים באופן פעיל על פני השטח החיצוניים של spheroids תוך שמירה על מאפיינים בסיסיים דמויי כבד, כגון ייצור אלבומין אוריאה וכמה פעילות CYP4505,12,19. בעיקר מודל זה בכבד במבחנה פותחה כדי להשלים את הבדיקה micronucleus, שכן זהו אחד משני מבחני במבחנה מומלץ בסוללה לבדיקת genotoxicity8,10,11,21. עם זאת, המודל יכול להיות מיושם בקלות על ניתוח רצף DNA וטכנולוגיות ביטוי גנים (RNA), בעוד שיש לו פוטנציאל להיות מותאם עוד יותר מנוצל עבור נקודות קצה אחרות נזק DNA, כגון שביט assay. עם זאת, חשוב לקחת בחשבון את התפקיד שהפרעות ENM ממלאות בניתוחים מסוימים של נקודות קצה. לדוגמה, ניתוחים מבוססי cytometry זרימה לא יכול להיות מתאים להערכת genotoxicity ENM במיוחד עקב הפרעה חלקיקים22.
גורם מגביל אחד של מודלים ספרואידיים שעוברים באופן פעיל חלוקת תאים הוא גודלם. אופטימיזציה של צפיפות הזריעה היא קריטית מכיוון שצריכים להיות מספיק תאים המאפשרים למודל להמשיך להתרבות; אבל לא מספר תא גבוה מדי, מה שמוביל לכך שהספרויד הופך לקומפקטי מדי, מה שמוביל לליבה נמקית מוגברת. הגורם לנמק זה הוא האמין להיות מוגבל חמצן ופיזור מים מזינים, כמו הגבול של דיפוזיה זו נחשבת כ 100 – 150 מיקרומטר של רקמה23,24. עם זאת, הדבר תלוי בסוג התא, מספר התא, אינטראקציות הפיגומים ותנאי התרבות25. מאז, הוכח כי כ 700 קוטר מיקרומטר הוא הגבול למניעת התפרצות מוקדמת של נמק במרכז כדורי C3A, זריעת 4000 תאי HepG2 לכל ספרואיד מבטיח את קוטר הדגם בזמן החשיפה הוא ≤500 מיקרומטר26. יתר על כן, Shah et al. קבע כי תאי HepG2 זרעים מעל 5000 תאים לכל ספרואיד הציג ירידה של 25% בכדאיות לאחר 7 ימים בתרבות, אשר יכול לכלול את הקוטר הממוצע של 680 מיקרומטר וזמינות מוגבלת של חומרים מזינים בירידה תלויה 20 μL5. כדי להתגבר על כך, המודל שהומצא בפרוטוקול הנוכחי עובר שלב קריטי שבו הטיפה התלויה מועברת לבארות מצופות אגרוז לאחר היווצרות ראשונית של הספרואיד. זה מבטיח נפח גדול יותר של מדיום תרבות קיים כדי לקיים את המספר ההולך וגדל של תאים בתוך spheroids. כתוצאה מכך, המודל הכדורי HepG2 נשאר מעל 70% קיימא לאחר 10 ימים בתרבות והוא יכול להיות מנוצל להערכת סכנה לטווח ארוך במבחנה. 
בעוד המודל הכדורי HepG2 יכול לתמוך הן משטרי חשיפה חריפה וארוכת טווח, מרענן את תרבות התא בינוני במהלך תקופות תרבות מורחבת מוגבל עבור מודל זה כמו החלפה מלאה של המדיום לא מומלץ בשל אובדן פוטנציאלי של spheroids. יש להניח כי עם חשיפות ENM, הנטייה לפיזור ENM הומוגנית כדי agglomerate ומשקעים הוא גבוה. עם זאת, ראוי לציין כי הקצב שבו משקעי ENM יכולים להשתנות בהתאם לפרמטרים החלקיקים (למשל, גודל, צורה וצפיפות) וניתן לקבוע באופן תיאורטי באמצעות משקעים במבחנה, דיפוזיה ודוזימטריה (ISDD), או נגזרות האחרונות שלה, המכונה לעתים קרובות כאשר לגבי ENM (השעיה) חשיפה מתקרב27,28. עם זאת הוא המוח, ההנחה היא כי אם רק 50% של מדיום תרבות התא מוסר בזהירות מפני השטח של תרבות התא, ההפרעה והסרה לאחר מכן של מינון ENM צריך בתיאוריה להיות מינימלי. עם זאת, עם תנועה בראונית במשחק, זה לא יכול להיות המקרה בקפדנות ועבודה נוספת לתוך התצהיר ואת משקעים של כל ENM מסוים להיבדק צריך להתבצע כדי להבטיח את הדוזימטריה הנכונה נשמרת לאורך כל משטר החשיפה לטווח ארוך27. בעיקר זוהי מגבלה פוטנציאלית שיש לקחת בחשבון בעת ביצוע משטרי מנון חוזרים ונשנים שכן זה יכול להיות קריטי לריכוז הסופי, המצטבר. חשיפות מבוססות כימית מצד שני, אמנם לא בלי המגבלות שלהם לשקול, מציעים גישה פשטנית יותר בכך חומרים כימיים נוטים להישאר בתמיסה ובכך החלפה ישירה של הריכוז הכימי המקורי בנוסף לריכוז החדש שנוסף מבטיח כי כל כימיקל שאבד במהלך כיבוד התקשורת מוחלף בהתאם29. יישומים עתידיים יכללו הערכת ההתאמה של המודל למשטרי חשיפה חוזרים ונשנים לאורך תקופות תרבות ארוכות טווח, שכן אסטרטגיות מינון חוזרות ונשנות חשובות ביותר להערכת היכולת של מערכת איברים מסוימת לשפר או להתגבר על ההשפעות השליליות, אם בכלל, הנגרמות על ידי ביואקומולציה של חומר קסנוביוטי.
