Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Ce travail a été soutenu par Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 par l’intermédiaire de Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Projet N. 007317, PD/BD/105773/2014 à T.P.S et PD/BD/128376/2017 à D.E.S.N.), projets cofinancés par FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) et FCT par le biais de la subvention PAC-PRECIS LISBOA-01-0145-FEDER-016394 et CEREBEX Génération d’Organoïdes cérébellaires pour la subvention de recherche sur l’ataxie LISBOA-0145-FEDER-029298. Le financement a également été reçu du Programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne, dans le cadre de l’Accord de subvention 739572— The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passage et entretien des iPSCs humains dans la culture monocouche
<ol><li>Préparation des plaques<ol>
<li>Décongeler la matrice membranaire du sous-sol (voir tableau des matériaux)à 4 °C et préparer 60 aliquots μL. Congeler les aliquots à -20 °C.</li>
		<li>Pour recouvrir les puits d’une plaque de 6 puits, décongeler un aliquot de la matrice de membrane du sous-sol sur la glace. Une fois décongelé, ajouter 60 μL à 6 mL de DMEM-F12. Resuspendez doucement en faisant des pipes de haut e...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. 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M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. 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La nécessité d’un grand nombre de cellules ainsi que de conditions de culture définies pour générer des types de cellules spécifiques pour le dépistage des médicaments et les applications de médecine régénérative a été le moteur du développement de systèmes de culture évolutive. Ces dernières années, plusieurs groupes ont signalé la génération évolutive de progéniteurs neuronaux et de neurones fonctionnels32,33,<sup class="xre...

