Name: advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure
Uploaded: 2020-06-05T14:00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Författarna vill erkänna att denna forskning har fått finansiering från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 för PATROLS-projektet, enligt bidragsavtal nr 760813.

<ol>
	<li>Geiser, M., Kreyling, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deposition+and+biokinetics+of+inhaled+nanoparticles.">Deposition and biokinetics of inhaled nanoparticles.</a> Particle and Fibre Toxicology. 7, 2 (2010).</li><li>Modrzynska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicological+effects+of+nanoparticle+deposition+in+the+liver.">Toxicological effects of nanoparticle deposition in the liver.</a> Kgs. Lyngby, Denmark: Technical University of Denmark. , (2018).</li><li>Elje, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+comet+assay+applied+to+HepG2+liver+spheroids.">The comet assay applied to HepG2 liver spheroids.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 845, 403033 (2019).</li><li>Breslin, S., O'Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug Discovery Today. 18, 240-249 (2013).</li><li>Shah, U. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+HepG2+cells+liver+spheroid+model+for+genotoxicity+studies.">A three-dimensional in vitro HepG2 cells liver spheroid model for genotoxicity studies.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 825, 51-58 (2018).</li><li>Lauschke, V. M., Hendriks, D. F. G., Bell, C. C., Andersson, T. B., Ingelman-Sundberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+3D+Culture+Systems+for+Studies+of+Human+Liver+Function+and+Assessments+of+the+Hepatotoxicity+of+Drugs+and+Drug+Candidates.">Novel 3D Culture Systems for Studies of Human Liver Function and Assessments of the Hepatotoxicity of Drugs and Drug Candidates.</a> Chemical Research in Toxicology. 29, 1936-1955 (2016).</li><li>van Grunsven, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+in+vitro+models+of+liver+fibrosis.">3D in vitro models of liver fibrosis.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 121, 133-146 (2017).</li><li>Corvi, R., Madia, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+-+can+the+performance+be+enhanced.">In vitro genotoxicity testing - can the performance be enhanced.</a> Food and Chemical Toxicology. 106, 600-608 (2017).</li><li>Doak, S. H., Manshian, B., Jenkins, G. J. S., Singh, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+genotoxicity+testing+strategy+for+nanomaterials+and+the+adaptation+of+current+OECD+guidelines.">In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 745, 104-111 (2012).</li><li>Fenech, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinesis-block+micronucleus+cytome+assay.">Cytokinesis-block micronucleus cytome assay.</a> Nature Protocols. 2, 1084-1104 (2007).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guidelines. Test 489: In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay. , (2016).</li><li>Gerets, H. H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+primary+human+hepatocytes,+HepG2+cells,+and+HepaRG+cells+at+the+mRNA+level+and+CYP+activity+in+response+to+inducers+and+their+predictivity+for+the+detection+of+human+hepatotoxins.">Characterization of primary human hepatocytes, HepG2 cells, and HepaRG cells at the mRNA level and CYP activity in response to inducers and their predictivity for the detection of human hepatotoxins.</a> Cell Biology and Toxicology. 28, 69-87 (2012).</li><li>Sison-Young, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+assessment+of+single-cell+models+aligned+to+standard+measures+of+cell+health+for+prediction+of+acute+hepatotoxicity.">A multicenter assessment of single-cell models aligned to standard measures of cell health for prediction of acute hepatotoxicity.</a> Archives of Toxicology. 91, 1385-1400 (2017).</li><li>European Guidelines 2019. European Agency for Safety and Health at Work Available from: <a target="_blank" href="https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines">https://osha.europa.eu/en/safety-and-health-legislation/european-guidelines</a> (2019)</li><li>Jensen, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+NANOGENOTOX+Dispersion+Protocol+for+NANoREG.">The NANOGENOTOX Dispersion Protocol for NANoREG.</a> European Union Grant Agreement n&#176; 2009. 21, 01 (2014).</li><li>Marchese, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1+and+M1:+Biological+Properties+and+Their+Involvement+in+Cancer+Development.">Aflatoxin B1 and M1: Biological Properties and Their Involvement in Cancer Development.</a> Toxins. 10, 214 (2018).</li><li>Rushing, B. R., Selim, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aflatoxin+B1:+A+review+on+metabolism,+toxicity,+occurrence+in+food,+occupational+exposure,+and+detoxification+methods.">Aflatoxin B1: A review on metabolism, toxicity, occurrence in food, occupational exposure, and detoxification methods.</a> Food and Chemical Toxicology. 124, 81-100 (2019).</li><li>Kermanizadeh, A., Brown, D. M., Moritz, W., Stone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+inter-individual+Kupffer+cell+variability+in+the+governance+of+hepatic+toxicity+in+a+3D+primary+human+liver+microtissue+model.">The importance of inter-individual Kupffer cell variability in the governance of hepatic toxicity in a 3D primary human liver microtissue model.</a> Scientific Reports. 9, 7295 (2019).</li><li>Berger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Liver+Cell+Models+Using+the+Basel+Phenotyping+Cocktail.">Comparison of Liver Cell Models Using the Basel Phenotyping Cocktail.