Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne erkjenne at denne forskningen har fått støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 for PATROLS-prosjektet, under tilskuddsavtale nr.

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Bruksområder for 3D-levermodeller varierer betydelig avhengig av det spesifikke biokjemiske endepunktet eller ugunstige utfallsveier som målrettes. Hver modell har sine fordeler og begrensninger, fra interdonorvariasjon i primære menneskelige hepatocyttmodeller (PHH) til redusert cytokrom p450-aktivitet i cellelinjebaserte modeller, men alle er verdifulle i seg selv6,12,18,19. Ved vurdering av gentoksisitet er det begrensninger i modellenes kompatibilitet med regulatoriske godkjente endepunkter som in vitro mikronukleusanalysen, da aktiv spredning er nødvendig. Dette er nødvendig, da gentoksisitetsvurdering krever kvantifisering av fast DNA-skade som skal vurderes etter celledeling når det er mulighet for DNA-reparasjon for å korrigere forbigående lesjoner. Dessverre er svært differensiert hepatocytt (dvs. HepaRG) baserte sfæroider eller PHH-mikrotissues, som anses å vise de mest fysiologisk relevante leverlignende egenskapene, statiske (ikke-proliferative) modeller12,19,20. Som et resultat gir 3D HepG2 sfæroidmodellen som presenteres her en passende, alternativ modell som er i stand til å støtte gentoksisitetstesting. HepG2 cellelinjebaserte sfæroider har tilstrekkelig aktivt dele celler på den ytre overflaten av sfæroidene samtidig som grunnleggende leverlignende egenskaper, for eksempel albumin og urea produksjon og noen CYP450 aktivitet5,12,19. Hovedsakelig er denne in vitro levermodellen utviklet for å utfylle mikronukleusanalysen, da dette er en av de to in vitro-analysene som anbefales i batteriet for gentoksisitetstesting8,10,11,21. Modellen kan imidlertid lett anvendes på DNA-sekvenseringsanalyse og genuttrykksteknologier (RNA), mens den har potensial til å bli ytterligere tilpasset og utnyttet for andre DNA-skadeendepunkter, for eksempel kometanalysen. Likevel er det viktig å vurdere hvilken rolle ENM-interferens spiller i enkelte endepunktanalyser. For eksempel kan strømningscytometribaserte analyser ikke være egnet for ENM gentoksisitetsvurdering spesielt på grunn av partikkelinterferens22.
En begrensende faktor for sfæroidmodeller som aktivt gjennomgår celledeling er deres størrelse. Optimalisering av såingstetthet er kritisk, da det må være nok celler som gjør at modellen kan fortsette å spre seg; men ikke for høyt et cellenummer, noe som resulterer i at sfæroiden blir altfor kompakt, noe som fører til en økt nekrotisk kjerne. Årsaken til denne nekrose antas å være begrenset oksygen og næringsdiffusjon, da grensen for denne diffusjonen antas å være ca. 100 - 150 μm vev23,24. Dette avhenger imidlertid av celletype, cellenummer, stillasinteraksjoner og kulturforhold25. Siden det har vist seg at ca 700 μm diameter er grensen for å unngå for tidlig utbrudd av nekrose i midten av C3A sfæroider, såing 4000 HepG2 celler per sfæroid sikrer diameteren på modellen på tidspunktet for eksponering er ≤ 500 μm26. Videre etablerte