L’émergence de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) représente un excellent outil pour la médecine régénérative et la modélisation des maladies, parce que ces cellules peuvent être différenciées dans la plupart des lignées cellulaires du corps humain1,2. Depuis leur découverte, la différenciation psc utilisant diverses approches a été rapportée pour modéliser différentes maladies, y compris les désordres neurodégénératifs3,4,5,6.
Récemment, il y a eu des rapports des cultures 3D dérivées des PSC ressemblant aux structures cérébrales humaines ; ceux-ci sont appelés organoïdes du cerveau3,7,8. La génération de ces structures à partir de CSP sains et spécifiques aux patients offre une occasion précieuse de modéliser le développement humain et les troubles neurodéveloppementaux. Cependant, les méthodes utilisées pour générer ces structures cérébrales bien organisées sont difficiles à appliquer pour leur production à grande échelle. Pour produire des structures suffisamment grandes pour récapituler la morphogenèse tissulaire sans nécrose à l’intérieur des organoïdes, les protocoles s’appuient sur l’engagement neuronal initial dans des conditions statiques, suivi de l’encapsulation dans les hydrogels et de la culture subséquente dans les systèmes dynamiques3. Toutefois, de telles approches peuvent limiter l’augmentation potentielle de la production d’organoïdes. Même si des efforts ont été faits pour diriger la différenciation psc à des régions spécifiques du système nerveux central, y compris cortical, striatal, midbrain, et les neurones de la moelle épinière9,10,11,12, la génération de régions spécifiques du cerveau dans des conditions dynamiques est toujours un défi. En particulier, la génération de neurones cérebelaires matures dans les structures 3D n’a pas encore été décrite. Muguruma et coll. ont été les pionniers de la génération de conditions culturelles qui récapitulent le développement cérébellaire précoce13 et ont récemment signalé un protocole qui permet aux cellules souches embryonnaires humaines de générer une structure polarisée rappelant le cervelet du premier trimestre7. Cependant, la maturation des neurones cérébellaires dans les études rapportées nécessite la dissociation des organoïdes, le tri des progéniteurs cérébellaires, et la coculture avec des cellules d’alimentation dans un système de culture monocouche7,14,15,16. Par conséquent, la génération reproductible des organoïdes cérébellaires désirés pour la modélisation de la maladie dans des conditions définies est toujours un défi associé à la culture et à la variabilité des sources d’alimentation.
Ce protocole présente des conditions de culture optimales pour l’expansion 3D et une différenciation efficace des CSP humains en neurones cérébellaires à l’aide de bioréacteurs à roue verticale à usage unique (voir tableau des matériaux pour les spécifications), ci-après appelé bioréacteurs. Les bioréacteurs sont équipés d’un grand rotor vertical, qui, en combinaison avec un fond en forme de U, fournissent une distribution de cisaillement plus homogène à l’intérieur du récipient, permettant un mélange doux et uniforme et la suspension des particules avec des vitesses d’agitation réduites17. Avec ce système, des agrégats cellulaires contrôlés par la forme et la taille peuvent être obtenus, ce qui est important pour une différenciation plus homogène et plus efficace. En outre, un plus grand nombre d’organoïdes dérivés de l’iPSC peuvent être générés d’une manière moins laborieuse.
La principale caractéristique des organoïdes, qui sont des structures multicellulaires 3D habituellement formées à partir de cellules souches, est l’auto-organisation de différents types de cellules qui forme des formes spécifiques comme celles observées dans la morphogenèse humaine18,19,20. Par conséquent, la morphologie organoïde est un critère important à évaluer au cours du processus de différenciation. La cryosection des organoïdes et l’immunostaining supplémentaire des tranches d’organoïdes avec un ensemble spécifique d’anticorps permettent la visualisation spatiale des marqueurs moléculaires pour analyser la prolifération cellulaire, la différenciation, l’identité de la population cellulaire et l’apoptose. Avec ce protocole, par cryosections organoïdes immunostaining, un engagement neuronal efficace initial est observé par le7ème jour de différenciation. Au cours de la différenciation, plusieurs populations cellulaires avec l’identité cérebelaire sont observées. Après 35 jours dans ce système dynamique, le neuroépithélium cérébellaire s’organise le long d’un axe apicobasal, avec une couche apicale de progéniteurs proliférants et de neurones postmitotiques basally situés. Au cours du processus de maturation, à partir des jours 35 à 90 de différenciation, des types distincts de neurones cérébellaires peuvent être vus, y compris les cellules Purkinje (Calbindin+), les cellules de granule (PAX6+/MAP2+), les cellules Golgi (Neurogranin+), les cellules de brosse unipolaires (TBR2+), et les neurones profonds de projection de noyaux cérébraux (TBR1+). En outre, une quantité non significative de mort cellulaire est observée dans les organoïdes cérébellaires générés après 90 jours dans la culture.
Dans ce système, les organoïdes humains dérivés de l’iPSC mûrissent en différents neurones cérébellaires et survivent jusqu’à 3 mois sans avoir besoin de dissociation et de coculture de mangeoire, fournissant une source de neurones cérebelaires humains pour la modélisation des maladies.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Le cervelet joue un rôle critique dans le maintien de l’équilibre et de la coordination motrice, et un défaut fonctionnel dans différents neurones cérébellaires peut déclencher un dysfonctionnement cérébelleux. La plupart des connaissances actuelles sur les phénotypes neuronaux liés à la maladie sont basées sur des tissus post mortem, ce qui rend difficile la compréhension de la progression et du développement de la maladie. Des modèles animaux et des lignées cellulaires immortalisées ont également été utilisés comme modèles pour les troubles neurodégénératifs. Cependant, ils ne récapitulent pas complètement la maladie humaine. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (iPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation des maladies et fournissent une source précieuse pour les approches régénératrices. Ces dernières années, la génération d’organoïdes cérébraux à partir d’iPSC dérivés du patient a amélioré les perspectives de modélisation des maladies neurodégénératives. Cependant, les protocoles qui produisent un grand nombre d’organoïdes et un rendement élevé de neurones matures dans les systèmes de culture 3D font défaut. Le protocole présenté est une nouvelle approche pour la production reproductible et évolutive d’organoïdes humains dérivés de l’iPSC dans des conditions chimiquement définies à l’aide de bioréacteurs évolutifs à usage unique, dans lesquels les organoïdes acquièrent l’identité cétebelaire. Les organoïdes générés sont caractérisés par l’expression de marqueurs spécifiques à la fois au niveau de l’ARNm et des protéines. L’analyse de groupes spécifiques de protéines permet la détection de différentes populations de cellules cérebelaires, dont la localisation est importante pour l’évaluation de la structure organoïde. La cryosection organoïde et l’immunostaining supplémentaire des tranches organoïdes sont utilisés pour évaluer la présence de populations spécifiques de cellules cérebelaires et leur organisation spatiale.

Le protocole a été initié en favorisant l’agrégation cellulaire à l’aide des bioréacteurs de 0,1 L (figure 1A). L’inoculation à cellule unique des iPSC a été effectuée, avec 250 000 cellules/mL ensemencées dans 60 mL de milieu avec une vitesse d’agitation de 27 tr/min. Cela a été défini comme le jour 0. Après 24 h, les cellules ont formé efficacement des agrégats en forme de sphéroïde (jour 1, figure 1B),et la morphologie a été bien ...