</a> Frontiers in Pharmacology. 7, 443 (2016).</li><li>Ramaiahgari, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+in+vitro+model+of+differentiated+HepG2+cell+spheroids+with+improved+liver-like+properties+for+repeated+dose+high-throughput+toxicity+studies.">A 3D in vitro model of differentiated HepG2 cell spheroids with improved liver-like properties for repeated dose high-throughput toxicity studies.</a> Archives of Toxicology. , (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+affecting+the+in+vitro+micronucleus+assay+for+evaluation+of+nanomaterials.">Factors affecting the in vitro micronucleus assay for evaluation of nanomaterials.</a> Mutagenesis. 32 (1), 151-159 (2016).</li><li>Kirkland, D., Reeve, L., Gatehouse, D., Vanparys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+core+in+vitro+genotoxicity+battery+comprising+the+Ames+test+plus+the+in+vitro+micronucleus+test+is+sufficient+to+detect+rodent+carcinogens+and+in+vivo+genotoxins.">A core in vitro genotoxicity battery comprising the Ames test plus the in vitro micronucleus test is sufficient to detect rodent carcinogens and in vivo genotoxins.</a> Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 721 (1), 27-73 (2011).</li><li>Curcio, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+transfer+and+metabolic+reactions+in+hepatocyte+spheroids+cultured+in+rotating+wall+gas-permeable+membrane+system.">Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system.</a> Biomaterials. 28, 5487-5497 (2007).</li><li>Glicklis, R., Merchuk, J. C., Cohen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+mass+transfer+in+hepatocyte+spheroids+via+cell+viability,+spheroid+size,+and+hepatocellular+functions.">Modeling mass transfer in hepatocyte spheroids via cell viability, spheroid size, and hepatocellular functions.</a> Biotechnology and Bioengineering. 86, 672-680 (2004).</li><li>Asthana, A., Kisaalita, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtissue+size+and+hypoxia+in+HTS+with+3D+cultures.">Microtissue size and hypoxia in HTS with 3D cultures.</a> Drug Discovery Today. 17, 810-817 (2012).</li><li>Gaskell, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+functional+C3A+liver+spheroid+model.">Characterization of a functional C3A liver spheroid model.</a> Toxicology Research. 5, 1053-1065 (2016).</li><li>Cho, E. C., Zhang, Q., Xia, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+sedimentation+and+diffusion+on+cellular+uptake+of+gold+nanoparticles.">The effect of sedimentation and diffusion on cellular uptake of gold nanoparticles.</a> Nature Nanotechnology. 6, 385-391 (2011).</li><li>Hinderliter, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISDD:+A+computational+model+of+particle+sedimentation,+diffusion+and+target+cell+dosimetry+for+in+vitro+toxicity+studies.">ISDD: A computational model of particle sedimentation, diffusion and target cell dosimetry for in vitro toxicity studies.</a> Particle and Fiber Toxicology. 7, 36 (2010).</li><li>Kramer, N. I., di Consiglio, E., Blaauboer, B. J., Testai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biokinetics+in+repeated-dosing+in+vitro+drug+toxicity+studies.">Biokinetics in repeated-dosing in vitro drug toxicity studies.</a> Toxicology in vitro. 30, 217-224 (2015).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Tillämpningar för 3D lever modeller varierar avsevärt beroende på den specifika biokemiska endpoint eller negativa resultatet utbildningsavsnittet som riktas. Varje modell har sina fördelar och begränsningar, från interdonorvariation i primära human hepatocytmodeller (PHH) till minskad cytokrom p450-aktivitet i cellinjebaserade modeller, men alla är värdefulla i sin egenrätt 6,12,18,19. Vid bedömning av genotoxicity finns det begränsningar i modellernas kompatibilitet med regulatoriska godkända effektmått såsom in vitro mikronukleusanalys, eftersom aktiv spridning krävs. Detta är nödvändigt, eftersom genotoxicity bedömning kräver kvantifiering av fasta DNA-skador att bedömas post cell uppdelning när det finns möjlighet för DNA reparation att korrigera övergående skador. Tyvärr bildar mycket differentierade hepatocyter (dvs. HepaRG) baserade sfäroider eller PHH-mikrotissues, som anses uppvisa de mest fysiologiskt relevanta leverliknande egenskaperna statiska (icke-proliferativa) modeller12,19,20. Som ett resultat ger 3D HepG2-sfäroidmodellen som presenteras här en lämplig, alternativ modell som kan stödja genotoxicitytestning. HepG2 cellinjebaserade sfäroider har tillräckligt aktivt dela celler på den yttre ytan av sfäroider samtidigt upprätthålla grundläggande lever-liknande egenskaper, såsom albumin och urea produktion och vissa CYP450 aktivitet5,12,19. Huvudsakligen har denna in vitro levermodell utvecklats för att komplettera mikrokärnans analys, eftersom detta är en av de två in vitro-analyser som rekommenderas i batteriet för genotoxicitytestning8,10,11,21. Modellen kan dock enkelt tillämpas på DNA-sekvenseringsanalys och genuttrycksteknik (RNA), medan den har potential att anpassas ytterligare och användas för andra DNA-skador, såsom kometanalysen. Det är dock viktigt att överväga vilken roll ENM-inblandning spelar i vissa slutpunktsanalyser. Flödescytometribaserade analyser kanske till exempel inte är lämpliga för ENM-genotoxisbedömning specifikt på grund av partikelinterferens22.
