Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Dit werk werd ondersteund door Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 door Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 naar T.P.S en PD/BD/128376/2017 naar D.E.S.N.), projecten medegefinancierd door FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) en FCT door subsidie PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 en CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Er werd ook financiering ontvangen van het Horizon 2020-programma voor onderzoek en innovatie van de Europese Unie, onder het grant agreement nummer 739572— het Discoveries Centre for Regeneratieve en Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Doorgeven en onderhouden van menselijke IPSCs in monolaagcultuur
<ol><li>Bereiding van platen<ol>
<li>Ontdooi de keldermembraanmatrix (zie Tabel van Materialen)voorraad bij 4 °C en bereid 60 μL aliquots voor. Vries de aliquots op -20 °C.</li>
		<li>Om de putten van een 6 putplaat te coaten, ontdooi je een aliquot van de keldermembraanmatrix op ijs. Eenmaal ontdooid voeg 60 μL toe aan 6 mL DMEM-F12. Voorzichtig resuspend door pipetting op en neer.</li>
		<li>Voeg 1 mL verdunde keldermembraanmatri...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

De behoefte aan grote celaantallen en gedefinieerde kweekomstandigheden om specifieke celtypen te genereren voor toepassingen voor geneesmiddelenscreening en regeneratieve geneeskunde heeft de ontwikkeling van schaalbare cultuursystemen aanstuurd. In de afgelopen jaren hebben verschillende groepen gemeld de schaalbare generatie van neurale voorouders en functionele neuronen32,33,34, het verstrekken van aanzienlijke vooruitgang i...