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Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Ce protocole décrit un système de culture dynamique pour produire des agrégats de taille contrôlée des cellules souches pluripotentes humaines et stimuler davantage la différenciation des organoïdes cérébellaires dans des conditions chimiquement définies et sans alimentation à l’aide d’un bioréacteur à usage unique.

Génération évolutive d’Organoïdes cérébellaires matures à partir de cellules souches pluripotentes humaines et caractérisation par immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Nous présentons pour la première fois une nouvelle approche pour la génération reproductible et évolutive, des cellules IPS dérivées aux organoïdes cerebellar, et une condition chimique définie, utilisant des bioréacteurs à usage unique. Pour obtenir des cellules pour l’ensemencement du bioré réacteur, ajouter un millilitre de milieu de détachement cellulaire, à chaque puits d’une plaque de six puits d’iPSC humain. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant sept minutes, jusqu’à ce que de douces secousses détachent facilement les cellules du puits.À l’aide d’une micropipette P 1000, pipet le milieu de détachement cellulaire, de haut en bas, jusqu’à ce que les cellules se dissocient en cellules simples. Ensuite, ajouter deux millilitres, de milieu de culture cellulaire complète à chaque puits, cela inactive la digestion enzymatique. Ensuite, utilisez la pipette, pour transférer doucement les cellules dans un tube conique stérile.Centrifuger le tube à 210 fois la gravité pendant trois minutes. Retirer le supernatant et suspendre à nouveau la pastille cellulaire dans le milieu de culture. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et essayez le colorant bleu.Voyez le vaisseau bioréacteur avec l’iPSC, à une densité de 250 000 cellules par millilitre. Insérez le récipient bioréacteur, dans l’unité de base universelle, dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 95% d’humidité et 5% de dioxyde de carbone. Pour favoriser l’agrégation iPSC, réglez le taux d’agitation de l’unité de contrôle de base à 27 RPM.Le premier jour, le jour zéro étant le jour de l’ensemencement du bioréacteur, placez le bioréacteur et l’unité de base dans un capot d’écoulement stérile, puis utilisez une pipette sérologique, pour recueillir un échantillon d’un millilitre, de la suspension cellulaire. Plaquez la suspension cellulaire dans un attachement ultra faible, 24 plaque de puits. Utilisez un microscope pour confirmer que des agrégats dérivés de l’iPSC se sont formés.Si c’est le cas, capturer des images des agrégats à 40 X ou 100 X.Continuer à faire la culture de l’iPSC et le bioréacteur, jusqu’à ce que le diamètre moyen des agrégats, est de 100 micromètres, puis remplacer 80% du milieu, par MT01 frais sans inhibiteur de la roche. Lorsque les agrégats atteignent 200 à 250 micromètres de diamètre, laissez tous les organoïdes s’installer, au fond du bioréacteur, puis remplacer tout le milieu usé, par un milieu de différenciation gfCDM. Placez l’unité de base et le bioréacteur dans l’incubateur et diminuez l’agitation à 25 RPM.Après avoir enlevé le supernatant des organoïdes stockés, ajouter un millilitre de 15% saccharose à la pastille, et bien mélanger en tourbillonnant doucement. Après avoir incubé les organoïdes pendant la nuit, à quatre degrés Celsius, retirer la solution de saccharose, puis ajouter un millilitre de saccharose de 15%, 7,5% de gélatine, et mélanger rapidement en tourbillonnant doucement. Alors que les organoïdes couvent à 37 degrés Celsius remplir un récipient en plastique à mi-chemin avec le saccharose 15%7,5% solution gélatine, et lui permettre de se solidifier.Après l’incubation des organoïdes depuis une heure, utilisez une pipette Pasteur, pour placer une goutte du mélange organoïde de gélatine saccharose, sur le saccharose solidifié et la gélatine. Après avoir attendu 15 minutes pour que la goutte se solidifie, remplissez le reste du contenant en plastique, avec plus de 15% de saccharose, 7,5% de gélatine, laissez-le se solidifier complètement à température ambiante, puis l’incuber pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Couper la gélatine en cube, avec les organoïdes au centre, fixer le cube à un morceau de carton, avec une goutte de composé OCT, puis placé 250 millilitres d’Isopentane, dans une tasse de 500 millilitres, remplir un récipient approprié, avec de l’azote liquide.