Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
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Os autores gostariam de reconhecer que esta pesquisa recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia para o projeto PATROLS, sob o acordo de subvenção nº 760813

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	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. 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C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

As aplicações para modelos hepáticos 3D variam consideravelmente dependendo do ponto final bioquímico específico ou da via de desfecho adverso que está sendo alvo. Cada modelo tem seus benefícios e limitações, desde a variação interdonor nos modelos primários de hepatócito humano (PHH) até a redução da atividade citocromática p450 em modelos baseados em linha celular, mas todos são valiosos por si só6,12,18,19. Ao avaliar a genotoxicidade, há limitações na compatibilidade dos modelos com pontos finais aprovados pela regulamentação, como o ensaio de micronuclear in vitro, pois a proliferação ativa é necessária. Isso é necessário, pois a avaliação da genotoxicidade requer a quantificação de danos fixos de DNA a serem avaliados na divisão pós-celular quando há oportunidade de reparação de DNA para corrigir lesões transitórias. Infelizmente, hepatocitos altamente diferenciados (ou seja, esferoides baseados em HepaRG) ou microtissues PHH, que são considerados como apresentar as características hepáticas mais fisiologicamente relevantes formam modelos estáticos (não proliferativos)12,19,20. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 3D apresentado aqui fornece um modelo adequado e alternativo capaz de suportar testes de genotoxicidade. Os esferoides baseados em linha celular HepG2 têm células divisórias suficientes na superfície externa dos esferoides, mantendo características básicas semelhantes ao fígado, como a produção de albumina e ureia e alguma atividade CYP4505,12,19. Principalmente este modelo hepático in vitro foi desenvolvido para complementar o ensaio micronucleus, pois este é um dos dois ensaios in vitro recomendados na bateria para testes de genotoxicidade8,10,11,21. No entanto, o modelo pode ser facilmente aplicado às tecnologias de análise de sequenciamento de DNA e expressão genética (RNA), enquanto tem o potencial de ser ainda mais adaptado e utilizado para outros pontos finais de dano de DNA, como o ensaio do cometa. No entanto, é importante considerar o papel que a interferência do ENM desempenha em algumas análises de ponto final. Por exemplo, análises baseadas em citometria de fluxo podem não ser adequadas para avaliação de genotoxicidade enm especificamente devido à interferência de partículas22.
Um fator limitante dos modelos esferoides que se submetem ativamente à divisão celular é o seu tamanho. A otimização da densidade de semeadura é fundamental, pois é preciso haver células suficientes que permitam que o modelo continue a proliferar; mas não muito alto um número de células, o que resulta no esferoide se tornando excessivamente compacto, levando a um núcleo necrosado aumentado. Acredita-se que a causa dessa necrose seja a restrição de oxigênio e difusão de nutrientes, já que o limite dessa difusão é de aproximadamente 100 – 150 μm de tecido23,24. No entanto, isso depende do tipo celular, número celular, interações de andaimes e condições de cultura25. Desde então, foi demonstrado que aproximadamente 700 μm de diâmetro é o limite para evitar o início prematuro da necrose no centro de esferoides C3A, semeando 4000 células HepG2 por esferoide garante que o diâmetro do modelo no momento da exposição seja ≤500 μm26. Além disso, Shah et al. estabeleceram que as células HepG2 semeadas acima de 5000 células por esferoide apresentaram uma redução de 25% na viabilidade após 7 dias de cultura, o que poderia pertencer ao diâmetro médio de 680 μm e disponibilidade limitada de nutrientes em uma queda de 20 μL de suspensão5. Para superar isso, o modelo concebido no presente protocolo passa por um passo crítico onde a queda de enforcamento é transferida para poços revestidos de agarose após a formação inicial do esferoide. Isso garante um maior volume de cultura média está presente para sustentar o número crescente de células dentro dos esferoides. Como resultado, o modelo esferoide HepG2 permanece mais de 70% viável após 10 dias de cultura e pode ser utilizado para avaliação de risco de longo prazo in vitro. 