Shah et al. at HepG2-celler frøet over 5000 celler per sfæroid viste en 25% reduksjon i levedyktighet etter 7 dager i kultur, noe som kan gjelde gjennomsnittlig diameter på 680 μm og begrenset tilgjengelighet av næringsstoffer i en 20 μL hengende dråpe5. For å overvinne dette gjennomgår modellen som er utviklet i den nåværende protokollen et kritisk skritt der hengende dråpe overføres til agarosebelagte brønner etter innledende dannelse av sfæroidet. Dette sikrer at et større volum av kulturmedium er til stede for å opprettholde det stadig økende antall celler i sfæroidene. Som et resultat forblir HepG2 sfæroidmodellen over 70% levedyktig etter 10 dager i kultur og kan brukes til langsiktig farevurdering in vitro. 
Mens HepG2 sfæroid-modellen kan støtte både akutte og langsiktige eksponeringsregimer, er forfriskende cellekulturmedium i lengre kulturperioder begrenset for denne modellen, da fullstendig utskifting av mediet ikke anbefales på grunn av det potensielle tapet av sfæroidene. Det antas at med ENM-eksponeringer er tendensen til homogene ENM-dispersjoner til agglomerat og sediment høy. Det er imidlertid bemerkelsesverdig at hastigheten som et ENM-sedimenter kan variere avhengig av partikkelparametrene (f.eks. størrelse, form og tetthet) og kan bestemmes teoretisk ved hjelp av in vitro sedimentering, diffusjon og dosimetri (ISDD) modell, eller dens nylige derivater, ofte referert til når det gjelder ENM (suspensjon) eksponering nærmer seg27,28. Med dette er det antatt at hvis bare 50% av cellekulturmediet forsiktig fjernes fra overflaten av cellekulturen, bør forstyrrelsen og etterfølgende fjerning av ENM-dosen i teorien være minimal. Men med Brownian bevegelse i spill, kan dette ikke strengt tatt være tilfelle, og videre arbeid i avsetning og sedimentering av hver enkelt ENM som skal testes bør gjennomføres for å sikre at riktig dosimetri beholdes gjennom de langsiktige eksponeringsregimene27. I hovedsak er dette en potensiell begrensning å vurdere når man utfører gjentatte doseringsregimer, da dette kan være avgjørende for den endelige, akkumulerte konsentrasjonen. Kjemisk basert eksponering derimot, mens de ikke uten egne begrensninger å vurdere, tilbyr en mer forenklet tilnærming ved at kjemiske stoffer har en tendens til å forbli i løsning og dermed en direkte erstatning av den opprinnelige kjemiske konsentrasjonen i tillegg til den nylig tilsatte konsentrasjonen sikrer at kjemikalier som går tapt under medieforfriskninger, erstattes tilsvarende29. Fremtidige anvendelser vil omfatte evaluering av modellens egnethet for gjentatte eksponeringsregimer over langsiktige kulturperioder, da gjentatte doseringsstrategier er avgjørende for å vurdere evnen til et bestemt organsystem til å forbedre eller overvinne bivirkningene, hvis noen, indusert av bioakkumulering av et xenobiotisk stoff.
Avslutningsvis har denne 3D in vitro-levermodellen kapasitet til å bli brukt til å evaluere en rekke realistiske eksponeringsscenarier, og dermed gi en fremtidig in vitro-tilnærming for bedre å støtte både ENM og kjemisk farevurdering på en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