לסיכום, מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת מגוון של תרחישי חשיפה מציאותיים, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הן ENM והערכת סכנה כימית באופן שגרתי ונגיש בקלות.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM) על פני שפע של יישומים מבוססי אדם (למשל, מזון, קוסמטיקה, ביגוד, ציוד ספורט, אלקטרוניקה, תחבורה ורפואה), זה בלתי נמנע כי בני אדם ייחשפו ENM על בסיס קבוע. עם זאת, ישנם חששות מוגברים כי הרומן, גודל ספציפי פיזיותרפיה מאפיינים כימיים המ סבורים חומרים אלה יתרון ביישומים רבים עלול לגרום להשפעות שליליות על בריאות האדם ועל הסביבה בו זמנית. כיום פעילויות בינלאומיות רבות נמצאות במקום כדי לשקף באופן פעיל חשיפות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית ENM אלה ולהעריך את הרעילות הפוטנציאלית של חומרים אלה על פני תרחישי חשיפה חריפים, ארוכי טווח, חוזרים ונשנים במינון נמוך.
טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כפי שהוא ידוע כי הכבד הוא אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה1,2. יתר על כן, הכבד הוא מערכת האיברים העיקרית לחילוף חומרים וניקוי רעלים של חומרים הנכנסים למחזור המערכתי3. בהתבסס על ההבנה המקובלת כי מודלים 2D hepatocyte אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות או מייצגים כראוי פעילות מטבולית שנצפתה vivo, התמקדות גדולה יותר לפתח חזק רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה 3D מודלים הכבד עבור טכנולוגיות תחליף in vivo הוקמה4,5. שימוש בטכנולוגיות תרבות תלת-ממדיות מתקדמות משפר את תוחלת החיים של דגמי הכבד במבחנה ומאפשר לחקור משטרי חשיפה ארוכי טווח וחוזרים ונשנים. בנוסף, פורמט תרבות מתקדם זה מקדם היווצרות של תכונות פיזיולוגיות משופרת, organotypic כגון canaliculi מרה, תהליכי טרנספורטר פעיל ויכולות חילוף חומרים תרופתיות משופרות CYP450, ובכך לשפר את החיזוי של הדגמים6. מודלים נוכחיים של 3D במבחנה בכבד המורכבים מתרבויות מונו (hepatocytes בלבד) או תרבויות משותפות (hepatocytes עם תאים שאינם פרנצ'יליים) קיימים במספר פורמטים, החל microtissues או spheroids בלוחות הידבקות אולטרה, ספירואידים טיפה תלויים, תאים מוטבע מטריצות ו / או פיגומים פלטפורמות תרבות תאים מיקרופלואידיים, כולם נחשבים יעילים מתקדם במבחנה מודלים להערכת רעילות בכבד6,7. עם זאת, רוב מערכות מודל אלה הן תחזוקה גבוהה, דורשים ציוד מיוחד והם יקרים. יתר על כן, מודלים אלה הם לעתים קרובות סטטיים (כלומר, מודלים תאים שאינם מחולקים) המונע את השימוש בהם להערכת נקודות קצה סיכון, כגון בדיקות genotoxicity ניצול שיטות לכמת נזק DNA קבוע. Genotoxicity הוא תנאי מוקדם ליבה בטוקסיקולוגיה רגולטורית, וזה מרכיב חיוני של הערכת הסיכון של כל רעיל8. אין מבחנים בודדים שניתן ליישם כדי לכמת את כל צורות הנזק לדנ"א שעלולות להתעורר בעקבות חשיפה לסוכן אקסוגני. עם זאת, מרכיב הליבה של הסוללה בדיקות genotoxicity במבחנה הוא הבדיקה micronucleus, שהיא טכניקה אמינה ורבת פנים המודדת נזק כרומוזומלי ברוטו9. זוהי טכניקה סטנדרטית זהב המתוארת על ידי ה-OECD מבחן קו מנחה 487, להערכת נזק DNA במבחנה genotoxicity והוא חלק הדרישה סוללת הבדיקה להערכת סיכון רגולטורי10,11.
קו התא קרצינומה hepatocellular האנושי, HepG2, נמצא בשימוש נרחב עבור הקרנת הערכת סכנה ראשונית כמו התאים זמינים, זול יחסית למקור, פשוט לתרבות נוח להקרנת תפוקה גבוהה12,13. כאשר מתורבתים לתוך מבנים כדוריים 3D, הם הוכחו recapitulate את הכבד microenvironment היטב ולהציע מודל כבד עם יכולות שגשוג מספיק כדי לתמוך micronucleus assay3. פיתוח נוסף של מודלים כדוריים HepG2 הוקמה כדי לשפר את תוחלת החיים ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל על מנת לתמוך הערכת סכנת genotoxicity על פני משטרי חשיפה ארוכי טווח, חוזרים ונשנים (≤14 ימים). לכן, בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, הפרוטוקול הנוכחי הוקם כדי לספק מודל מתקדם 3D במבחנה הכבד מסוגל להעריך באופן אמין נקודות קצה טוקסיקולוגיות מרובות (למשל, פונקציונליות הכבד, (פרו)סמנים דלקתיים, cytotoxicity ו genotoxicity) בעקבות חשיפות כימיות ו- ENM חריפה, ארוכת טווח וחוזרת על עצמה בשגרה
כאן, אנו מציגים שיטה להקים קו תאים 3D hepatocyte רלוונטי מבחינה פיזיולוגית מבוסס במערכת מודל במבחנה להערכת סכנת genotoxicity בעקבות חשיפות ENM חריפה או ארוכת טווח, חוזרות ונשנות. ניתן לחלק את הפרוטוקול ל-6 שלבים מרכזיים: תאי HepG2 קריאופרדים; הכנת ספרואיד HepG2; העברת ספרואיד HepG2 מירידה תלויה להשעיה agarose; קציר כדורי HepG2; micronucleus מבחנים וניקוד; וניתוח נתונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

