Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 durch Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 an T.P.S und PD/BD/128376/2017 an D.E.S.N.), von FEDER kofinanzierte Projekte (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) und FCT durch Gewährung PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 und CEREBEX Generation of Cerebellar Organoids for Ataxia Research grant LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Außerdem wurden Mittel aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Grant Agreement-Nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017 bereitgestellt.

1. Passage und Aufrechterhaltung menschlicher iPSCs in der Monolayer-Kultur
<ol><li>Herstellung von Platten<ol>
<li>Die Kellermembranmatrix (siehe Materialtabelle)bei 4 °C auftauen und 60 L-Aliquots vorbereiten. Einfrieren der Aliquots bei -20 °C.</li>
		<li>Um die Brunnen einer 6-Well-Platte zu beschichten, tauen Sie ein Aliquot der Kellermembranmatrix auf Eis auf. Nach dem Auftauen 60 l zu 6 ml DMEM-F12 hinzufügen. Durch Pipettieren nach oben und unten.</li>
		<li>Fügen Sie 1 ml verdünnte Keller...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. 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Der Bedarf an großen Zellzahlen sowie definierten Kulturbedingungen zur Generierung spezifischer Zelltypen für Arzneimittelscreenings und regenerative Medizinanwendungen hat die Entwicklung skalierbarer Kultursysteme vorangetrieben. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen die skalierbare Generation von neuronalen Vorläufern und funktionellen Neuronen32,33,34berichtet, was signifikante Fortschritte bei der Entwicklung neue...