På grunn av den raske utviklingen og implementeringen av et mangfoldig utvalg av konstruerte nanomaterialer (ENM) på tvers av en mengde menneskebaserte applikasjoner (f.eks. mat, kosmetikk, klær, sportsutstyr, elektronikk, transport og medisin), er det uunngåelig at mennesker vil bli utsatt for ENM med jevne mellomrom. Med dette er det økte bekymringer for at de nye, størrelsesspesifikke fysiokjemiske egenskapene som anser disse materialene fordelaktige i mange applikasjoner, kan forårsake negative effekter på menneskers helse og miljøet samtidig. For tiden er mange internasjonale aktiviteter på plass for aktivt å reflektere mer fysiologisk relevante eksponeringer for disse ENM og vurdere den potensielle toksisiteten til disse materialene over akutte, langsiktige og gjentatte lavdoseeksponeringsscenarier.
Levertoksikologi er nøkkelen når man vurderer ENM-eksponering, da det er allment kjent at leveren er et viktig sted for ENM-akkumulering etter eksponering1,2. Videre er leveren det primære organsystemet for metabolisme og avgiftning av stoffer som går inn i systemisksirkulasjon 3. Basert på den aksepterte forståelsen av at 2D-hepatocyttmodeller ikke nøyaktig etterligner kompleksiteten i intrikate multicellulære interaksjoner eller på riktig måte representerer metabolsk aktivitet observert in vivo, er det etablert et større fokus på å utvikle robuste og fysiologisk relevante in vitro 3D levermodeller for in vivo-erstatningsteknologier er etablert4,5. Bruk av avanserte 3D-kulturteknologier forbedrer levetiden til in vitro levermodeller, noe som gjør det mulig å undersøke gjentatte eksponeringsregimer på lang sikt. I tillegg fremmer dette avanserte kulturformatet dannelsen av forbedrede fysiologiske, organotypiske egenskaper som galle canaliculi, aktive transportørprosesser og forbedrede CYP450-stoffmetaboliseringsevner, og dermed forbedre forutsigbarheten til modellene6. Nåværende 3D in vitro levermodeller bestående av monokulturer (kun hepatocytter) eller medkulturer (hepatocytter med ikke-parenchymale celler) finnes i flere formater, alt fra mikrotissues eller sfæroider i ultralow adhesjon plater, hengende dråpe sfæroider, celler innebygd i matriser og / eller stillaser og mikrofluidiske cellekulturplattformer, som alle anses effektive avanserte in vitro modeller for hepatisk toksisitet vurdering6,7. Imidlertid er de fleste av disse modellsystemene høyt vedlikehold, krever spesialisert utstyr og er dyre. Videre er disse modellene ofte statiske (dvs. ikke-viderende cellemodeller) som forhindrer bruk i vurderingen av fareendepunkter, for eksempel gentoksisitetstesting ved hjelp av metoder som kvantifiserer fast DNA-skade. Gentoksisitet er en sentral forutsetning i regulatorisk toksikologi, og det er en viktig komponent i risikovurderingen av ethvert toksiskmiddel 8. Det er ingen enkelt analyse som kan brukes til å kvantifisere alle former for DNA-skade som kan oppstå etter eksponering for et eksogent middel. Imidlertid er en kjernekomponent i in vitro genotoxicity testing batteriet mikronukleusanalysen, som er en pålitelig og mangesidig teknikk som måler grov kromosomskade9. Det er en gullstandardteknikk beskrevet av OECDs testretningslinje 487, for å vurdere in vitro DNA-skade og gentoksisitet og er en del av testbatterikravet for regulatorisk farevurdering10,11.
Den humane hepatocellulære karsinomcellelinjen, HepG2, brukes mye til innledende farevurderingsscreening, da cellene er lett tilgjengelige, relativt billige å kilde, enkle å kultur og egnet til høy gjennomstrømningsscreening12,13. Når de dyrkes i 3D sfæriske strukturer, har de vist seg å rekapitulere levermikromiljøet godt og tilby en levermodell med tilstrekkelig proliferative evner til å støtte mikronukleusanalysen3. Videreutvikling av HepG2 sfæroidmodeller ble etablert for å forbedre modellens levetid og leverlignende funksjonalitet for å støtte gentoksisitetsfarevurdering over langsiktige, gjentatte eksponeringsregimer (≤ 14 dager). I tråd med prinsippene til 3R-ene for å erstatte, redusere og foredle dyreeksperimentering, er den nåværende protokollen etablert for å gi en avansert 3D in vitro levermodell som er i stand til pålitelig evaluering av flere toksikologiske endepunkter (f.eks. leverfunksjonalitet, (pro-)inflammatoriske markører, cytotoksisitet og gentoksisitet) etter akutte, langsiktige og gjentatte kjemiske og ENM-eksponeringer i en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.
Her presenterer vi en metode for å etablere en fysiologisk relevant 3D-hepatocyttcellelinje basert på in vitro-modellsystem for gentoksisitetsfarevurdering etter akutte eller langsiktige, gjentatte ENM-eksponeringer. Protokollen kan deles inn i 6 viktige stadier: kultiverende kryopreserverte HepG2-celler; HepG2 sfæroid forberedelse; HepG2 sfæroid overføring fra hengende dråpe til agarose suspensjon; HepG2 sfæroid høst; micronucleus analyse og scoring; og dataanalyse.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