בשל ההתפתחות המהירה והיישום של מגוון רחב של ננו-חומרים מהונדסים (ENM), חשיפה ל- ENM היא בלתי נמנעת ופיתוח מערכות בדיקה במבחנה חזקות וחיזוי הוא חיוני. טוקסיקולוגיה בכבד היא המפתח כאשר בוחנים חשיפה ENM, כמו הכבד משמש תפקיד חיוני הומאוסטזיס מטבולית דטוקסיפיקציה, כמו גם להיות אתר מרכזי של הצטברות ENM לאחר חשיפה. בהתבסס על זה ועל ההבנה המקובלת כי מודלים hepatocyte 2D אינם מחקים במדויק את המורכבות של אינטראקציות רב תאיות מורכבות ופעילות מטבולית שנצפו vivo, יש דגש גדול יותר על התפתחות של מודלים כבד 3D רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית המותאמים למטרות הערכת סיכון ENM במבחנה. בהתאם לעקרונות של 3Rs להחליף, להפחית ולמקד ניסויים בבעלי חיים, מודל כבד מבוסס קו התא 3D HepG2 פותחה, שהיא ידידותית למשתמש, מערכת חסכונית שיכולה לתמוך הן משטרי חשיפה ENM מורחבים וחוזרים על עצמם (≤14 ימים). מודלים ספירואידיים אלה (קוטר ≥500 מיקרומטר) שומרים על יכולתם המשגשגת (כלומר, חלוקת מודלים של תאים) המאפשרת להם להיות משולבים עם בדיקת מיקרונוקלאוס 'תקן זהב' כדי להעריך ביעילות את הגנוטוקסיות במבחנה. היכולת שלהם לדווח על מגוון של נקודות קצה טוקסיקולוגיות (למשל, תפקודי כבד, (פרו)תגובה דלקתית, cytotoxicity ו genotoxicity) התאפיינה באמצעות מספר ENMs על פני שני אקוטי (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 h) משטרי חשיפה. מודל זה 3D במבחנה הכבד יש את היכולת להיות מנוצל להערכת חשיפות ENM מציאותי יותר, ובכך לספק גישה במבחנה בעתיד כדי לתמוך טוב יותר הערכת סכנה ENM באופן שגרתי ונגיש בקלות.