En begränsande faktor för sfäroidmodeller som aktivt genomgår celldelning är deras storlek. Optimering av såddtäthet är avgörande eftersom det måste finnas tillräckligt med celler som gör att modellen kan fortsätta att föröka sig; men inte för högt cellnummer, vilket resulterar i att sfäroiden blir alltför kompakt, vilket leder till en ökad nekrotisk kärna. Orsaken till denna nekros tros vara begränsad syre- och näringsspridning, eftersom gränsen för denna diffusion tros vara cirka 100 - 150 μmvävnad 23,24. Detta beror dock på celltyp, cellnummer, ställningsinteraktioner och odlingsförhållanden25. Sedan dess har det visat sig att cirka 700 μm diameter är gränsen för att undvika för tidig ansenlig nekros i mitten av C3A-sfäroider, sådd 4000 HepG2-celler per sfäroid säkerställer att modellens diameter vid exponeringstiden är ≤500 μm26. Dessutom fastställde Shah et al. att HepG2-celler som såddes över 5000 celler per sfäroid uppvisade en 25% minskning av livskraften efter 7 dagar i kultur, vilket kan hänföra sig till den genomsnittliga diametern på 680 μm och begränsad tillgänglighet av näringsämnen i en 20 μL hängandedroppe 5. För att övervinna detta genomgår modellen som utformats i det nuvarande protokollet ett kritiskt steg där den hängande droppen överförs till agarosebelagda brunnar efter inledande bildandet av sfäroiden. Detta säkerställer att en större volym odlingsmedium finns för att upprätthålla det ständigt växande antalet celler inom sfäroiderna. Som ett resultat förblir HepG2-sfäroidmodellen över 70% livskraftig efter 10 dagar i kultur och kan användas för långsiktig farobedömning in vitro. 
Medan HepG2-sfäroidmodellen kan stödja både akuta och långsiktiga exponeringssystem, är uppfriskande cellkulturmedel under längre odlingsperioder begränsat för denna modell eftersom fullständig ersättning av mediet inte rekommenderas på grund av den potentiella förlusten av sfäroiderna. Det antas att tendensen till homogena ENM-dispersioner till agglomerat och sediment är hög vid ENM-exponeringar. Det är dock anmärkningsvärt att den hastighet med vilken ett ENM-sediment kan variera beroende på partikelparametrarna (t.ex. storlek, form och densitet) och kan bestämmas teoretiskt med hjälp av in vitro-sedimenterings-, diffusions- och dosimetrimodellen (ISDD) eller dess senaste derivat, som ofta nämns när det gäller ENM-exponering (suspension)närmar sig 27,28. Med detta är sinnet antas det att om endast 50% av cellkulturmediet försiktigt avlägsnas från cellkulturens yta, bör störningen och efterföljande avlägsnande av ENM-dosen i teorin vara minimal. Med brownsk rörelse i spel är det dock inte fallet och ytterligare arbete med nedfall och sedimentering av varje enskild enm som ska testas bör vidtas för att säkerställa att korrekt dosimetri bibehålls i de långsiktiga exponeringssystemen27. I första hand är detta en potentiell begränsning att överväga när man utför upprepade doseringssystem eftersom detta kan vara avgörande för den slutliga, ackumulerade koncentrationen. Kemikaliebaserade exponeringar å andra sidan erbjuder, även om de inte är utan sina egna begränsningar att beakta, ett mer förenklat tillvägagångssätt genom att kemiska ämnen tenderar att förbli i lösning och därmed en direkt ersättning av den ursprungliga kemiska koncentrationen utöver den nyligen tillagda koncentrationen säkerställer att alla kemikalier som går förlorade under förfriskningar i medierna ersättsi enlighet med detta 29. Framtida tillämpningar skulle omfatta utvärdering av modellens lämplighet för upprepade exponeringssystem under långsiktiga odlingsperioder, eftersom upprepade dosstrategier är av avgörande betydelse för att bedöma ett visst organsystems förmåga att lindra eller övervinna eventuella negativa effekter som orsakas av bioackumulering av ett xenobiotiskt ämne.
Sammanfattningsvis har denna 3D-in vitro-levermodell kapacitet att användas för att utvärdera en rad realistiska exponeringsscenarier och därigenom ge en framtida in vitro-metod för att bättre stödja både ENM och kemisk farobedömning på ett rutinmässigt och lättillgängligt sätt.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.
Figure 6 in the Representative Results section was updated from:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6.jpg" />
to:
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg" />
The fourth paragraph in the Representative Results section was updated from:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;0.06 mg/mL whilst urea production should be &#8805;0.4 ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.
to:
With the inevitable development of a necrotic core, a known limitation of 3D liver spheroid cultures, the viability of this HepG2 based model had to be established to demonstrate it was able to sustain long-term (5-10 day) exposure regimes whilst maintaining the proliferative capability required to support the micronucleus assay5. Indeed, this 3D liver spheroid model has been shown to retain &#62;70% viability over 10 days in culture. Based on this and in conjunction with the sustained liver-like functionality observed over the &#8805;14 day culture period, this 3D liver spheroid model can thus support long-term, repeated ENM exposure regimes up to 10 days long (i.e., before viability of the spheroids drop below 70%). For reference, it is advised that albumin levels for HepG2 spheroids seeded at 4000 cells/spheroid should be &#8805;50.0&#160;ng/&#956;L whilst urea production should be &#8805;0.25&#160;ng/&#181;L before conducting an in vitro toxicological assessment with this model.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61141/advanced-3d-liver-models-for-vitro-genotoxicity-testing-following">Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure</a>. The Representative Results section&#160;was updated.