Embora o modelo esferoide HepG2 possa suportar regimes de exposição aguda e de longo prazo, o meio de cultura celular refrescante durante períodos de cultura prolongado é restrito para este modelo, pois a substituição completa do meio não é aconselhada devido à perda potencial dos esferoides. Presume-se que, com as exposições enm, a tendência de dispersões homogêneas de ENM para aglomeração e sedimentos é alta. No entanto, é notável que a taxa em que um sedimento ENM pode variar dependendo dos parâmetros de partículas (por exemplo, tamanho, forma e densidade) e pode ser determinada teoricamente usando o modelo de sedimentação in vitro, difusão e dosimetria (ISDD), ou seus derivados recentes, muitas vezes referidos quando se aproxima da exposição ENM (suspensão) se aproxima27,28. Com isso é mente, supõe-se que se apenas 50% do meio de cultura celular for cuidadosamente removido da superfície da cultura celular, a interrupção e posterior remoção da dose ENM deve, em teoria, ser mínima. No entanto, com a moção browniana em jogo, isso pode não ser estritamente o caso e mais trabalhos na deposição e sedimentação de cada ENM em particular a ser testado devem ser realizados para garantir que a dosimetria correta seja mantida ao longo dos regimes de exposição a longo prazo27. Principalmente, esta é uma limitação potencial a ser considerada ao realizar regimes repetidos de dosagem, pois isso poderia ser fundamental para a concentração final e acumulada. Exposições baseadas em produtos químicos, por outro lado, embora não sem suas próprias limitações a considerar, oferecem uma abordagem mais simplista na forma de que as substâncias químicas tendem a permanecer em solução e, portanto, uma substituição direta da concentração química original, além da concentração recém-adicionada, garante que qualquer produto químico perdido durante o refresco da mídia seja substituído emconformidade com 29. Aplicações futuras incluiriam avaliar a adequação do modelo para regimes de exposição repetida em períodos de cultura de longo prazo, uma vez que estratégias de dosagem repetidas são crucialmente importantes para avaliar a capacidade de um determinado sistema de órgãos de amenizar ou superar os efeitos adversos, se houver, induzidos pela bioaccumulação de substância abiótica.
Em conclusão, este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar uma série de cenários de exposição realista, proporcionando assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar tanto a AVALIAÇÃO DE ENM quanto a avaliação de riscos químicos de forma rotineira e de fácil acesso.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM) em uma infinidade de aplicações de base humana (por exemplo, alimentos, cosméticos, vestuário, equipamentos esportivos, eletrônicos, transporte e medicina), é inevitável que os seres humanos sejam expostos ao ENM regularmente. Com isso, há preocupações crescentes de que o novo, tamanho de características fisio-químicas específicas que considerem esses materiais vantajosos em inúmeras aplicações, possa causar efeitos adversos sobre a saúde humana e o meio ambiente concomitantemente. Atualmente, muitas atividades internacionais estão em vigor para refletir ativamente exposições mais fisiologicamente relevantes a esses ENM e avaliar a toxicidade potencial desses materiais em cenários de exposição aguda, de longo prazo e repetidos de baixa dose.
Toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois é amplamente conhecido que o fígado é um dos principais locais de acumulação de ENM pós exposição1,2. Além disso, o fígado é o sistema de órgãos primários para metabolismo e desintoxicação de substâncias que entram em circulação sistêmica3. Com base no entendimento aceito de que modelos hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades de interações multicelulares intrincadas ou representam adequadamente a atividade metabólica observada in vivo, um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos in vitro 3D robustos e fisiologicamente relevantes para tecnologias substitutas in vivo foi estabelecido4,5. A utilização de tecnologias avançadas de cultura 3D melhora a longevidade de modelos hepáticos in vitro, permitindo que regimes de exposição repetidas e de longo prazo sejam investigados. Além disso, esse formato de cultura avançada promove a formação de características fisiológicas e organotípicas aprimoradas, como bile canaliculi, processos de transporte ativo e capacidades de metabolização de medicamentos CYP450 aprimorados, melhorando assim a previsibilidade dos modelos6. Modelos hepáticos in vitro atuais 3D constituídos por monoculturas (somente hepatócitos) ou co-culturas (hepatócitos com células não equilíquicas) existem em vários formatos, desde microtissues ou esferoides em placas de aderência ultralow, esferoides de gota suspensa, células embutidas em matrizes e/ou andaimes e plataformas de cultura celular microfluida, todos os quais são considerados modelos avançados in vitro eficazes para avaliação de toxicidade hepática6,7. No entanto, a maioria desses sistemas de modelos são de alta manutenção, exigem equipamentos especializados e são caros. Além disso, esses modelos são frequentemente estáticos (ou seja, modelos de células nãondividing) que impedem seu uso na avaliação de pontos finais de perigo, como testes de genotoxicidade utilizando métodos que quantificam danos consertos de DNA. A genotoxicidade é um pré-requisito central na toxicologia regulatória, e é um componente vital da avaliação de risco de qualquer toxicante8. Não há um único ensaio que possa ser aplicado para quantificar todas as formas de dano de DNA que possam surgir após a exposição a um agente exógeno. No entanto, um componente central da bateria de teste de genotoxicidade in vitro é o ensaio de micronucleus, que é uma técnica confiável e multifacetada que mede danos cromossômicos brutos9. É uma técnica padrão-ouro descrita pela Diretriz de Teste da OCDE 487, para avaliação de danos in vitro de DNA e genotoxicidade e faz parte do requisito da bateria de teste para avaliação de risco regulatório10,11.