Die Entstehung menschlicher pluripotenter Stammzellen (PSCs) stellt ein ausgezeichnetes Werkzeug für die regenerative Medizin und Krankheitsmodellierung dar, da diese Zellen in die meisten Zelllinien des menschlichenKörpers1,2unterschieden werden können. Seit ihrer Entdeckung wurde berichtet, dass die PSC-Differenzierung mit verschiedenen Ansätzen verschiedene Krankheiten modelliert, einschließlich neurodegenerativer Erkrankungen3,4,5,6.
Kürzlich gab es Berichte über 3D-Kulturen, die von PSCs abgeleitet wurden, die menschlichen zerebralen Strukturen ähneln; Diese werden Gehirnorganoide3,7,8genannt. Die Erzeugung dieser Strukturen aus gesunden und patientenspezifischen PSCs bietet eine wertvolle Gelegenheit, menschliche Entwicklung und neuroentwicklungsbezogene Störungen zu modellieren. Die Methoden zur Erzeugung dieser gut organisierten Zerebralparese sind jedoch für ihre Großproduktion nur schwer anzuwenden. Um Strukturen zu erzeugen, die groß genug sind, um die Gewebemorphogenese ohne Nekrose innerhalb der Organoide zu rekapitulieren, stützen sich Protokolle auf die anfängliche neuronale Verpflichtung unter statischen Bedingungen, gefolgt von der Verkapselung in Hydrogelen und der nachfolgenden Kultur in dynamischen Systemen3. Solche Ansätze können jedoch den potenziellen Scale-up der organoiden Produktion einschränken. Obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um die PSC-Differenzierung auf bestimmte Regionen des zentralen Nervensystems zu lenken, einschließlich kortikaler, striataler, Mittelhirn- und Rückenmarksneuronen9,10,11,12, ist die Erzeugung spezifischer Hirnregionen unter dynamischen Bedingungen immer noch eine Herausforderung. Insbesondere die Erzeugung von reifen Kleinhirnneuronen in 3D-Strukturen muss noch beschrieben werden. Muguruma et al. leisteten Pionierarbeit bei der Erzeugung von Kulturbedingungen, die die frühe Kleinhirnentwicklung13 rekapitulieren, und berichteten kürzlich über ein Protokoll, das es menschlichen embryonalen Stammzellen ermöglicht, eine polarisierte Struktur zu erzeugen, die an das erste Trimester-Kleinhirn7erinnert. Die Reifung von Kleinhirnneuronen in den gemeldeten Studien erfordert jedoch die Dissoziation der Organoide, die Sortierung von Kleinhirnvorläufern und die Kokultur mit Feederzellen in einem monolayern Kultursystem7,14,15,16. Daher ist die reproduzierbare Erzeugung der gewünschten Kleinhirn-Organoide zur Krankheitsmodellierung unter definierten Bedingungen immer noch eine Herausforderung, die mit der Variabilität der Kultur- und Feederquelle verbunden ist.
Dieses Protokoll stellt optimale Kulturbedingungen für die 3D-Erweiterung und die effiziente Differenzierung menschlicher PSCs in Kleinhirnneuronen mithilfe von einwegvertikalen Radbioreaktoren dar (siehe Materialtabelle für Spezifikationen), im Folgenden Bioreaktoren genannt. Bioreaktoren sind mit einem großen vertikalen Laufrad ausgestattet, das in Kombination mit einem U-förmigen Boden eine homogenere Scherverteilung im Inneren des Gefäßes ermöglicht und eine schonende, gleichmäßige Mischung und Partikelaufhängung mit reduzierten Rührgeschwindigkeiten17ermöglicht. Mit diesem System können Form- und größengesteuerte Zellaggregate gewonnen werden, was für eine homogenere und effizientere Differenzierung wichtig ist. Darüber hinaus kann eine größere Anzahl von iPSC-abgeleiteten Organoiden auf weniger mühsame Weise erzeugt werden.