På grunn av den raske utviklingen og implementeringen av et mangfoldig utvalg av konstruerte nanomaterialer (ENM), er eksponering for ENM uunngåelig, og utviklingen av robuste, prediktive in vitro-testsystemer er avgjørende. Levertoksikologi er nøkkelen når man vurderer ENM-eksponering, da leveren tjener en viktig rolle i metabolsk homeostase og avgiftning, samt å være et viktig sted for ENM-akkumulering etter eksponering. Basert på dette og den aksepterte forståelsen av at 2D-hepatocyttmodeller ikke nøyaktig etterligner kompleksiteten i intrikate multi-cellulære interaksjoner og metabolsk aktivitet observert in vivo, er det større fokus på utvikling av fysiologisk relevante 3D-levermodeller skreddersydd for ENM-farevurderingsformål in vitro. I tråd med prinsippene til 3R-ene for å erstatte, redusere og foredle dyreforsøk, er det utviklet en 3D HepG2 cellelinjebasert levermodell, som er et brukervennlig, kostnadseffektivt system som kan støtte både utvidede og gjentatte ENM-eksponeringsregimer (≤ 14 dager). Disse sfæroidmodellene (≥500 μm i diameter) beholder sin proliferative kapasitet (dvs. delecellemodeller) slik at de kan kobles sammen med "gullstandarden" mikronukleusanalyse for effektivt å vurdere gentoksisitet i vitro. Deres evne til å rapportere om en rekke toksikologiske endepunkter (f.eks. leverfunksjon, (pro-)inflammatorisk respons, cytotoksisitet og gentoksisitet) har blitt karakterisert ved hjelp av flere ENMs på tvers av både akutte (24 timer) og langsiktige (120 h) eksponeringsregimer. Denne 3D in vitro levermodellen har kapasitet til å bli brukt til å evaluere mer realistiske ENM-eksponeringer, og gir dermed en fremtidig in vitro-tilnærming for bedre å støtte ENM-farevurdering på en rutinemessig og lett tilgjengelig måte.