A linha celular hepatocelular humana, HepG2, é amplamente utilizada para a triagem inicial de avaliação de riscos, pois as células estão prontamente disponíveis, relativamente baratas à fonte, simples à cultura e amenáveis à triagem de alto rendimento12,13. Quando cultivadas em estruturas esféricas 3D, elas têm sido demonstradas para recapitular bem o microambiente hepático e oferecer um modelo hepático com capacidades proliferativas suficientes para suportar o ensaio de micronucleus3. Foi estabelecido mais desenvolvimento dos modelos esferoides HepG2 para melhorar a longevidade e a funcionalidade hepática do modelo, a fim de apoiar a avaliação de risco genotoxicidade em regimes de exposição repetidas a longo prazo (≤14 dias). Assim, em consonância com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, o presente protocolo foi estabelecido para fornecer um modelo hepático in vitro avançado 3D capaz de avaliar de forma confiável múltiplos pontos finais toxicológicos (por exemplo, funcionalidade hepática, (pro-)marcadores inflamatórios, citotoxicidade e genotoxicidade) seguindo exposições químicas agudas, de longo prazo e repetidas e ENM em uma rotina e de forma facilmente acessível.
Aqui, apresentamos um método para estabelecer uma linha de células hepatócitos 3D fisiologicamente relevante baseada em sistema de modelo in vitro para avaliação de risco de genotoxicidade após exposições agudas ou de longo prazo do ENM. O protocolo pode ser dividido em 6 estágios-chave: acultura de células HepG2 criopreservadas; Preparação de sferóide hepG2; Transferência de spheróide hepG2 de queda de suspensão para suspensão de agarose; Colheita de sferóides hepG2; ensaio micronucleus e pontuação; e análise de dados.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

Devido ao rápido desenvolvimento e implementação de uma variedade diversificada de nanomateriais projetados (ENM), a exposição ao ENM é inevitável e o desenvolvimento de sistemas de teste in vitro robustos e preditivos é essencial. A toxicologia hepática é fundamental quando se considera a exposição ao ENM, pois o fígado serve a um papel vital na homeostase metabólica e na desintoxicação, além de ser um dos principais locais de acumulação de ENM após a exposição. Com base nisso e no entendimento aceito de que os modelos de hepatócitos 2D não imitam com precisão as complexidades das interações multicelulares intrincadas e da atividade metabólica observada in vivo, há um maior foco no desenvolvimento de modelos hepáticos 3D fisiologicamente relevantes sob medida para fins de avaliação de riscos ENM in vitro. De acordo com os princípios dos 3Rs para substituir, reduzir e refinar a experimentação animal, foi desenvolvido um modelo hepático baseado em células 3D HepG2, que é um sistema fácil de usar e econômico que pode suportar regimes de exposição enm estendidos e repetidos (≤14 dias). Esses modelos esferoides (≥500 μm de diâmetro) mantêm sua capacidade proliferativa (ou seja, modelos celulares divisórias) permitindo que eles sejam acoplado ao ensaio de micronucleo 'padrão ouro' para avaliar efetivamente a genotoxicidade in vitro. Sua capacidade de relatar uma gama de pontos finais toxicológicos (por exemplo, função hepática, (pro-)resposta inflamatória, citotoxicidade e genotoxicidade) tem sido caracterizada usando vários ENMs em regimes de exposição agudos (24 h) e de longo prazo (120 h). Este modelo hepático in vitro 3D tem a capacidade de ser utilizado para avaliar exposições enm mais realistas, fornecendo assim uma futura abordagem in vitro para melhor suportar a avaliação de riscos ENM de forma rotineira e de fácil acesso.