Das Hauptmerkmal der Organoide, die 3D-Multizellstrukturen sind, die normalerweise aus Stammzellen gebildet werden, ist die Selbstorganisation verschiedener Zelltypen, die spezifische Formen bilden, wie sie bei der menschlichen Morphogenese18,19,20zu sehen sind. Daher ist die organoide Morphologie ein wichtiges Kriterium, das während des Differenzierungsprozesses bewertet werden muss. Die Kryosektion von Organoiden und die weitere Immunfärbung von Organoidscheiben mit einem bestimmten Satz von Antikörpern ermöglichen die räumliche Visualisierung molekularer Marker zur Analyse der Zellproliferation, Differenzierung, Zellpopulationsidentität und Apoptose. Mit diesem Protokoll wird durch immunstainierende organoide Kryosektionen eine anfängliche effiziente neuronale Bindung am7. Tag der Differenzierung beobachtet. Während der Differenzierung werden mehrere Zellpopulationen mit Kleinhirnidentität beobachtet. Nach 35 Tagen in diesem dynamischen System organisiert sich das Kleinhirn-Neuroepithel entlang einer apicobasalen Achse, mit einer apikalen Schicht aus sich ausbreitenden Vorläufern und basal gelegenen postmitotischen Neuronen. Während des Reifungsprozesses sind ab den Tagen 35 bis 90 der Differenzierung verschiedene Arten von Kleinhirnneuronen zu sehen, einschließlich Purkinje-Zellen (Calbindin+), Granulatzellen (PAX6+/MAP2+), Golgi-Zellen (Neurogranin+), unipolare Pinselzellen (TBR2+) und tiefe Kleinhirn-Nuklei-Projektionsneuronen (TBR1+). Auch wird eine nicht signifikante Menge des Zelltodes in den erzeugten Kleinhirn-Organoiden nach 90 Tagen in der Kultur beobachtet.
In diesem System reifen menschliche iPSC-abgeleitete Organoide zu verschiedenen Kleinhirnneuronen und überleben bis zu 3 Monate ohne die Notwendigkeit einer Dissoziation und Feeder-Cokultur, die eine Quelle menschlicher Kleinhirnneuronen für die Krankheitsmodellierung bietet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Das Kleinhirn spielt eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung des Gleichgewichts und der motorischen Koordination, und ein funktioneller Defekt in verschiedenen Kleinhirnneuronen kann eine Hirnfallfunktionsstörung auslösen. Der größte Teil des aktuellen Wissens über krankheitsbedingte neuronale Phänotypen basiert auf postmortalen Geweben, was das Verständnis von Krankheitsprogression und Entwicklung erschwert. Tiermodelle und verewigte Zelllinien wurden auch als Modelle für neurodegenerative Erkrankungen verwendet. Sie rekapitulieren jedoch nicht vollständig menschliche Krankheiten. Humaninduzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) haben ein großes Potenzial für die Krankheitsmodellierung und bieten eine wertvolle Quelle für regenerative Ansätze. In den letzten Jahren verbesserte die Erzeugung von zerebralen Organoiden aus patientenabgeleiteten iPSCs die Aussichten für die Modellierung neurodegenerativer Erkrankungen. Es fehlen jedoch Protokolle, die eine große Anzahl von Organoiden und eine hohe Ausbeute an ausgereiften Neuronen in 3D-Kultursystemen produzieren. Das vorgestellte Protokoll ist ein neuer Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Organoiden unter chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung skalierbarer Einweg-Bioreaktoren, bei denen Organoide die Kleinhirnidentität erlangen. Die erzeugten Organoide zeichnen sich durch die Expression spezifischer Marker sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene aus. Die Analyse spezifischer Gruppen von Proteinen ermöglicht den Nachweis verschiedener Kleinhirnzellpopulationen, deren Lokalisierung für die Bewertung der organoiden Struktur wichtig ist. Organoide Kryosektionen und weitere Immunostainierung von Organoidscheiben werden verwendet, um das Vorhandensein spezifischer Kleinhirnzellpopulationen und ihre räumliche Organisation zu bewerten.