De opkomst van menselijke pluripotente stamcellen (PSC's) is een uitstekend hulpmiddel voor regeneratieve geneeskunde en ziektemodellering, omdat deze cellen kunnen worden onderscheiden in de meeste cellijnen van het menselijk lichaam1,2. Sinds hun ontdekking is psc-differentiatie met behulp van verschillende benaderingen gemeld om verschillende ziekten te modelleren, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen3,4,5,6.
Onlangs zijn er meldingen van 3D-culturen afgeleid van PSC's die lijken op menselijke hersenstructuren; deze worden hersenorganoïden3,7,8genoemd. De generatie van deze structuren van zowel gezonde als patiëntspecifieke PSC's biedt een waardevolle kans om menselijke ontwikkeling en neuroontwikkelingsstoornissen te modelleren. Echter, de methoden die worden gebruikt om deze goed georganiseerde cerebrale structuren te genereren zijn moeilijk toe te passen voor hun grootschalige productie. Om structuren te produceren die groot genoeg zijn om weefselmorfogenese samen te vatten zonder necrose in de organoïden, zijn protocollen afhankelijk van de initiële neurale inzet in statische omstandigheden, gevolgd door inkapseling in hydrogels en de daaropvolgende cultuur in dynamische systemen3. Dergelijke benaderingen kunnen echter de potentiële opschaaring van de organoïdeproductie beperken. Hoewel er inspanningen zijn geleverd om psc-differentiatie rechtstreeks naar specifieke regio's van het centrale zenuwstelsel, met inbegrip van corticale, striatale, midbrain, en ruggenmerg neuronen9,10,11,12, de generatie van specifieke hersengebieden in dynamische omstandigheden is nog steeds een uitdaging. In het bijzonder, de generatie van volwassen cerebellar neuronen in 3D-structuren moet nog worden beschreven. Muguruma et al. pionierde de generatie van cultuuromstandigheden die vroege cerebellar ontwikkeling13 recapituleren en rapporteerde onlangs een protocol dat het mogelijk maakt voor menselijke embryonale stamcellen om een gepolariseerde structuur die doet denken aan het eerste trimester cerebellum7te genereren. Echter, de rijping van cerebellar neuronen in de gerapporteerde studies vereist de dissociatie van de organoïden, sorteren van cerebellar voorlopers, en cocultuur met feeder cellen in een monolaag cultuursysteem7,14,15,16. Daarom is de reproduceerbare generatie van de gewenste cerebellar organoïden voor ziektemodellering onder bepaalde omstandigheden nog steeds een uitdaging in verband met cultuur en feeder bron variabiliteit.
Dit protocol biedt optimale kweekomstandigheden voor 3D-expansie en efficiënte differentiatie van menselijke PSC's in cerebellar neuronen met behulp van verticale wielbioreactoren voor eenmalig gebruik (zie tabel van materialen voor specificaties), hierna bioreactoren genoemd. Bioreactoren zijn uitgerust met een grote verticale waaier, die in combinatie met een U-vormige bodem zorgt voor een meer homogene schuifverdeling in het vat, waardoor zachte, uniforme meng- en deeltjessuspensie mogelijk is met lagere agitatiesnelheden17. Met dit systeem kunnen vorm- en groottegecontroleerde celaggregaten worden verkregen, wat belangrijk is voor een meer homogene en efficiënte differentiatie. Bovendien kan een groter aantal iPSC-afgeleide organoïden op een minder moeizame manier worden gegenereerd.
Het belangrijkste kenmerk van de organoïden, die 3D meercellige structuren meestal gevormd uit stamcellen, is de zelforganisatie van verschillende celtypes die specifieke vormen vormen zoals die gezien in de menselijke morfogenese18,19,20. Daarom is organoïde morfologie een belangrijk criterium dat tijdens het differentiatieproces moet worden geëvalueerd. Cryosectioning van organoïden en verdere immunostaining van organoïde plakjes met een specifieke set antilichamen zorgen voor de ruimtelijke visualisatie van moleculaire markers om celproliferatie, differentiatie, celpopulatieidentiteit en apoptose te analyseren. Met dit protocol, door het immunostaineren van organoïde cryosections, wordt een eerste efficiënte neurale inzet waargenomen door de7e dag van differentiatie. Tijdens differentiatie worden verschillende celpopulaties met cerebellar-identiteit waargenomen. Na 35 dagen in dit dynamische systeem organiseert het cerebellar neuroepithelium zich langs een apicobasale as, met een apicale laag prolifererende voorouders en basaal gelegen postmitotische neuronen. Tijdens het rijpingsproces, van dagen 35-90 van differentiatie, kunnen verschillende soorten cerebellar neuronen worden gezien, waaronder Purkinje cellen (Calbindin+), granulecellen (PAX6+/MAP2+), Golgi cellen (Neurogranin+), unipolaire borstelcellen (TBR2+), en diepe cerebellar kernprojectie neuronen (TBR1+). Ook wordt een niet-significante hoeveelheid celdood waargenomen in de gegenereerde cerebellaire organoïden na 90 dagen in cultuur.
In dit systeem, menselijke iPSC-afgeleide organoïden rijpen in verschillende cerebellar neuronen en overleven voor maximaal 3 maanden zonder de noodzaak van dissociatie en feeder cocultuur, het verstrekken van een bron van menselijke cerebellar neuronen voor ziekte modellering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Het cerebellum speelt een cruciale rol in het onderhoud van evenwicht en motorische coördinatie, en een functioneel defect in verschillende cerebellar neuronen kan leiden tot cerebellar disfunctie. Het grootste deel van de huidige kennis over ziekte-gerelateerde neuronale fenotypes is gebaseerd op postmortem weefsels, waardoor het begrijpen van de progressie van de ziekte en ontwikkeling moeilijk. Dierlijke modellen en vereeuwigde cellijnen zijn ook gebruikt als modellen voor neurodegeneratieve aandoeningen. Ze vatten echter niet volledig de menselijke ziekte samen. Door de mens veroorzaakte pluripotente stamcellen (iPSC's) hebben een groot potentieel voor ziektemodellering en vormen een waardevolle bron voor regeneratieve benaderingen. In de afgelopen jaren verbeterde de generatie van cerebrale organoïden uit door patiënten afgeleide iPSC's de vooruitzichten voor neurodegeneratieve ziektemodellering. Echter, protocollen die grote aantallen organoïden produceren en een hoge opbrengst van volwassen neuronen in 3D-cultuursystemen ontbreken. Het gepresenteerde protocol is een nieuwe aanpak voor reproduceerbare en schaalbare generatie van menselijke iPSC-afgeleide organoïden onder chemisch gedefinieerde omstandigheden met behulp van schaalbare bioreactoren voor eenmalig gebruik, waarin organoïden een cerebellaire identiteit verwerven. De gegenereerde organoïden worden gekenmerkt door de expressie van specifieke markers op zowel mRNA- als eiwitniveau. De analyse van specifieke groepen eiwitten maakt de detectie van verschillende cerebellar celpopulaties mogelijk, waarvan de lokalisatie belangrijk is voor de evaluatie van de organoïde structuur. Organoïde cryosectioning en verdere immunostaining van organoïde plakjes worden gebruikt om de aanwezigheid van specifieke cerebellar celpopulaties en hun ruimtelijke organisatie te evalueren.

