Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 gennem Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, projekt N. 007317, PD/BD/105773/2014 til T.P.S og PD/BD/128376/2017 til D.E.S.N.), projekter, der samfinansieres af FEDER (POR Lisboa 2020–Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 12020) og FCT gennem tilskud PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 og CEREBEX Generation af Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Der blev også modtaget støtte fra Eu's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram under tilskudsaftalen nummer 739572 – Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passaging og vedligeholdelse af menneskelige iPC'er i monolagskultur
<ol><li>Fremstilling af plader<ol>
<li>Kældermembranmatrixen (se Materialetabel)skal opoptælles ved 4 °C, og der tilberedes 60 μL aliquots. Nedfryser aliquots ved -20 °C.</li>
		<li>At pels brønde af en 6 godt plade, tø en aliquot af kælderen membran matrix på is. Når optøet tilsættes 60 μL til 6 ml DMEM-F12. Forsigtigt resuspendret ved pipetting op og ned.</li>
		<li>Der tilsættes 1 ml fortyndet kældermembranmatrixo...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

Behovet for store celletal samt definerede kulturbetingelser for at generere specifikke celletyper til lægemiddelscreening og regenerativ medicinapplikationer har været drivkraften bag udviklingen af skalerbare kultursystemer. I de seneste år, flere grupper har rapporteret den skalerbare generation af neurale forfædre og funktionelle neuroner32,33,34, giver betydelige fremskridt i udviklingen af nye modeller for neurodegener...

Fremkomsten af humane pluripotente stamceller (KPC'er) udgør et fremragende værktøj til regenerativ medicin og sygdomsmodellering, fordi disse celler kan differentieres i de fleste celle slægter af den menneskelige krop1,,2. Siden deres opdagelse, PSC differentiering ved hjælp af forskellige tilgange er blevet rapporteret til at modellere forskellige sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser3,4,5,6.
For nylig har der været rapporter om 3D-kulturer stammer fra kvikskranker, der ligner menneskelige cerebrale strukturer; disse kaldes hjerneorganoider3,,7,8. Generationen af disse strukturer fra både sunde og patientspecifikke kvikskranker giver en værdifuld mulighed for at modellere menneskelig udvikling og neuroudviklingsmæssige lidelser. Men de metoder, der anvendes til at generere disse velorganiserede cerebrale strukturer er vanskelige at anvende for deres store produktion. At producere strukturer, der er store nok til at opsummere væv morfogenese uden nekrose inde i organoider, protokoller stole på den oprindelige neurale engagement i statiske forhold, efterfulgt af indkapsling i hydrogels og efterfølgende kultur i dynamiske systemer3. Sådanne tilgange kan dog begrænse den potentielle opskalering af organoidproduktionen. Selv om der er gjort en indsats for at dirigere PSC differentiering til specifikke regioner i centralnervesystemet, herunder kortikale, striatal, midbrain, og rygmarv neuroner9,10,11,12, generation af specifikke hjerneregioner i dynamiske forhold er stadig en udfordring. Især er generationen af modne cerebellar neuroner i 3D-strukturer endnu ikke beskrevet. Muguruma et al. banebrydende generation af kultur betingelser, der opsummerer tidlig cerebellar udvikling13 og for nylig rapporteret en protokol, der giver mulighed for menneskelige embryonale stamceller til at generere en polariseret struktur, der minder om første trimester cerebellum7. Modningen af cerebellar neuroner i de rapporterede undersøgelser kræver imidlertid dissociation af organoider, sortering af cerebellar stamfader, og coculture med feeder celler i en monolayer kultur system7,14,15,16. Derfor er den reproducerbare generering af de ønskede cerebellar organoider til sygdomsmodellering under definerede betingelser stadig en udfordring forbundet med kultur og feeder kilde variation.
Denne protokol præsenterer optimale kulturbetingelser for 3D-udvidelse og effektiv differentiering af menneskelige kvikskranker i cerebellar-neuroner ved hjælp af enkeltbrugsaustielle hjulbioreaktorer (se tabel over materialer for specifikationer), i det følgende kaldet bioreaktorer. Bioreaktorer er udstyret med et stort lodret løbehjul, som i kombination med en U-formet bund giver en mere homogen forskydningsfordeling inde i beholderen, hvilket muliggør skånsom, ensartet blanding og partikelsuspension med reducerede omrøringshastigheder17. Med dette system kan der opnås form- og størrelsesstyrede celleaggreggre, hvilket er vigtigt for en mere homogen og effektiv differentiering. Desuden kan et større antal iPSC-afledte organoider genereres på en mindre besværlig måde.