Egnetheten til denne cellelinjebaserte 3D leversfæroidmodellen for langsiktig kultur og gentoksisk farevurdering ble evaluert ved å gjennomføre baseline karakterisering for å bestemme levedyktigheten og leverlignende funksjonaliteten til modellen i løpet av 14 dager i kulturen, samt dens anvendbarhet for mikronukleusanalysen.
Baseline karakterisering av 3D HepG2 Lever sfæroid modell Før en in vitro toksikologiske vurdering er det viktig å kontrollere at 3D HepG2-sfæroidene har dannet seg riktig før du utfører agaroseoverføringen eller kjemisk / ENM-behandling. HepG2 sfæroider produsert ved hjelp av hengende dråpemetode tar vanligvis 2 - 3 dager etter sådd (4000 celler / sfæroid) for å danne kompakte, sfæriske formede sfæroider med en gjennomsnittlig diameter på 495,52 μm B x 482,69 μm H som vist i figur 5A-5C. HepG2 sfæroider som har dannet seg riktig og er akseptable å brukes til in vitro toksikologiske vurdering, må ha en kompakt, sfærisk formet struktur med en jevn overflate og ingen visuelle projeksjoner. Figur 5 gir eksempler på god kvalitet (Figur 5D-F) og dårlig kvalitet ( Figur5G-I) sfæroider. Sistnevnte skal kastes. Vanligvis vil 90-95% av sfæroider dannet per plate dannes riktig og være levedyktige for videre eksperimentering.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figur 5: Lyse mikroskopibilder som viser den naturlige morfologien til HepG2-sfæroidene som dannes via hengende dråpemetode. (A-C) viser dag 2 og (D-I) Dag 4 HepG2 lever sfæroider etter sådd. (D-F) er eksempler på hepG2-sfæroider av god kvalitet, mens (G-I) viser dårlig dannede sfæroider. Alle bilder ble tatt på et X20-mål ved hjelp av et mikroskop. Skalalinjen representerer 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For ytterligere å bekrefte HepG2 sfæroid levedyktighet, kan en grunnleggende kolorimetrisk Bromocresol Green Albumin (BCG) Assay eller Urea Assay utføres for å vurdere deres leverlignende funksjonalitet. Leverlignende funksjonalitet ble vurdert i tråd med levedyktigheten ved hjelp av Trypan Blue Exclusion Assay over en 14-dagers kulturperiode for å bestemme levetiden til leversfæroidmodellen og fastslå om den kunne støtte langsiktig eller gjentatt ENM / kjemisk basert farevurdering (Figur 6). Albuminkonsentrasjonen forble konsistent i løpet av kulturperiodens varighet. Urea-produksjonen viser en økning i konsentrasjonen av urea produsert per sfæroid over en uke i kulturen før den når et platå ved dag 7. Det er viktig å merke seg at nivåene av albumin og urea produsert i 3D HepG2 sfæroider er vesentlig høyere enn det som ble observert i samme cellelinje dyrket i et 2D-format. Faktisk var 2D-kulturer av HepG2-celler, toppalbumin- og ureanivåer henholdsvis 0,001 mg / ml og 0,010 ng / μL. Videre, i tidligere arbeid publisert av Shah et al. ved hjelp av et nesten identisk HepG2 sfæroidsystem, fremhever forfatterne en bemerkelsesverdig forbedring i metabolsk aktivitet (CYP1A1 og CYP1A2) i 3D HepG2 in vitro-modellsystemene sammenlignet med de 2D-dyrkede HepG2-cellene5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figur 6: 14-dagers baseline karakteriseringsdata for HepG2 leversfæroider. Etter overføring fra hengende slipp fremhever (A) levedyktigheten til HepG2 sfæroidmodellen over en 14-dagers periode mens (B) og (C) fremhever henholdsvis leverlignende albumin- og ureafunksjonalitet. Gjennomsnittlige data ± SEM presentert, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Med den uunngåelige utviklingen av en nekrotisk kjerne, en kjent begrensning av 3D leversfæroidkulturer, måtte levedyktigheten til denne HepG2-baserte modellen etableres for å demonstrere at den var i stand til å opprettholde langsiktige (5-10 dagers) eksponeringsregimer samtidig som de opprettholder den proliferative evnen som kreves for å støtte mikronukleusanalysen5. Faktisk har denne 3D lever sfæroid modellen vist seg å beholde > 70% levedyktighet over 10 dager i kulturen. Basert på dette og i forbindelse med den vedvarende leverlignende funksjonaliteten som observeres i løpet av den ≥14-dagers kulturperioden, kan denne 3D-leversfæroidmodellen dermed støtte langsiktige, gjentatte ENM-eksponeringsregimer opptil 10 dager lange (dvs. før levedyktigheten til sfæroidene faller under 70%). For referanse anbefales det at albuminnivåer for HepG2 sfæroider sådd ved 4000 celler / sfæroid skal være ≥20,0 ng / μL mens ureaproduksjon skal være ≥0,25 ng / μL før du foretar en in vitro toksikologisk vurdering med denne modellen.