Das Protokoll wurde durch Förderung der Zellaggregation mit den 0,1 L-Bioreaktoren initiiert (Abbildung 1A). Die Einzelzellimpfung der iPSCs wurde durchgeführt, wobei 250.000 Zellen/ml in 60 ml Medium mit einer Rührgeschwindigkeit von 27 R/min gesät wurden. Dies wurde als Tag 0 definiert. Nach 24 h bildeten die Zellen effizient sphäroidförmige Aggregate (Tag 1, Abbildung 1B), und die Morphologie war bis Tag 5 gut erhalten, mit einer allmählichen Vergröß...

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Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Dieses Protokoll beschreibt ein dynamisches Kultursystem zur Herstellung kontrollierter Größenaggregate menschlicher pluripotenter Stammzellen und zur weiteren Stimulierung der Differenzierung in Kleinhirnorganoiden unter chemisch definierten und feederfreien Bedingungen mit einem Einweg-Bioreaktor.

Skalierbare Generierung von reifen Zerebellar-Organoiden aus humanen pluripotenten Stammzellen und Charakterisierung durch Immunostainierung

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Wir präsentieren zum ersten Mal einen neuen Ansatz für die reproduzierbare und skalierbare Erzeugung von IPS-Zellen, die bei Cerebellar Organoiden abgeleitet wurden, und eine chemisch definierte Bedingungen, die Single-Use-Bioreaktoren verwenden. Um Zellen für die Aussaat des Bioreaktors zu erhalten, fügen Sie einen Milliliter Zellablösungsmedium zu jedem Brunnen einer sechs Brunnenplatte menschlicher iPSC hinzu. Inkubieren Sie die Platte sieben Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bis sanftes Schütteln die Zellen leicht vom Brunnen löst.Mit einer P 1000-Mikropipette, pipet das Zellablösungsmedium nach oben und unten, bis sich die Zellen in einzelne Zellen auflösen. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter, von kompletten Zellkultur Medium zu jedem Brunnen, dies wird die enzymatische Verdauung inaktivieren. Dann verwenden Sie die Pipette, um die Zellen vorsichtig in ein steriles konisches Rohr zu übertragen.Zentrifugieren Sie das Rohr mit 210-facher Schwerkraft für drei Minuten. Entfernen Sie den Überstand, und setzen Sie das Zellpellet im Kulturmedium wieder auf. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypan-Blaufarbstoff.Siehe den Bioreaktorbehälter mit dem iPSC mit einer Dichte von 250 000 Zellen pro Milliliter. Setzen Sie den Bioreaktorbehälter in die Universal Base Unit in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 95 % Luftfeuchtigkeit und 5 % Kohlendioxid ein. Um die iPSC-Aggregation zu fördern, legen Sie die Rührrate der Basissteuereinheit auf 27 RPM fest.Am ersten Tag, wobei Tag Null der Tag der Aussaat des Bioreaktors ist, legen Sie den Bioreaktor und die Basiseinheit in eine sterile Durchflusshaube, verwenden Sie dann eine serologische Pipette, um eine Ein-Milliliter-Probe der Zellsuspension zu sammeln. Die Zellaufhängung in einem ultraniedrigen Aufsatz, 24 Well-Platte. Verwenden Sie ein Mikroskop, um zu bestätigen, dass sich von iPSC abgeleitete Aggregate gebildet haben.Wenn ja, erfassen Sie Bilder der Aggregate bei 40 X oder 100 X. Fahren Sie fort, die iPSC und den Bioreaktor zu kultivieren, bis der durchschnittliche Durchmesser der Aggregate 100 Mikrometer beträgt, und ersetzen Sie dann 80 % des Mediums durch frisches MT01 ohne Gesteinshemmer. Wenn die Aggregate, erreichen 200 bis 250 Mikrometer im Durchmesser, lassen Sie alle Organoide setzen, an der Unterseite des Bioreaktors, dann ersetzen Sie alle verbrauchten Medium, mit gfCDM Differenzierung szenieren Medium. Legen Sie die Basiseinheit und den Bioreaktor in den Inkubator und verringern Sie die Rührung auf 25 Umdrehungen pro Minute.Nach dem Entfernen des Überstandes aus den gespeicherten Organoiden, fügen Sie einen Milliliter 15%Saccharose in das Pellet, und mischen Sie gut durch Wirbeln sanft. Nach dem Inkubieren der Organoide über Nacht, bei vier Grad Celsius, entfernen Sie die Saccharoselösung, fügen Sie dann einen Milliliter 15%Saccharose, 7,5% Gelatine hinzu und mischen Sie schnell durch sanftes Wirbeln. Während die Organoide bei 37 Grad Celsius inkubieren, füllen Sie einen Kunststoffbehälter auf halbem Weg mit der 15%Saccharose 7,5%Gelatinelösung, und lassen Sie es verfestigen.Nachdem die Organoide eine Stunde lang inkubiert haben, verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um einen Tropfen der organoiden Saccharose-Gelatine-Mischung auf die erstarrte Saccharose und Gelatine zu legen. Nachdem Sie 15 Minuten gewartet haben, bis sich der Tropfen erstarrt, füllen Sie den Rest des Kunststoffbehälters mit mehr 15%Saccharose, 7,5% Gelatine, lassen Sie es vollständig bei Raumtemperatur erstarren und dann für 20 Minuten bei vier Grad Celsius inkubieren. Schneiden Sie die Gelatine in einen Würfel, mit den Organoiden in der Mitte, fixieren Sie den Würfel auf ein Stück Pappe, mit einem Tropfen OCT-Verbindung, dann platziert 250 Milliliter Isopentan, in einem 500 Milliliter Tasse, füllen Sie einen entsprechenden Behälter, mit flüssigem Stickstoff.Mit Zangen und dicken Handschuhen, legen Sie vorsichtig