Het protocol werd geïnitieerd door celaggregatie te bevorderen met behulp van de 0,1 L bioreactoren (figuur 1A). Eencellige inenting van de iPSCs werd uitgevoerd, met 250.000 cellen/mL gezaaid in 60 mL van medium met een agitatiesnelheid van 27 rpm. Dit werd gedefinieerd als dag 0. Na 24 uur vormden de cellen efficiënt sferoïde-vormige aggregaten (dag 1, figuur 1B),en de morfologie werd goed onderhouden tot dag 5, met een geleidelijke toename in grootte, waar...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Dit protocol beschrijft een dynamisch cultuursysteem om gecontroleerde grootteaggregaten van menselijke pluripotente stamcellen te produceren en differentiatie in cerebellar organoïden verder te stimuleren onder chemisch gedefinieerde en feedervrije omstandigheden met behulp van een bioreactor voor eenmalig gebruik.

Schaalbare generatie van volwassen cerebellar organoïden uit menselijke pluripotente stamcellen en karakterisering door immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

We presenteren voor het eerst een nieuwe aanpak voor reproduceerbare en schaalbare generatie, van IPS-cellen afgeleid bij Cerebellar Organoids, en een chemische gedefinieerde omstandigheden, met behulp van bioreactoren voor eenmalig gebruik. Om cellen te verkrijgen voor het zaaien van de bio-reactor, voeg een milliliter van celloslating medium, aan elke put van een zes put plaat van menselijke iPSC's. Incubeer de plaat op 37 graden Celsius gedurende zeven minuten, tot zacht schudden gemakkelijk los de cellen, van de put.Met behulp van een P 1000 micropipet, pipet de cel detachement medium, op en neer, totdat de cellen scheiden in enkele cellen. Voeg vervolgens twee milliliter, van volledige celcultuur medium aan elke put, dit zal enzymatische spijsvertering inactiveren. Gebruik vervolgens de pipet, om de cellen voorzichtig over te brengen naar een steriele kegelbuis.Centrifuge de buis op 210 keer zwaartekracht gedurende drie minuten. Verwijder de supernatant, en opnieuw op te schorten de cel pellet in cultuur medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer, en trypan blauwe kleurstof.Zie het bioreactorvat met de iPSC's, met een dichtheid van 250.000 cellen per milliliter. Plaats het bioreactorvat in de Universal Base Unit in een couveuse bij 37 graden Celsius, 95% luchtvochtigheid en 5% kooldioxide. Om iPSC-aggregatie te bevorderen, stelt u de agitatiesnelheid van de Base Control Unit in op 27 RPM.Op dag één, met dag nul is de dag van het zaaien van de bioreactor, plaats de bioreactor, en de Base Unit in een steriele stroom kap, gebruik dan een serologische pipet, om een een milliliter monster te verzamelen, van de cel suspensie. Plaat de cel suspensie in een ultra lage bevestiging, 24 goed plaat. Gebruik een microscoop, om te bevestigen dat iPSC afgeleide aggregaten hebben gevormd.Als dat zo is, leg dan beelden van de aggregaten op 40 X of 100 X.Continue culturing van de iPSC's en de bioreactor, totdat de gemiddelde diameter van de aggregaten, is 100 micrometer, vervang dan 80% van het medium, met verse MT01 zonder rockremmer. Wanneer de aggregaten, bereiken 200 tot 250 micro meter in diameter, laat alle organoïden vestigen, aan de onderkant van de bioreactor, vervang dan al het gebruikte medium, met gfCDM differentiatie medium. Plaats de basiseenheid en de bioreactor in de couveuse en verlaag de agitatie tot 25 RPM.Na het verwijderen van de supernatant uit de opgeslagen organoïden, voeg een milliliter van 15% sacharose aan de pellet, en meng goed door zachtjes wervelen. Na het uitbroeden van de organoïden 's nachts, op vier graden Celsius, verwijder de sacharose oplossing, voeg dan een milliliter van 15%sucrose, 7,5% gelatine, en snel mengen door zachtjes wervelen. Terwijl de organoïden broeden op 37 graden Celsius vul een plastic container halverwege met de 15%sucrose 7,5%gelatine oplossing, en laat het stollen.Nadat de organoïden een uur lang zijn uitbroeden, gebruikt u een Pasteur pipet om een druppel van het organoïde sucrosegelatinemengsel te plaatsen, bovenop de gestolde sacharose en gelatine. Na 15 minuten wachten op de daling te stollen, vul de rest van de plastic container, met meer 15% sacharose, 7,5%gelatine, laat het volledig stollen bij kamertemperatuur en vervolgens uitbroeden gedurende 20 minuten op vier graden Celsius. Snijd de gelatine in een kubus, met de organoïden in het midden, bevestig de kubus op een stuk karton, met een druppel LGO verbinding, dan geplaatst 250 milliliter isopentane, in een 500 milliliter beker, vul een geschikte container, met vloeibare stikstof.Plaats met behulp van tangen en dikke handschoenen voorzichtig de beker isopentane, op het oppervlak van de vloeibare stikstof. Isopentane en vloeibare stikstof, zijn gevaarlijke reagentia. Het gebruik