Gentoksisitetsvurdering av konstruerte nanomaterialer For gentoksisitetsvurdering ble mikronukleusanalysen brukt til å bestemme tilstedeværelsen av mikronuklei etter både akutte (24 timer) og langsiktige (120 t) ENM-eksponeringer. Aflatoxin B1 er et kjent leverkarsinogen16,17 og er en anbefalt positiv kontroll for mikronukleusanalysen. Optimeringsforsøk har vist at 0,1 μM alfatoksin B1 induserer en betydelig positiv (≥2,0 ganger økning) gentoksisk respons i 3D HepG2 leversfæroider og brukes dermed i alle mikronukleusanalyser som utføres med denne modellen. For å sikre gyldigheten av mikronukleusanalyseresultatene ved hjelp av HepG2 sfæroidmodellen, bør bakgrunnsmikronukleusfrekvensen for HepG2-celler som brukes i denne 3D-in vitro-modellen ligge innenfor et område på 0,6% - 1,2%. Som et resultat bør Alfatoxin B1 indusere en gentoksisk respons på minst to ganger høyere enn det som er sett med negativ kontroll; Dermed bør 0,1 μM alfatoksin B1 indusere en mikronukleifrekvens mellom 1,5% – 3,0%. Ved hjelp av disse kontrollparametrene kan ENM-assosiert gentoksisitet in vitro deretter vurderes pålitelig. Basert på OECDs testretningslinje 487 er det viktig å merke seg at når du tester en ENM eller et kjemikalie, bør de valgte konsentrasjonene ikke indusere mer enn 55% ± 5% cytotoksisitet (indikert ved reduksjon i CPBI- eller RVCC-verdier i forhold til den negative kontrollen)11. Figur 7 illustrerer dataene som genereres da Aflatoxin B1 og to ENMer (titandioksid (TiO2) og sliver (Ag)) ble evaluert etter både akutte og langsiktige eksponeringer i HepG2-sfæroidene, og påfølgende gentoksisk potensial ble analysert ved hjelp av mikronukleusanalysen. Begge ENMs vurderte ble testet ved en ikke-cytotoksisk, lav dose på 5,00 μg/ml over en akutt (24 t) eksponering og langsiktig (120 t) eksponeringsregime. En lignende trend for gentoksisitet på tvers av både TiO2 og Ag ENMs kan observeres, hvorved den forhøyede gentoksisitetsresponsen som resulterte etter 24 timers eksponering ikke var tydelig etter en langsiktig 5-dagers eksponering. Dette til tross for vedvarende gentoksisitet indusert av Aflatoxin B1 positiv kontroll på begge tidspunktene.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figur 7: Gentoksisitetsvurdering etter TiO2- og Ag ENM-eksponering på HepG2 leversfæroider. Gentoksisitetsvurdering (mikronukleusfrekvens) ved bruk av mikronukleusanalyseinnlegget (A) akutt (24 timer) og (B) langtidseksponering (120 timer) for 5,00 μg/ml TiO2 og Ag ENM. Negativ kontroll er bare et medium, mens den positive kontrollen er 0,1 μM av Aflatoxin B1. Gjennomsnittsdata (n=2) presentert ± SD. Signifikans angitt i forhold til den negative kontrollen: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Denne prosedyren ble etablert for å brukes til å utvikle avanserte 3D leverkulturer in vitro, som kan gi en mer fysiologisk relevant vurdering av gentoksiske farer forbundet med nanomaterial eksponering over både akutte eller langsiktige, gjentatte doseregimer.

Avanserte 3D levermodeller for in vitro gentoksisitetstesting etter langvarig nanomaterialeeksponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhalert Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensutredning av gjentatt eksponering av organotypiske 3D Bronkitt og Nasal Tissue Kultur Modeller til Whole sigarettrøyk

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgel Chip - En mikrofluid plattform for langsiktig Multi-vev coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Øyeirritasjonstest (EIT) for fareidentifikasjon for Eye irriterende kjemikalier som bruker Rekonstruert Menneskelig Hornhinnen lignende Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Forbedre 2D- og 3D-Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Bruke makromolekylær gruppering

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisere angiogenese av Multiphoton mikroskopi I Vivo i genmodifiserte 3D-PLGA/nHAp stillaset Calvarial kritisk bein defekt reparasjon

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Langsiktig Live bildeenheten forbedret eksperimentelle manipulering av sebrafisk larver

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Forbedret 3D Hydrogel kulturer av primære gliacellene for In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Bruke avansert In Vitro dyrking teknologi for å studere menneskelige tarmen bakterieflora

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D-cellekulturerte arterielle modeller for å studere vaskulær legemiddelmålretting under strømning

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...