A adequação deste modelo spheróide hepático 3D baseado em linha celular para cultura de longo prazo e avaliação de risco genotipico foi avaliada pela realização da caracterização da linha de base para determinar a viabilidade e funcionalidade hepática do modelo ao longo da duração de 14 dias na cultura, bem como sua aplicabilidade para o ensaio do micronucleus.
Caracterização da linha de base do modelo spheroid hepg2 hepg2 3D Antes de qualquer avaliação toxicológica in vitro, é importante verificar se os esferoides HepG2 3D formaram-se adequadamente antes de realizar a transferência de agarose ou tratamento químico/ENM. Os spheróides hepG2 produzidos usando o método de queda de suspensão geralmente levam de 2 a 3 dias após a semeadura (4000 células/esferoides) para formar esferoides compactos e esféricos com diâmetro médio de 495,52 μm W x 482,69 μm H, como mostrado na Figura 5A-5C. Os spheróides hepG2 que se formaram corretamente e são aceitáveis para serem usados para avaliação toxicológica in vitro devem ter uma estrutura compacta e esférica com uma superfície lisa e sem projeções visuais. A Figura 5 fornece exemplos de boa qualidade(Figura 5D-F) e um esferoides de má qualidade(Figura 5G-I). Este último deve ser descartado. Normalmente, 90-95% dos esferoides formados por placa se formarão corretamente e serão viáveis para novas experimentações.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figura 5: Imagens de microscopia leve que exibem a morfologia natural dos esferoidesHepG2 formadas através do método de queda de suspensão . (A-C) mostrar dia 2 e(D-I) Dia 4 HepG2 hefóides pós semeadura. (D-F) são exemplos de spheroids HepG2 de boa qualidade, enquanto(G-I) mostra esferoides mal formados. Todas as imagens foram tiradas em um objetivo X20 usando um microscópio. A barra de escala representa 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para confirmar ainda mais a viabilidade esferoide HepG2, um ensaio colorido básico do Bromocresol Green Albumin (BCG) ou Urea Assay pode ser realizado para avaliar sua funcionalidade semelhante ao fígado. A funcionalidade semelhante ao fígado foi avaliada de acordo com a viabilidade usando o Ensaio de Exclusão Azul trypan durante um período de cultura de 14 dias para determinar a longevidade do modelo esferoide hepático e estabelecer se poderia suportar a avaliação de risco baseada em ENM/química a longo prazo(Figura 6). A concentração de albumina permaneceu consistente durante o período cultural. A produção de ureia apresenta um aumento na concentração de ureia produzida por esferoide ao longo de uma semana na cultura antes de atingir um patamar no dia 7. É importante notar que os níveis de albumina e ureia produzidos nos esferoides HepG2 3D são substancialmente maiores do que os observados na mesma linha celular cultivada em formato 2D. De fato, as culturas 2D das células HepG2, os níveis de pico de albumina e ureia foram de 0,001 mg/mL e 0,010 ng/μL, respectivamente. Além disso, em trabalhos anteriores publicados por Shah et al. utilizando um sistema esferoide HepG2 quase idêntico, os autores destacam uma notável melhora na atividade metabólica (CYP1A1 e CYP1A2) nos sistemas de modelos in vitro 3D HepG2 quando comparados com as células HepG2 cultivadas em 2D5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figura 6: Dados de caracterização da linha de base de 14 dias para esferoides hepG2 de fígado. Após a transferência da queda de suspensão, (A) destaca a viabilidade do modelo esferoide HepG2 durante um período de 14 dias, enquanto(B) e (C) destacam a funcionalidade de albumina e ureia semelhante ao fígado, respectivamente. Dados médios ± SEM apresentados, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Com o desenvolvimento inevitável de um núcleo necrosado, uma limitação conhecida das culturas esferoides hepáticos 3D, a viabilidade deste modelo baseado em HepG2 teve que ser estabelecida para demonstrar que era capaz de sustentar regimes de exposição a longo prazo (5-10 dias) mantendo a capacidade proliferativa necessária para suportar o ensaio micronucleus5. De fato, este modelo de spheroid hepático 3D tem sido mostrado para manter >70% de viabilidade ao longo de 10 dias na cultura. Com base nisso e em conjunto com a funcionalidade sustentada do fígado observada ao longo do período de cultura de ≥ 14 dias, este modelo de spheroid hepático 3D pode, assim, suportar regimes de exposição enm a longo prazo e repetidos até 10 dias de duração (ou seja, antes que a viabilidade dos esferoides caia abaixo de 70%). Para referência, é aconselhável que os níveis de albumina para spheróides HepG2 semeados em 4000 células/esferoides devem ser ≥20,0 ng/μL enquanto a produção de ureia deve ser ≥0,25 ng/μL antes de realizar uma avaliação toxicológica in vitro com este modelo.