À l’aide de forceps et de gants épais, placer soigneusement la tasse d’Isopentane, à la surface de l’azote liquide. L’isopentane et les azotes liquides sont des réédités dangereux. L’utilisation de ces deux reagents nécessite un équipement de protection individuelle, y compris des gants épais et une ventilation adéquate.Lorsque l’Isopentane, refroidi à 80 degrés Celsius négatif, placer le cube de gélatine dans l’Isopentane jusqu’à ce qu’il gèle. Un cube bien congelé, produit un son métallique lorsqu’il est légèrement tapé avec des forceps, indiquant qu’il est prêt à être stocké. Laver les diapositives au microscope contenant les sections organoïdes, avec 50 millilitres 1X PBS pendant cinq minutes, puis transférer les diapositives dans un bocal Coplin, contenant 1X PBS frais.Transférer les diapositives dans un bocal Coplin, contenant 50 millilitres de glycine fraîchement préparée et incuber pendant 10 minutes à température ambiante, puis transférer les glissières dans un bocal Coplin, contenant 50 millilitres de 0,1%Triton, et perméabilisé pendant 10 minutes à température ambiante. Lavez les diapositives deux fois avec 1X PBS, pendant cinq minutes à chaque fois. Préparer le plat immunostaining, avec du papier de trois millimètres, trempé dans 1X PBS.Séchez les glissières avec un tissu tout autour des tranches et placez-les sur le papier de trois millimètres. À l’abri d’une pipette Pasteur, couvrir chaque glissière de 0,5 millilitres de solution de blocage. Après avoir couver pendant 30 minutes à température ambiante, enlever l’excès de solution de blocage et conduire les glissières avec un tissu, tout autour des tranches.Placez 50 microlitres d’anticorps primaires dilués sur chaque glissière et couvrez-les de glissements de couvercle. Lacez les diapositives, dans le plat immunostaining précédemment préparé, et incubez-les à quatre degrés Celsius. Après l’incubation pendant la nuit, transférer les glissières dans un bocal Coplin, avec 50 millilitres de TBST, laisser tomber le couvercle, puis laver les glissières trois fois avec tbst, pendant cinq minutes à chaque fois.Placer 50 microlitres, d’anticorps secondaires dilués sur chaque glissière, et couvrir avec les feuillets de couverture. Placer les diapositives, dans le plat immunostaining préalablement préparé, incuber pendant 30 minutes à température ambiante, à l’abri de la lumière. Transférez les diapositives dans un bocal Coplin à nouveau, et lavez-les trois fois avec 50 millilitres de TBST, pendant cinq minutes à chaque fois.À l’aide d’une pipette Pasteur, à 0,5 millilitres de solution dappy, sur toute la surface de chaque toboggan et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Après 24 heures dans le bioréacteur, les agrégats en forme de sphéroïde formés efficacement par l’iPSC. La morphologie a été bien maintenue jusqu’au cinquième jour, avec une augmentation graduelle de la taille.Démontrer un haut degré d’homogénéité. Une analyse quantitative par microscopie, a également indiqué la distribution normale, des tailles d’agrégat par jour un, et les deux lignes cellulaires ont atteint la taille optimale d’agrégat par jour deux. Après que le diamètre global désiré ait été réalisé, l’engagement neuronal a été induit, et puis la génération, de différents progéniteurs cerebellar a été favorisée.Pendant la différenciation organoïdes, ont montré une épithélialisation plus prononcée semblable aux structures tube-like neurales avec l’espace luminal. En outre, la distribution de diamètre organoïde, était homogène pendant l’engagement cerebellar initial jusqu’au jour 14. L’analyse d’immunofluorescence soutient qu’un engagement neuronal efficace, des organoïdes dérivés d’iPSC, est déjà réalisé, au septième jour de différenciation.L’immunostaining a également démontré, engagement cerebellar efficace et maturation efficace des organoïdes cerebellar. En outre, après 80 jours dans le bioréacteur, la coloration morte vivante des organoïdes a montré la viabilité élevée de cellules, et aucune évidence des secteurs nécrotiques. Cette technique représente un outil important, pour l’étude des voies pathologiques, impliqué dans la dégénérescence du cerebellar observée dans et pour évaluer l’effet thérapeutique de nouveaux médicaments.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Génération efficace et l’édition de CISP exempte d’engraissement de cellules pancréatiques humaines en utilisant le système CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Détection d’endotoxines dans les Nano-formulations utilisant la Limulus Amébocytes Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolement des fibroblastes dermiques humains adultes de la peau abdominale et génération de cellules souches pluripotentes induites à l'aide d'une méthode de non-intégration

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Différenciation guidée des podocytes rénaux matures à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme dans des conditions chimiquement définies

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tissu conjonctif humain dérivé de fibroblastes pour les applications de dépistage

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...