van deze twee reagentia, vereisen persoonlijke beschermingsmiddelen, met inbegrip van dikke handschoenen en een adequate ventilatie.Wanneer de Isopentane, is afgekoeld tot negatieve 80 graden Celsius, plaats de gelatine kubus in de Isopentane totdat het bevriest. Een goed bevroren kubus, produceert een metalen geluid wanneer licht getapt met tangen, wat aangeeft dat het klaar is om te worden opgeslagen. Was de microscoopdia's met de organoïde secties, met 50 milliliter 1X PBS gedurende vijf minuten, breng de dia's vervolgens over naar een Coplin-pot, met verse 1X PBS.Breng de glijbanen over op een Coplin-pot, met 50 milliliter vers bereide glycine en incubaal gedurende 10 minuten op kamertemperatuur, breng de glijbanen over naar een Coplin-pot, met 50 milliliter 0,1%Triton en 10 minuten doorverbrand bij kamertemperatuur. Was de glijbanen twee keer met 1X PBS, telkens vijf minuten. Bereid de immunostaining schotel, met drie millimeter papier, gedrenkt in 1X PBS.Droog de glijbanen met een weefsel rondom de plakjes en leg ze op het drie millimeter papier. Bedek met een Pasteur pipet elke dia met 0,5 milliliter blokkeeroplossing. Na het uitbroeden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur, verwijder overtollige blokkeren oplossing en rijden de dia's met een weefsel, rondom de plakjes.Plaats 50 microliter verdunde primaire antilichamen, op elke dia en bedek ze met afdekslips. Kant de glijbanen, in de eerder bereide immunostaining schotel, en uitbroed ze op vier graden Celsius. Na 's nachts incubatie, breng de dia's naar een Coplin pot, met 50 milliliter tbs, laat de cover slips vallen, dan was de dia's drie keer met TBST, voor vijf minuten elke keer.Plaats 50 microliter, van verdund secundair antilichaam op elke dia, en dek af met de cover slips. Plaats de glijbanen, in het eerder bereide immunostaining schotel, incubeer gedurende 30 minuten op kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Breng de dia's weer naar een Coplin-pot en was ze drie keer met 50 milliliter tbst, telkens vijf minuten.Met behulp van een Pasteur Pipette, op 0,5 milliliter van dappy oplossing, over het hele oppervlak van elke dia en incubeer gedurende vijf minuten bij kamertemperatuur. Na 24 uur in de bioreactor, iPSC's efficiënt gevormde sferoïde gevormde aggregaten. De morfologie was goed onderhouden tot dag vijf, met een geleidelijke toename in omvang.Het aantonen van een hoge mate van homogeniteit. Een kwantitatieve analyse per microscopie, ook bleek normale verdeling, van aggregaat maten door dag een, en beide cellijnen bereikt de optimale aggregaat grootte door dag twee. Nadat de gewenste geaggregeerde diameter was bereikt, werd neurale inzet geïnduceerd, en vervolgens generatie, van verschillende cerebellar voorlopers werd bevorderd.Tijdens differentiatie organoïden, toonde een meer uitgesproken epithelialisatie vergelijkbaar met neurale buis-achtige structuren met luminale ruimte. Bovendien, de organoïde diameter verdeling, was homogeen tijdens de eerste cerebellar verbintenis tot dag 14. Immunofluorescentieanalyse ondersteunt, dat een efficiënte neurale verplichting, van de iPSC afgeleide organoïden, reeds, door dag zeven van differentiatie wordt bereikt.Immunostaining toonde ook, efficiënte cerebellar inzet en efficiënte rijping van cerebellar organoïden. Bovendien, na 80 dagen in de bioreactor, toonde levende dode kleuring van organoïden een hoge cel levensvatbaarheid, en geen bewijs van necrotische gebieden. Deze techniek is een belangrijk instrument, voor het bestuderen van pathologische paden, betrokken bij de degeneratie van de cerebellar waargenomen in van en voor de evaluatie van het therapeutische effect van nieuwe geneesmiddelen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiënte generatie en het bewerken van Feeder-vrije IPSCs van menselijke Pancreatic cellen met behulp van de CRISPR-Cas9-systeem

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detectie van endotoxinen in Nano-formuleringen gebruiken Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) testen

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Groei en karakterisering van bestraalde Organoids van de borstklieren

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolatie van volwassen menselijke dermale fibroblasten uit de buikhuid en de aanmaak van geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van een niet-integrerende methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geleide differentiatie van rijpe nierpodocyten uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen onder chemisch gedefinieerde omstandigheden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast afgeleide human engineered bindweefsel voor screeningstoepassingen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...