Det vigtigste træk ved de organoider, som er 3D flercellede strukturer normalt dannet af stamceller, er selvorganisering af forskellige celletyper, der danner specifikke former som dem, der ses i human morfogenese18,19,20. Derfor er organoid morfologi et vigtigt kriterium, der skal evalueres under differentieringsprocessen. Kryosektion af organoider og yderligere immunstaining af organoid skiver med et bestemt sæt af antistoffer giver mulighed for rumlig visualisering af molekylære markører til at analysere celleproliferering, differentiering, cellepopulationidentitet og apoptose. Med denne protokol, ved immunstaining organoid kryosektioner, en indledende effektiv neurale engagement er observeret af 7th dag differentiering. Under differentiering observeres flere cellepopulationer med cerebellaridentitet. Efter 35 dage i dette dynamiske system, cerebellar neuroepithelium organiserer langs en apicobasal akse, med et apikale lag af prolifererende forfædre og basalt placeret postmitotiske neuroner. Under modningsprocessen, fra dag 35-90 af differentiering, forskellige typer af cerebellar neuroner kan ses, herunder Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/ MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolar børste celler (TBR2+), og dyb cerebellar kerner projektion neuroner (TBR1+). Også, en ikke-betydelig mængde celledød er observeret i de genererede cerebellar organoids efter 90 dage i kultur.
I dette system, humane iPSC-afledte organoider modnes i forskellige cerebellar neuroner og overleve i op til 3 måneder uden behov for dissociation og feeder coculture, giver en kilde til humane cerebellar neuroner til sygdom modellering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Lillehjernen spiller en afgørende rolle i opretholdelsen af balance og motorisk koordination, og en funktionel defekt i forskellige cerebellar neuroner kan udløse cerebellar dysfunktion. De fleste af de nuværende viden om sygdomsrelaterede neuronal fænotyper er baseret på postmortem væv, hvilket gør forståelse af sygdomsprogression og udvikling vanskelig. Dyremodeller og udødeliggjorte cellelinjer er også blevet brugt som modeller for neurodegenerative lidelser. Men de ikke fuldt ud opsummere menneskelige sygdomme. Humane inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er) har et stort potentiale for sygdomsmodellering og udgør en værdifuld kilde til regenerative tilgange. I de seneste år, generation af cerebrale organoider fra patient-afledte iPSCs forbedret udsigterne for neurodegenerative sygdom modellering. Men, protokoller, der producerer et stort antal organoider og et højt udbytte af modne neuroner i 3D-kultur systemer mangler. Den protokol, der præsenteres, er en ny metode til reproducerbar og skalerbar generation af humane iPSC-afledte organoider under kemisk definerede betingelser ved hjælp af skalerbare engangsbioreaktorer, hvor organoider får cerebellaridentitet. De genererede organoider er karakteriseret ved ekspression af specifikke markører på både mRNA- og proteinniveau. Analysen af specifikke grupper af proteiner gør det muligt at detektionere forskellige cerebellar cellepopulationer, hvis lokalisering er vigtig for evalueringen af organoid struktur. Organoid kryosektring og yderligere immunstaining af organoid skiver bruges til at vurdere tilstedeværelsen af specifikke cerebellar cellepopulationer og deres rumlige organisation.

Protokollen blev indledt ved at fremme cellesammenlægning ved hjælp af 0,1 L bioreaktorer (Figur 1A). Enkeltcelleinokulering af iPSC'erne blev udført med 250.000 celler/ml seedet i 60 ml medium med en omrøringshastighed på 27 omdrejninger i minuttet. Dette blev defineret som dag 0. Efter 24 timer dannede cellerne effektivt sfæroidformede aggregater (dag 1, figur 1B), og morfologien var velholdt indtil dag 5 med en gradvis forøgelse af størrelsen, hvilket...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Denne protokol beskriver et dynamisk kultursystem til fremstilling af kontrollerede størrelsesggreg aggregater af humane pluripotente stamceller og yderligere stimulerer differentiering i cerebellar organoider under kemisk definerede og feeder-fri betingelser ved hjælp af en engangsbioreaktor.