ההתאמה של מודל ספירואיד כבד תלת-ממדי מבוסס קו תאים זה לתרבות ארוכת טווח והערכת סכנה גנוטוקסית הוערכה על ידי ביצוע אפיון בסיסי כדי לקבוע את הכדאיות ואת הפונקציונליות דמוית הכבד של המודל לאורך משך 14 ימים בתרבות, כמו גם את הישימות שלה עבור מבחני מיקרונוקלוס.
אפיון בסיסי של דגם כדורי כבד HepG2 תלת-ממדי לפני כל הערכה טוקסיקולוגית במבחנה, חשוב לבדוק כי כדורי HepG2 3D נוצרו כראוי לפני ביצוע העברת agarose או טיפול כימי / ENM. כדורי HepG2 המיוצרים בשיטת הירידה התלויה לוקחים בדרך כלל 2 - 3 ימים לאחר זריעה (4000 תאים / ספרואיד) כדי ליצור ספירואידים קומפקטיים בצורת כדורית בקוטר ממוצע של 495.52 מיקרומטר W x 482.69 מיקרומטר H כפי שמוצג באיור 5A-5C. כדורי HepG2 שנוצרו כראוי והם מקובלים לשמש להערכה טוקסיקולוגית במבחנה חייב להיות מבנה קומפקטי, כדורי בצורת עם משטח חלק ללא הקרנות חזותיות. איור 5 מספק דוגמאות לאיכות טובה (איור 5D-F)וספרואידים באיכות ירודה (איור 5G-I). האחרון שבהם צריך להיות מושלך. בדרך כלל, 90-95% של spheroids נוצר לכל צלחת תיווצר כראוי להיות קיימא לניסויים נוספים.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> איור 5: תמונות מיקרוסקופיות קלות המציגות את המורפולוגיה הטבעית של הספרואידים HepG2 שנוצרו באמצעות שיטת הטיפה התלויה. (A-C) להראות יום 2 ו (D-I) יום 4 HepG2 כבד spheroids פוסט זריעה. (D-F)הם דוגמאות של ספירואידים HepG2 באיכות טובה בעוד (G-I) מראה ספרואידים בצורה גרועה. כל התמונות צולמו במטרה X20 באמצעות מיקרוסקופ. סרגל קנה המידה מייצג 20 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">מיקרומטר.</a>
כדי לאשר עוד יותר את הכדאיות הכדורית HepG2, אלבומין ירוק ברומוקרסול צבעוני בסיסי (BCG) Assay או Urea Assay יכול להתבצע כדי להעריך את הפונקציונליות דמוית הכבד שלהם. פונקציונליות דמוית כבד הוערכה בהתאם לכדאיות באמצעות מבחני ההדרה הכחולים של Trypan במשך 14 יום כדי לקבוע את תוחלת החיים של מודל הכדוריד בכבד ולקבוע אם הוא יכול לתמוך בהערכת סיכונים מבוססת ENM/כימית לטווח ארוך או חוזרת ונשנית (איור 6). ריכוז האלבומין נותר עקבי לאורך תקופת התרבות. ייצור אוריאה מציג עלייה בריכוז של אוריאה המיוצר ספרואיד במשך שבוע בתרבות לפני שהגיע לרמה ביום 7. חשוב לציין כי רמות אלבומין ואאוריאה המיוצרים בספרואידים 3D HepG2 גבוהות משמעותית מזו שנצפו באותו קו תאים בתרבית בפורמט דו-ממדי. ואכן, תרבויות דו-מימדיות של תאי HepG2, שיא אלבומין ורמות אוריאה היו 0.001 מ"ג/מ"ל ו-0.010 ננוגרם/μL בהתאמה. יתר על כן, בעבודה קודמת שפורסמה על ידי שאה ואח 'באמצעות מערכת כדורית HepG2 כמעט זהה, המחברים מדגישים שיפור ניכר בפעילות מטבולית (CYP1A1 ו CYP1A2) במערכות מודל 3D HepG2 במבחנה בהשוואה לתאי HepG2 בתרבית דו-ממדית5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> איור 6: נתוני אפיון בסיסי ל-14 יום עבור ספירואידי כבד HepG2. לאחר ההעברה מירידהתלויה,( A ) מדגיש את הכדאיות של דגם הכדורואיד HepG2 על פני תקופה של 14 יום בעוד (B) ו -( C) להדגיש את פונקציונליות אלבומין דמוי כבד אוריאה בהתאמה. נתונים ממוצעים ± SEM שהוצגו, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