Avaliação genotoxicidade de nanomateriais projetados Para avaliação da genotoxicidade, o ensaio micronucleus foi utilizado para determinar a presença de micronuclei após exposições enm agudas (24 h) e de longo prazo (120 h). Aflatoxina B1 é um conhecido carcinógeno hepático16,17 e é um controle positivo recomendado para o ensaio de micronucleus. Experimentos de otimização mostraram que 0,1 μM de AlfatoxinA B1 induz uma resposta genotoxica positiva (≥2,0 vezes) em esferoides hepáticos hepg2 3D e, portanto, é usada em todos os ensaios micronucleus realizados com este modelo. Para garantir a validade dos resultados do ensaio de micronuclear usando o modelo spheroid HepG2, a frequência de micronucleus de fundo para células HepG2 utilizadas neste modelo in vitro 3D deve estar dentro de uma faixa de 0,6% a 1,2%. Como resultado, a AlfatoxinA B1 deve induzir uma resposta genotoxica de pelo menos duas vezes maior do que a observada com o controle negativo; assim, 0,1 μM de Alfatoxina B1 deve induzir uma frequência micronuclei entre 1,5% e 3,0%. Usando esses parâmetros de controle, a genotoxicidade associada da ENM in vitro pode então ser avaliada de forma confiável. Com base na Diretriz de Teste da OCDE 487, é importante notar que, ao testar um ENM ou químico, as concentrações selecionadas não devem induzir mais de 55% ± citotoxicidade de 5% (indicada por uma redução dos valores de CPBI ou RVCC em relação ao controle negativo)11. A Figura 7 ilustra os dados gerados quando a AflatoxinA B1 e dois ENMs (dióxido de titânio (TiO2) e lasco (Ag)) foram avaliados após exposições agudas e de longo prazo nos esferoides HepG2, e o potencial genotóxico subsequente foi analisado usando o ensaio micronucleus. Ambos os ENMs avaliados foram testados em um regime noncytotóxico, de baixa dose de 5,00 μg/mL sobre uma exposição aguda (24 h) e regime de exposição a longo prazo (120 h). Uma tendência semelhante para genotoxicidade em ambos os ENMs TiO2 e Ag podem ser observadas, pela qual a resposta elevada de genotoxicidade que resultou após a exposição de 24 horas não ficou evidente após uma exposição de longo prazo de 5 dias. Isso foi apesar da genotoxicidade sustentada induzida pelo controle positivo da Aflatoxin B1 em ambos os pontos de tempo.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figura 7: Avaliação genotoxicidade após a exposiçãotio 2 e ag ENM em spheroids hepG2. Avaliação genotoxicidade (frequência de micronucleus) utilizando o posto de ensaio micronucleus(A) aguda (24 horas) e(B)exposição a longo prazo (120 horas) a 5,00 μg/mL de TiO2 e Ag ENM. O controle negativo é apenas uma mídia, enquanto o controle positivo é de 0,1 μM de Aflatoxin B1. Os dados médios (n=2) apresentaram ± SD. Significância indicada em relação ao controle negativo: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Este procedimento foi estabelecido para ser utilizado para o desenvolvimento de culturas hepáticas 3D avançadas in vitro, que podem fornecer uma avaliação mais fisiologicamente relevante dos perigos genotoxicos associados a exposições nanomateriais em regimes de dose aguda ou a longo prazo.

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