Skalerbar generation af modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Vi præsenterer for første gang en ny tilgang til reproducerbar og skalerbar generation, af IPS-celler afledt på Cerebellar Organoids, og et kemisk defineret betingelser, ved hjælp af engangsbioreaktorer. For at få celler til såning af bioreaktoren tilsættes en milliliter celleafrivelsesmedium til hver brønd af en seks brøndplade af humane iPSC'er. Inkuber pladen ved 37 grader Celsius i syv minutter, indtil blid omrystning let løsner cellerne, fra brønden.Ved hjælp af en P 1000 mikropipette, pipet celle udstationering medium, op og ned, indtil cellerne dissociate i enkelte celler. Næste tilføje to milliliter, af komplet cellekultur medium til hver brønd, vil dette inaktivere enzymatisk fordøjelse. Brug derefter pipetten til forsigtigt at overføre cellerne til et sterilt konisk rør.Centrifuge røret ved 210 gange tyngdekraften i tre minutter. Fjern supernatanten, og re-suspendere celle pellet i kultur medium. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer, og trypan blå farvestof.Se bioreaktorbeholderen med iPSC'erne med en massetæthed på 250.000 celler pr. milliliter. Sæt bioreaktorbeholderen i Universal Base Unit i en inkubator ved 37 grader Celsius, 95 % fugtighed og 5 % kuldioxid. For at fremme iPSC-sammenlægning skal du indstille omrørningshastigheden for basiskontrolenheden til 27 omdr./min.På dag ét, med dag nul er dagen for såning bioreaktoren, placere bioreaktor, og basisenheden i en steril flow hætte, derefter bruge en serologisk pipette, at indsamle en en milliliter prøve, af cellen suspension. Plade celle suspension i en ultra lav vedhæftet fil, 24 godt plade. Brug et mikroskop, for at bekræfte, at iPSC afledte aggregater har dannet.Hvis ja, tage billeder af aggregater på 40 X eller 100 X.Continue dyrke iPSC's og bioreaktor, indtil den gennemsnitlige diameter af aggregaterne, er 100 mikrometer, derefter erstatte 80% af mediet, med frisk MT01 uden rock-hæmmer. Når aggregaterne, nå 200 til 250 mikrometer i diameter, lad alle organoider bosætte sig, i bunden af bioreaktoren, derefter erstatte alle de brugte medium, med gfCDM differentiering medium. Sæt basisenheden og bioreaktoren i inkubatoren og ytret omrøring til 25 omdr./min.Efter fjernelse af supernatant fra de lagrede organoider, tilsæt en milliliter på 15% saccharose til pellet, og bland godt ved at hvirvle forsigtigt. Efter inkubering af organoider natten over, ved fire grader Celsius, fjerne saccharose opløsning, derefter tilføje en milliliter af 15% saccharose, 7,5%gelatine, og bland hurtigt ved forsigtigt hvirvlende. Mens organoider inkuberer ved 37 grader Celsius fylde en plastbeholder halvvejs med 15% saccharose 7,5% gelatine opløsning, og gør det muligt at størkne.Efter organoider har været inkuberende i en time, bruge en Pasteur pipette, at placere en dråbe af organoid saccharose gelatine blanding, på toppen af størknede saccharose og gelatine. Efter at have ventet 15 minutter for faldet til størkne, fylde resten af plastbeholderen, med mere 15% saccharose, 7,5% gelatine, gør det muligt at størkne helt ved stuetemperatur og derefter inkubere det i 20 minutter ved fire grader Celsius. Skær gelatine i en terning, med organoids i midten, fastgør terningen til et stykke pap, med en dråbe OCT sammensatte, derefter placeret 250 milliliter Isopentan, i en 500 milliliter kop, fylde en passende beholder, med flydende nitrogen.Brug snævler og tykke handsker, omhyggeligt placere kop Isopentane, på overfladen af det flydende kvælstof. Isopentan og flydende nitrogen, er farlige reagenser. Brugen af disse to reagenser kræver personlige værnemidler, herunder tykke handsker og tilstrækkelig ventilation.Når Isopentane, er afkølet til negative 80 grader Celsius, placere gelatine terningen i Isopentane, indtil det fryser. En godt frossen terning, producerer en metallisk lyd, når let tappet med snævler, hvilket indikerer, at den er klar til at blive opbevaret. Mikroskopdias, der indeholder organoidsektionerne, vaskes