die Tasse Isopentane, auf der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs. Isopentan und flüssige Stickstoffe sind gefährliche Reagenzien. Die Verwendung dieser beiden Reagenzien erfordert persönliche Schutzausrüstung, einschließlich dicker Handschuhe und eine ausreichende Belüftung.Wenn das Isopentane auf negative 80 Grad Celsius abgekühlt ist, legen Sie den Gelatinewürfel in das Isopentane, bis er gefriert. Ein gut gefrorener Würfel erzeugt einen metallischen Klang, wenn er leicht mit Zangen angezapft wird, was darauf hinweist, dass er lagerbereit ist. Waschen Sie die Mikroskopschlitten mit den organoiden Abschnitten, mit 50 Milliliter nX PBS für fünf Minuten, dann übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das frische 1X PBS enthält.Übertragen Sie die Dias in ein Coplin-Glas, das 50 Milliliter frisch zubereitetes Glycin enthält und 10 Minuten bei Raumtemperatur brütet, und übertragen Sie die Dias dann in ein Coplin-Glas, das 50 Milliliter 0,1%Triton enthält und 10 Minuten bei Raumtemperatur durchlässig ist. Waschen Sie die Dias zweimal mit 1X PBS, jeweils fünf Minuten lang. Bereiten Sie die Immunostaining Schale, mit drei Millimeter Papier, in 1X PBS getränkt.Trocknen Sie die Dias mit einem Gewebe um die Scheiben herum und legen Sie sie auf das Drei-Millimeter-Papier. Mit einer Pasteur Pipette, decken Sie jeden Schlitten mit 0,5 Milliliter Blockierlösung. Nach der Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur, entfernen Sie überschüssige Blocklösung und fahren Sie die Dias mit einem Gewebe, rund um die Scheiben.Legen Sie 50 Mikroliter verdünnten Primärantikörper auf jeden Schlitten und bedecken Sie sie mit Deckelscheinen. Die Rutschen in der zuvor vorbereiteten Immunostaining-Schale schnüren und bei vier Grad Celsius bebrüten. Nach der nächtlichen Inkubation die Dias in ein Coplin-Glas mit 50 MilliliterN TBST übertragen, die Deckelrutschen abfallen lassen und dann die Dias dreimal mit TBST waschen, jeweils fünf Minuten lang.Legen Sie 50 Mikroliter, von verdünntem Sekundärantikörper auf jedem Dia, und decken Sie mit den Abdeckungsscheinen ab. Legen Sie die Dias, in die zuvor vorbereitete Immunostaining Schale, inkubieren für 30 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Die Dias wieder in ein Coplin-Glas geben und dreimal mit 50 Millilitern TBST für jeweils fünf Minuten waschen.Mit einer Pasteur Pipette, bei 0,5 Milliliter Dappy-Lösung, über die gesamte Oberfläche jedes Schlittens und inkubieren für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach 24 Stunden im Bioreaktor bilden die effizient geformten sphäroidförmigen Aggregate von iPSC. Die Morphologie war bis zum fünften Tag gut gepflegt, mit einer allmählichen Zunahme der Größe.Nachweis eines hohen Grades an Homogenität. Eine quantitative Analyse mittels Mikroskopie ergab auch eine Normalverteilung der Aggregatgrößen am ersten Tag, und beide Zelllinien erreichten die optimale Aggregatgröße am zweiten Tag. Nachdem der gewünschte Aggregatdurchmesser erreicht wurde, wurde die neuronale Verpflichtung induziert, und dann wurde die Erzeugung verschiedener Kleinhirnvorläufer gefördert.Während der Differenzierung zeigten Organoide eine ausgeprägtere Epithelisierung ähnlich wie neuralröhrenartige Strukturen mit luminalen Raum. Zusätzlich war die Organoid-Durchmesserverteilung während der anfänglichen Kleinhirn-Verpflichtung bis zum 14. Tag homogen. Die Immunfluoreszenzanalyse unterstützt, dass eine effiziente neuronale Bindung der iPSC-abgeleiteten Organoide bereits erreicht ist, bis zum siebten Tag der Differenzierung.Immunostaining zeigte auch, effizientes KleinhirnEngagement und effiziente Reifung von Kleinhirn-Organoiden. Darüber hinaus zeigte die lebende abgestorbene Färbung von Organoiden nach 80 Tagen im Bioreaktor eine hohe Zelllebensfähigkeit und keine Hinweise auf nekrotische Bereiche. Diese Technik stellt ein wichtiges Instrument zur Untersuchung pathologischer Wege dar, die an der Degeneration des Kleinhirns beteiligt sind, die bei der therapeutischen Wirkung neuer Medikamente beobachtet wurde, und für die Bewertung der therapeutischen Wirkung neuer Medikamente.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effiziente Erzeugung und Bearbeitung von Feeder-freie IPSCs aus menschlichen Zellen der Bauchspeicheldrüse mit dem CRISPR-Cas9-System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Wachstum und Charakterisierung der bestrahlten Organoide aus den Brustdrüsen

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolierung von adulten menschlichen Dermal-Fibroblasten aus der Bauchhaut und Generierung induzierter pluripotenter Stammzellen mit einer nicht-integrierenden Methode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Geführte Differenzierung reifer Nierenpodozyten aus human induzierten pluripotenten Stammzellen unter chemisch definierten Bedingungen

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblasten-abgeleitetes Human Engineered Connective Tissue für Screening-Anwendungen

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...