Erratum: Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

På grund av den snabba utvecklingen och implementeringen av ett brett spektrum av konstruerade nanomaterial (ENM) i en mängd mänskliga tillämpningar (t.ex. livsmedel, kosmetika, kläder, sportutrustning, elektronik, transport och medicin) är det oundvikligt att människor regelbundet kommer att utsättas för ENM. Med detta finns det en ökad oro för att de nya, storleksspecifika fysiokemiska egenskaperna som anser att dessa material är fördelaktiga i många tillämpningar kan orsaka negativa effekter på människors hälsa och miljön samtidigt. För närvarande finns det många internationella aktiviteter för att aktivt återspegla mer fysiologiskt relevanta exponeringar för dessa ENM och bedöma dessa materials potentiella toxicitet över akuta, långsiktiga och upprepade lågdosexponeringsscenarier.
Levertoxikologi är nyckeln när man överväger ENM-exponering, eftersom det är allmänt känt att levern är en viktig plats för ENM-ackumulering efterexponering 1,2. Dessutom är levern det primära organsystemet för metabolism och avgiftning av ämnen som kommer in i systemisk cirkulation3. Baserat på den accepterade förståelsen att 2D hepatocyt modeller inte korrekt efterliknar komplexiteten i invecklade multicellulära interaktioner eller på lämpligt sätt representerar metabolisk aktivitet observeras in vivo, har ett större fokus på att utveckla robusta och fysiologiskt relevanta in vitro 3D levermodeller för in vivo ersättningsteknik fastställts4,5. Genom att använda avancerad 3D-kulturteknik förbättras livslängden för in vitro-levermodeller som möjliggör långsiktiga, upprepade exponeringssystem som ska undersökas. Dessutom främjar detta avancerade kulturformat bildandet av förbättrade fysiologiska, organotypiska egenskaper som gallkanaliculi, aktiva transportprocesser och förbättrad CYP450 läkemedelsmetaboliserande kapacitet, vilket förbättrar förutsägbarheten hos modellerna6. Nuvarande 3D in vitro levermodeller bestående av monokulturer (endast hepatocyter) eller samkulturer (hepatocyter med nonparenchymala celler) finns i flera format, allt från mikrotissues eller sfäroider i ultralåga vidhäftningsplattor, hängande droppe sfäroider, celler inbäddade i matriser och/eller byggnadsställningar och mikrofluidiska cellodlingsplattformar, som alla anses vara effektiva avancerade in vitro-modeller för bedömning avlevertoxicitet 6,7. Majoriteten av dessa modellsystem är dock högt underhåll, kräver specialiserad utrustning och är dyra. Dessutom är dessa modeller ofta statiska (dvs. icke-dela upp cellmodeller) som förhindrar deras användning vid bedömning av faroslutpunkter, såsom genotoxiitetstestning med hjälp av metoder som kvantifierar fasta DNA-skador. Genotoxicity är en grundläggande förutsättning inom regulatorisk toxikologi, och det är en viktig komponent i riskbedömningen av alla toxiskamedel 8. Det finns ingen enda analys som kan tillämpas för att kvantifiera alla former av DNA-skador som kan uppstå efter exponering för ett exogent medel. En kärnkomponent i in vitro-genotoxicitytestbatteriet är dock mikrokärnaanalysen, som är en tillförlitlig och mångfacetterad teknik som mäter bruttokromosomskador9. Det är en guldstandardteknik som beskrivs i OECD:s testriktlinje 487, för bedömning av DNA-skador och genotoxitoxicitet in vitro och ingår i testbatterikravet för regulatorisk farobedömning10,11.
Den mänskliga hepatocellulära carcinom cellinjen, HepG2, används i stor utsträckning för inledande farobedömning screening eftersom cellerna är lättillgängliga, relativt billiga att källa, enkla att odla och mottagliga för hög genomströmning screening12,13. När de odlas i 3D-sfäriska strukturer har de visat sig rekapitulera levermikromiljön väl och erbjuda en levermodell med tillräcklig proliferativ förmåga att stödja mikrokärnans analys3. Vidareutveckling av HepG2-sfäroidmodellerna fastställdes för att förbättra modellens livslängd och leverliknande funktionalitet för att stödja bedömning av genotoxicity-faror över långsiktiga, upprepade exponeringssystem (≤14 dagar). I enlighet med principerna i de 3R som ska ersätta, minska och förfina djurförsök har detta protokoll upprättats för att tillhandahålla en avancerad 3D-in vitro-levermodell som på ett tillförlitligt sätt kan utvärdera flera toxikologiska effektmått (t.ex. leverfunktionalitet, (pro-)inflammatoriska markörer, cytotoxicitet och genotoxicity) efter akuta, långsiktiga och upprepade kemiska och ENM-exponeringar på ett rutinmässigt och lättillgängligt sätt.
Här presenterar vi en metod för att fastställa ett fysiologiskt relevant 3D hepatocyt cellinje baserat in vitro modellsystem för genotoxicity farobedömning efter akut eller långsiktiga, upprepade ENM exponeringar. Protokollet kan delas upp i 6 viktiga steg: odling av kryopreserverade HepG2-celler; HepG2 sfäroid förberedelse; HepG2 sfäroid överföring från hängande droppe till agarose suspension; HepG2 sfäroid skörd; Mikrokärnaanalys och poängsättning. och dataanalys.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1088px;" width="1088">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Aflotoxin B1</td>
			<td style="width:168px;">Sigma Aldrich, UK</td>
			<td style="width:344px;">A6636-5MG</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Agarose</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9539-50G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Autoclave Tape</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">BCG Albumin Assay</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bovine Serum Albumin Powder</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell Freezing Aid</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, UK</td>