med 50 milliliter 1X PBS i fem minutter, hvortilglassene overføres til en Coplin-krukke med frisk 1X PBS.Overfør objektglassene til en Coplin-krukke, der indeholder 50 milliliter frisklavet glycin og inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur, og overfør derefter objektglassene til en Coplin-krukke, der indeholder 50 milliliter 0,1 % Triton, og permeabiliseres i 10 minutter ved stuetemperatur. Vask objektglassene to gange med 1X PBS i fem minutter hver gang. Forbered immunstaining skålen, med tre millimeter papir, dyppet i 1X PBS.Tør dias med et væv rundt om skiver og læg dem på de tre millimeter papir. Med en Pasteur pipette skal du dække hvert dias med 0,5 milliliter blokerende opløsning. Efter inkubering i 30 minutter ved stuetemperatur, fjerne overskydende blokering løsning og køre dias med et væv, hele vejen rundt om skiverne.Placer 50 mikroliter af fortyndet primært antistof på hvert rutsjebane og dæk dem med dækselssedler. Lace dias, i den tidligere forberedt immunostaining fad, og inkubere dem ved fire grader Celsius. Efter natten inkubation, overføre dias til en Coplin krukke, med 50 milliliter TBST, lade dækslet glider falde af, derefter vaske dias tre gange med TBST, i fem minutter hver gang.Placer 50 mikroliter, af fortyndet sekundært antistof på hvert rutsjebane, og dæk dem med dækslerne. Placer objektglassene i den tidligere tilberedte immunstainingskål, inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Overfør diasene til en Coplin krukke igen, og vask dem tre gange med 50 milliliter TBST, i fem minutter hver gang.Ved hjælp af en Pasteur Pipette, ved 0,5 milliliter dappy opløsning, over hele overfladen af hvert dias og inkubere i fem minutter ved stuetemperatur. Efter 24 timer i bioreaktoren, iPSC's effektivt dannede sfæroide formede aggregater. Morfologien var velholdt indtil dag fem, med en gradvis stigning i størrelse.Udviser en høj grad af homogenitet. En kvantitativ analyse ved mikroskopi, afslørede også normal fordeling, af samlede størrelser efter dag ét, og begge cellelinjer opnåede den optimale samlede størrelse efter dag to. Efter den ønskede samlede diameter blev opnået, neurale engagement blev induceret, og derefter generation, af forskellige cerebellar stamfader blev forfremmet.Under differentiering organoids, viste en mere udtalt epitelisering ligner neurale rør-lignende strukturer med luminal rum. Desuden var organoid diameter fordelingen homogen under den oprindelige cerebellar engagement indtil dag 14. Immunofluorescens analyse understøtter, at en effektiv neurale engagement, af iPSC afledte organoider, er allerede opnået, ved dag syv af differentiering.Immunstaining demonstrerede også, effektivt cerebellar engagement og effektiv modning af cerebellar organoider. Efter 80 dage i bioreaktoren viste levende døde pletter af organoider desuden høj cellelevedygtighed og ingen tegn på nekrotiske områder. Denne teknik repræsenterer et vigtigt redskab til at studere patologiske veje, der er involveret i degeneration af cerebellar observeret i og til evaluering af den terapeutiske virkning af nye lægemidler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv Generation og redigering af Feeder-gratis IPSCs fra pancreas celler ved hjælp af CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisning af Endotoxin i Nano-formuleringer bruger Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Vækst og karakterisering af bestrålede Organoider fra mælkekirtler

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering af voksne humane Dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering af inducerede pluripotente stamceller ved hjælp af en ikke-integrerings metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidet differentiering af modne nyre podocytter fra menneskeskabte pluripotente stamceller under kemisk definerede forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afledte humane manipuleret bindevæv til screeningsapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...