עם ההתפתחות הבלתי נמנעת של ליבה נמקית, מגבלה ידועה של תרביות ספירואיד כבד 3D, הכדאיות של מודל זה מבוסס HepG2 היה צריך להיות הוקמה כדי להדגים שהוא היה מסוגל לקיים לטווח ארוך (5-10 יום) משטרי חשיפה תוך שמירה על יכולת התפשטות הנדרשת כדי לתמוך micronucleus assay5. ואכן, מודל זה כדורי כבד 3D הוכח לשמור על >70% הכדאיות על פני 10 ימים בתרבות. בהתבסס על זה בשילוב עם פונקציונליות דמוית כבד מתמשכת שנצפתה במהלך תקופת התרבות ≥14 יום, מודל זה של כבד 3D spheroids יכול ובכך לתמוך לטווח ארוך, משטרי חשיפה חוזרת ונשנית ENM עד 10 ימים (כלומר, לפני הכדאיות של spheroids לרדת מתחת 70%). לעיון, מומלץ כי רמות אלבומין עבור כדורי HepG2 זרעים ב 4000 תאים / ספרואיד צריך להיות ≥20.0 ng/μL בעוד ייצור אוריאה צריך להיות ≥0.25 ng/μL לפני ביצוע הערכה טוקסיקולוגית במבחנה עם מודל זה.
הערכת גנוטוקסיות של ננו-חומרים מהונדסים להערכת genotoxicity, assay micronucleus שימש כדי לקבוע את נוכחותו של micronuclei בעקבות חשיפות אקוטיות (24 שעות) ו לטווח ארוך (120 שעות) ENM. Aflatoxin B1 הוא מסרטן כבד ידוע16,17 והוא שליטה חיובית מומלצת עבור בדיקת micronucleus. ניסויי אופטימיזציה הראו כי 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 גורם חיובי משמעותית (עלייה ≥2.0 קיפול) תגובה genotoxic ב 3D HepG2 כבד spheroids ולכן משמש בכל micronucleus assay שנערך עם מודל זה. כדי להבטיח את תוקפם של תוצאות בדיקת המיקרו-נוקלוס באמצעות דגם הכדורית HepG2, תדר המיקרו-נוקלוס ברקע לתאי HepG2 המשמשים במודל זה של 3D במבחנה צריך להיות בטווח של 0.6% – 1.2%. כתוצאה מכך, Alfatoxin B1 צריך לגרום לתגובה genotoxic של לפחות פי שניים גבוה יותר מזה שנראה עם שליטה שלילית; לכן, 0.1 מיקרומטר של אלפאטוקסין B1 צריך לגרום לתדר micronuclei בין 1.5% – 3.0%. באמצעות פרמטרי בקרה אלה, ניתן להעריך באופן מהימן את genotoxicity המשויך ל- ENM במבחנה. בהתבסס על הנחיות הבדיקה של ה-OECD 487, חשוב לציין כי בעת בדיקת ENM או כימיקל, הריכוזים שנבחרו לא צריכים לגרום ליותר מ -55% ± 5% ציטוקסיות (המצוין על ידי ירידה בערכי CPBI או RVCC ביחס לשליטה השלילית)11. איור 7 ממחיש את הנתונים שנוצרו כאשר Aflatoxin B1 ושני ENMs (טיטניום דו-חמצני (TiO2)ורסיס (Ag)) הוערכו בעקבות חשיפות חריפות וארוכות טווח בספרואידים של HepG2, והפוטנציאל הגנוטוקסי הבא נותח באמצעות מבחני המיקרו-נוקלוס. שני ENMs העריכו נבדקו במינון לא ציטוקסי, נמוך של 5.00 מיקרוגרם / מ"ל על חשיפה חריפה (24 שעות) ומשטר חשיפה לטווח ארוך (120 שעות). מגמה דומה עבור genotoxicity על פני שני TiO2 ו Ag ENMs ניתן לראות, לפיה תגובת genotoxicity מוגבהת שהביאה לאחר חשיפה 24 שעות לא היה ניכר לאחר חשיפה לטווח ארוך 5 ימים. זאת למרות גנוטוקסיות מתמשכת הנגרמת על ידי השליטה החיובית Aflatoxin B1 בשתי נקודות הזמן.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> איור 7: הערכת Genotoxicity בעקבות חשיפה TiO2 ו Ag ENM על כדורי כבד HepG2. הערכת Genotoxicity (תדר מיקרונוקלוס) באמצעות הפוסט micronucleus assay (A) חריפה (24 שעות) ו -( B) לטווח ארוך (120 שעות) חשיפה ל 5.00 מיקרוגרם / מ"ל של TiO2 ו Ag ENM. שליטה שלילית היא מדיה בלבד, בעוד השליטה החיובית היא 0.1 מיקרומטר של Aflatoxin B1. נתונים ממוצעים (n = 2) שהוצגו ± SD. Significance מצוין ביחס לבקרה השלילית: * = p≤ 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