			<td>5100-0001 - Mr Frosty</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytochalasin B</td>
			<td>Merck, UK</td>
			<td>250233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cytology Metal Clips</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Cytospin 4 Centrifuge</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">CM00730202</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM, phenol-red free with 4.5g/L D-Glucose, L-Glutamine with Hepes</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>21063-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DPX Mounting Medium</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>D/5330/05</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Ethanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10048291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FBS</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Filter Cards for Shandon Cytospin</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">15995742</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Frosted Glass Slides</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Giemsa&#39;s Stain Improved R66 Solution, Gurr</td>
			<td>VWR Chemicals, UK</td>
			<td>MFCD00081642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Glass Coverslips (24 x 60)</td>
			<td style="width:168px;">Deckglaser, VWR</td>
			<td style="width:344px;">ECN631-1575</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Haemocytometer and Coverslip</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Immersion Oil for Microscope</td>
			<td>Zeiss, UK</td>
			<td>518F, ISO8034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laminar Class II Tissue Culture Hood</td>
			<td>Scanlaf Mars</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Light Microscope</td>
			<td style="width:168px;">Zeiss, UK</td>
			<td style="width:344px;">Axiovert 40C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Methanol</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10284580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Microwave</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-Filtered, Sterile 200&#181;l and 1000&#181;l Pipette tips</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">NuncMicroWell 96-Well Microplates</td>
			<td style="width:168px;">ThermoFisher Scientific, Denmark</td>
			<td style="width:344px;">167008</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P1000 and P200 micropipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">P300 and P50 multi-channel pipettes</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS pH 7.4 1X, MgCl2 and CaCl2 Free</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pen/Strep</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>15140-122, Penicillin/Strepmyocin 100X or 10,000U/ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Phosphatase Buffer Tablets</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>10582-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Pipette Boy</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Simport Scientific CytoSep Funnels for Shandon Cytospin 4 Centrifuges</td>
			<td style="width:168px;">FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">11690581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sonifier SFX 550 240V CE 1/2&#34; - Probe</td>
			<td>Branson, USA</td>
			<td>101-063-971R</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">T-25 and T-75 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">T-25 (690175) and T-75 (660175)</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>T8154-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Urea Assay Kit</td>
			<td>Sigma Aldrich, UK</td>
			<td>MAK006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Virkon Disinfectant</td>
			<td>DuPont, UK</td>
			<td>Rely+On Virkon</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Water Bath (37&#730;C)</td>
			<td>Grant JBNova 18</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">Weighing Balance</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Xylene</td>
			<td>FisherScientific, UK</td>
			<td>10588070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.05% Trypsin-EDTA</td>
			<td>GIBCO, Paisley, UK</td>
			<td>5300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.2mL and 1.0mL Eppendorf Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.45&#181;m Filter Unit</td>
			<td style="width:168px;">Millex HA, MF-Millipore, UK</td>
			<td style="width:344px;">SLHA033SS</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">1.0mL Syringe</td>
			<td style="width:168px;">BD Plastipak, FisherScientific, UK</td>
			<td style="width:344px;">300185</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">20mL LS Scintillation Glass Vials, 22-400 Foil Lined PP Caps</td>
			<td style="width:168px;">DWK Life Sciences GmbH, Germany</td>
			<td style="width:344px;">WHEA986581</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">37&#730;C and 5% CO2 ISO Class 5 Hepa Filter Incubator</td>
			<td>NUAIRE DHD Autoflow</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:409px;">3mL Pasteur Pipette</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Conical Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL or 100mL Glass Bottles</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">50mL Skirted Falcon Tubes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">5mL, 10mL and 25mL Pipettes</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">9.4cm Square, Petri Dish</td>
			<td style="width:168px;">Greiner-Bio-One, UK</td>
			<td style="width:344px;">688161</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced 3d liver models for in vitro genotoxicity testing following long-term nanomaterial exposure

På grund av den snabba utvecklingen och implementeringen av ett brett spektrum av konstruerade nanomaterial (ENM) är exponering för ENM oundviklig och utvecklingen av robusta, prediktiva in vitro-testsystem är avgörande. Levertoxikologi är nyckeln vid bedömning av ENM-exponering, eftersom levern tjänar en viktig roll i metabolisk homeostas och avgiftning samt är en viktig plats för ENM-ackumulering efter exponering. Baserat på detta och den accepterade förståelsen att 2D hepatocyt modeller inte exakt efterlikna komplexiteten i invecklade multi-cellular interaktioner och metabolisk aktivitet observeras in vivo, det finns ett större fokus på utvecklingen av fysiologiskt relevanta 3D levermodeller skräddarsydda för ENM farobedömning ändamål in vitro. I enlighet med principerna i 3R för att ersätta, minska och förfina djurförsök har en 3D HepG2 cellinjebaserad levermodell utvecklats, vilket är ett användarvänligt, kostnadseffektivt system som kan stödja både utökade och upprepade ENM-exponeringssystem (≤14 dagar). Dessa sfäroidmodeller (≥500 μm i diameter) behåller sin proliferativa kapacitet (dvs. delningscellmodeller) så att de kan kopplas ihop med mikrokärnanalysen "guldstandard" för att effektivt bedöma genotoxitoxiciteten in vitro. Deras förmåga att rapportera om en rad toxikologiska effektmått (t.ex. leverfunktion, (pro-)inflammatoriskt svar, cytotoxicitet och genotoxicity) har kännetecknats av flera ENMs över både akuta (24 h) och långsiktiga (120 h) exponeringssystem. Denna 3D-in vitro-levermodell har kapacitet att användas för att utvärdera mer realistiska ENM-exponeringar, vilket ger en framtida in vitro-strategi för att bättre stödja ENM-farobedömning på ett rutinmässigt och lättillgängligt sätt.