הליך זה הוקם כדי לשמש לפיתוח תרבויות חזה 3D מתקדמות במבחנה, אשר יכול לספק הערכה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית של הסיכונים genotoxic הקשורים חשיפות ננו חומריים על פני משטרי מינון חריפה או ארוכת טווח, חוזרים ונשנים.

דגמי כבד תלת-ממדיים מתקדמים לבדיקות גנוטוקסיות במבחנה בעקבות חשיפה ננו-חומרית לטווח ארוך

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

בדגם תרבית תאים במבחנה לרעילה בשאיפת בדיקות כימיות

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

הערכת השפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של דוגמניות תרבות רקמות Organotypic 3D הסימפונות ובאף לעשן סיגריות שלמות

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

צ&#39;יפ Multi-האיבר - פלטפורמת Microfluidic לCoculture Multi-רקמה לטווח ארוך

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

גירוי מבחן העין (EIT) לסיכוני זיהוי כימיקלים עיניים מעצבנים באמצעות אפיתל דגם רקמות כמו-קרנית משוחזר אדם (RHCE)

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

עור 2D and 3D שיפור<em&gt; במבחנה</em&gt; מודלים שימוש להצטופפות מולקולארית

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

אנגיוגנזה להמחיש באמצעות מיקרוסקופ Multiphoton Vivo ב מהונדסים גנטית לגרדום 3D-PLGA/nHAp Calvarial תיקון פגם קריטי של העצם

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

שיפור תרבויות הידרוג 3D של תאי גליה העיקרי עבור במבחנה דוגמנות של Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

מתקדמים במבחנה Culturing טכנולוגיה ללמוד את Microbiota בטן האדם

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

אין ויטרו מודלים עורקיים בתרבית תאים 3D לחקר פילוח תרופות כלי דם תחת זרימה

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...