Lämpligheten av denna cellinjebaserade 3D lever sfäroid modell för långsiktiga kultur och genotoxic farobedömning utvärderades genom att genomföra baslinjen karakterisering för att bestämma livskraft och lever-liknande funktionaliteten hos modellen under varaktigheten av 14 dagar i kultur samt dess tillämplighet för micronucleus analys.
Baslinje karakterisering av 3D HepG2 Lever sfäroid modell Före någon toxikologisk bedömning in vitro är det viktigt att kontrollera att 3D HepG2-sfäroiderna har bildats ordentligt innan agarosöverföringen eller kemisk/ENM-behandling utförs. HepG2-sfäroider som produceras med hjälp av metoden för hängande droppe tar vanligtvis 2 - 3 dagar efter sådd (4000 celler/sfäroid) för att bilda kompakta, sfäriskt formade sfäroider med en genomsnittlig diameter på 495,52 μm W x 482,69 μm H enligt figur 5A-5C. HepG2-sfäroider som har bildats korrekt och som är godtagbara för att användas för toxikologisk bedömning in vitro måste ha en kompakt, sfärisk formad struktur med en slät yta och inga visuella projektioner. Figur 5 ger exempel på god kvalitet (figur 5D-F) och en sfäroid av dålig kvalitet(figur 5G-I). Varav den senare bör kasseras. Vanligtvis kommer 90-95% av sfäroider som bildas per platta att bildas korrekt och vara livskraftiga för ytterligare experiment.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig5.jpg"> Figur 5: Lätta mikroskopibilder som visar den naturliga morfologin hos HepG2-sfäroiderna som bildas via hängande droppmetod. (A-C) visa dag 2 och (D-I) Dag 4 HepG2 lever sfäroider efter sådd. (D-F) är exempel på hepg2-sfäroider av god kvalitet medan (G-I) visar dåligt formade sfäroider. Alla bilder togs på ett X20-mål med hjälp av ett mikroskop. Skalstrecket representerar 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
För att ytterligare bekräfta HepG2 sfäroid livskraft, en grundläggande kolorimetrisk Bromocresol Green Albumin (BCG) Analys eller Urea Assay kan utföras för att bedöma deras leverliknande funktionalitet. Leverliknande funktionalitet bedömdes i linje med livskraften med trypan blue exclusion assay under en 14-dagars kulturperiod för att bestämma livslängden för leversfäroidmodellen och fastställa om den kunde stödja långsiktig eller upprepad ENM/ kemisk baserad farobedömning (figur 6). Albuminkoncentrationen förblev konsekvent under kulturperiodens varaktighet. Urea produktion visar en ökning av koncentrationen av urea produceras per sfäroid över en vecka i kultur innan du når en platå dag 7. Det är viktigt att notera att nivåerna av albumin och urea som produceras i 3D HepG2-sfäroiderna är betydligt högre än de som observerats i samma cellinje odlad i ett 2D-format. Faktum är att 2D-kulturer av HepG2-celler, toppalbumin och urea nivåer var 0,001 mg/mL respektive 0,010 ng/μL. Dessutom, i tidigare arbete publicerat av Shah et al. med hjälp av ett nästan identiskt HepG2 sfäroidsystem, belyser författarna en anmärkningsvärd förbättring av metabolisk aktivitet (CYP1A1 och CYP1A2) i 3D HepG2 in vitro-modellsystem jämfört med de 2D-odlade HepG2-cellerna5.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5.jpg"> Figur 6: 14-dagars baslinjekarakteriseringsdata för Leversfäroider från HepG2. Efter överföring från hängande droppe belyser (A) livskraften hos HepG2-sfäroidmodellen under en 14-dagarsperiod medan (B) och (C) belyser den leverliknande albumin- respektive ureafunktionen. Genomsnittliga data ± SEM presenteras, n = 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig6v5large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
Med den oundvikliga utvecklingen av en nekrotisk kärna, en känd begränsning av 3D lever sfäroid kulturer, var livskraften hos denna HepG2-baserade modell tvungen att fastställas för att visa att den kunde upprätthålla långsiktiga (5-10 dagar) exponering regimer samtidigt upprätthålla den proliferativa förmåga som krävs för att stödja mikrokärnan analys5. Faktum är att denna 3D lever sfäroid modell har visat sig behålla >70% livskraft över 10 dagar i kultur. Baserat på detta och i samband med den ihållande leverliknande funktionalitet som observerats under ≥14-dagarsperioden kan denna 3D leversfäroidmodell därmed stödja långsiktiga, upprepade ENM-exponeringssystem upp till 10 dagar långa (dvs. innan sfäroidens livskraft sjunker under 70%). Som referens rekommenderas att albuminnivåerna för HepG2-sfäroider som sås vid 4000 celler/sfäroid bör vara ≥20,0 ng/μL medan karbamidproduktionen bör vara ≥0,25 ng/μL innan en toxikologisk bedömning in vitro med denna modell görs.
Genotoxicity bedömning av konstruerade nanomaterial För genotoxicity bedömning användes mikronucleus analysen för att bestämma förekomsten av mikrokärnor efter både akut (24 h) och långsiktiga (120 h) ENM exponeringar. Aflatoxin B1 är ett känt leverkarcinogen16,17 och är en rekommenderad positiv kontroll för mikrokärnans analys. Optimeringsexperiment har visat att 0,1 μM Alfatoxin B1 inducerar ett signifikant positivt (≥2,0 gånger ökning) genotoxiskt svar i 3D HepG2 leversfäroider och används därför i varje mikrokärnaanalys som utförs med denna modell. För att säkerställa giltigheten av mikrokärnans analysresultat med hepG2-sfäroidmodellen bör bakgrundsmikrokärnafrekvensen för HepG2-celler som används i denna 3D-in vitro-modell ligga inom ett intervall på 0,6% - 1,2%. Som ett resultat bör Alfatoxin B1 inducera ett genotoxiskt svar som är minst tvåfaldigt högre än det som ses med den negativa kontrollen. Således bör 0,1 μM Alfatoxin B1 inducera en mikrokärnor frekvens mellan 1,5% – 3,0%. Med hjälp av dessa kontrollparametrar kan ENM-associerad genotoxiitet in vitro sedan bedömas på ett tillförlitligt sätt. På grundval av OECD:s testriktlinje 487 är det viktigt att notera att de valda koncentrationerna vid testning av en ENM eller kemikalie inte bör inducera mer än 55 % ± 5 % cytotoxicitet (indikeras av en minskning av CPBI- eller RVCC-värdena i förhållande till den negativa kontrollen)11. Figur 7 illustrerar de data som genererades när Aflatoxin B1 och två ENMs (titandioxid (TiO2)och sliver (Ag)) utvärderades efter både akuta och långsiktiga exponeringar i HepG2 sfäroider, och efterföljande genotoxic potential analyserades med hjälp av micronucleus analys. Båda de bedömda enm-transaktionsstrukturerna testades med en icke-cytotoxisk låg dos på 5, 00 μg/ml över en akut (24 timmar) exponering och ett långsiktigt (120 timmar) exponeringssystem. En liknande trend för genotoxicity i både TiO2 och Ag ENMs kan observeras, varigenom det förhöjda genotoxicitysvaret som resulterade efter 24 h exponering inte var uppenbart efter en långvarig 5 dagars exponering. Detta trots ihållande genotoxicity framkallas av Aflatoxin B1 positiva kontroll vid båda tidpunkterna.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61141/61141fig7.jpg"> Figur 7: Genotoxicity bedömning efter TiO2 och Ag ENM exponering på HepG2 lever sfäroider. Bedömning av genotoxicity (mikrokärnafrekvens) med hjälp av mikrokärnans analysstation (A) akut (24 timmar) och (B) långvarig (120 timmars) exponering för 5, 00 μg/ml TiO2 och Ag ENM. Negativ kontroll är endast ett medium, medan den positiva kontrollen är 0,1 μM aflatoxin B1. Medeldata (n=2) ± SD. Signifikans som anges i förhållande till den negativa kontrollen: * = p≤ 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61141/61141fig7large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure at JoVE.com

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Detta förfarande fastställdes för att användas för att utveckla avancerade 3D lever kulturer in vitro, som kan ge en mer fysiologiskt relevant bedömning av de genotoxiska faror som är associerade med nanomaterial exponeringar över både en akut eller långsiktig, upprepad dos regimer.

Avancerade 3D-levermodeller för in vitro-genotoxicitytestning efter långvarig nanomaterialexponering

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Cellodling in vitro modell för Toxic Inhalerat Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Konsekvensanalys av upprepad exponering av Organotypiska 3D bronkial och Nasal Tissue Kultur Modeller till Whole cigarett rök

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

Multi-orgeln Chip - En mikroflödes Plattform för Långsiktig Flervävnads Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

Ögonirritationstest (EIT) för Hazard Identifiering av Eye irriterande kemikalier med hjälp av rekonstruerad Human Cornea liknande Epithelial (RHCE) Tissue Modell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Improving 2D and 3D Skin In Vitro Models Using Macromolecular Crowding

Förbättra 2D och 3D Skin<em&gt; In Vitro</em&gt; Modeller Använda Macro Trängsel

The glycoprotein family of collagens represents the main structural proteins in the human body, and are key components of biomaterials used in modern ...

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualizing Angiogenesis by Multiphoton Microscopy In Vivo in Genetically Modified 3D-PLGA/nHAp Scaffold for Calvarial Critical Bone Defect Repair

Visualisera angiogenes av Multiphoton mikroskopi In Vivo i genetiskt modifierade 3D-PLGA/nHAp byggnadsställning för Calvarial kritiska ben defekt reparation

The reconstruction of critically sized bone defects remains a serious clinical problem because of poor angiogenesis within tissue-engineered scaffolds ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

Långsiktiga levande Imaging enhet för förbättrad experimentella Manipulation av zebrafisk larver

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Improved 3D Hydrogel Cultures of Primary Glial Cells for In Vitro Modelling of Neuroinflammation

Förbättrad 3D Hydrogel kulturer av primära gliaceller för In Vitro modellering av Neuroinflammation

In the central nervous system, numerous acute injuries and neurodegenerative disorders, as well as implanted devices or biomaterials engineered to enhance ...

Applying Advanced In Vitro Culturing Technology to Study the Human Gut Microbiota

Tillämpa avancerade In Vitro odling teknik för att studera mänskliga tarmfloran

The human gut microbiota plays a vital role in both human health and disease. Studying the gut microbiota using an in vivo model, is difficult due to its ...

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D Cell-Cultured Arterial Models for Studying Vascular Drug Targeting Under Flow

In Vitro 3D-cellkulturerade arteriella modeller för studier av vaskulär läkemedelsinriktning under flöde

The use of three-dimensional (3D) models of human arteries, which are designed with the correct dimensions and anatomy, enables the proper modeling of ...