Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), פורטוגל (UIDB/04565/2020 באמצעות Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, פרויקט N. 007317, PD/BD/105773/2014 ל-T.P.S ו-PD/BD/128376/2017 ל-D.E.S.N), פרויקטים במימון שיתוף של FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa פורטוגל 2020) ו-FCT באמצעות מענק PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 ו-CEREBEX Generation של אורגנואידים המוח הקטן למענק מחקר אטקסיה LISBOA-01-0145-FEDER-029298. המימון התקבל גם מתכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי, במסגרת הסכם המענק מספר 739572 – מרכז התגליות לרפואה רגנרטיבית ודיוקה H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. מעבר ותחזוקה של iPSCs אנושיים בתרבות חד שכבתית
<ol><li>הכנת צלחות<ol>
<li>להפשיר את מטריצת קרום המרתף (ראה טבלת חומרים)מניות ב 4 מעלות צלזיוס ולהכין 60 μL aliquots. הקפא את האליציטוטים ב-20 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>כדי לכסות את בארות של צלחת 6 באר, להפשיר aliquot אחד של מטריצת קרום המרתף על קרח. לאחר הפשרת ...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

הצורך במספרי תאים גדולים, כמו גם תנאי תרבות מוגדרים כדי ליצור סוגי תאים ספציפיים עבור סינון תרופות ויישומי רפואה רגנרטיבית כבר נהיגה בפיתוח של מערכות תרבות מדרגית. בשנים האחרונות דיווחו מספר קבוצות על הדור המדרגי של תובנים עצבייםונוירונים פונקציונליים 32,33</sup...

הופעתם של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים (PSCs) מייצגת כלי מצוין לרפואה רגנרטיבית ומידול מחלות, כי תאים אלה יכולים להיות מובדילים לתוך רוב תוחוני התא של גוףהאדם 1,,2. מאז הגילוי שלהם, פידול PSC באמצעות גישות מגוונות דווח המודל מחלות שונות, כולל הפרעות ניווניות3,,4,,5,6.
לאחרונה, היו דיווחים על תרבויות 3D נגזר PSCs דומה מבנים מוחיים אנושיים; אלה נקראים אורגנואידים במוח3,,7,,8. הדור של מבנים אלה הן PSCs בריא וסבלני מספק הזדמנות רבת ערך כדי מודל התפתחות אנושית והפרעות נוירו-התפתחותיות. עם זאת, השיטות המשמשות ליצירת מבנים מוחיים מאורגנים היטב אלה קשה להגיש בקשה לייצור בקנה מידה גדול שלהם. כדי לייצר מבנים גדולים מספיק כדי לתמצת מורפוגנזה רקמה ללא נמק בתוך organoids, פרוטוקולים להסתמך על המחויבות העצבית הראשונית בתנאים סטטיים, ואחריו אנקפולציה הידרוג'לים ותרבות עוקבותבמערכות דינמיות 3. עם זאת, גישות כאלה עשויות להגביל את קנה המידה הפוטנציאלי של ייצור אורגנואידים. למרות נעשו מאמצים לכוון את בידול PSC לאזורים מסוימים של מערכת העצבים המרכזית, כולל קליפת המוח, סטריאטל, המוח האמצעי, ונוירונים חוט השדרה9,10,11,12, הדור של אזורי מוח ספציפיים בתנאים דינמיים הוא עדיין אתגר. בפרט, הדור של נוירונים המוח הקטן בוגר במבנים 3D עדיין לא תואר. Muguruma ואח '. חלוץ הדור של תנאי תרבות כי סיכוםמוקדם המוח הקטן פיתוח 13 ולאחרונה דיווח פרוטוקול המאפשר לתאי גזע עובריים אנושיים ליצור מבנה מקוטב המזכיר את המוח הקטן של השלישהראשון 7. עם זאת, התבגרות של נוירונים המוח הקטן במחקרים שדווחו דורש תנתק של אורגנואידים, מיון של נבונות המוח הקטן, וcoculture עם תאי ההזנהבמערכת תרבות מונו-שכבתית 7,14,15,16. לכן, הדור הניתן לשחזור של אורגנואידים המוח הקטן הרצוי עבור מידול מחלות בתנאים מוגדרים הוא עדיין אתגר הקשורים תרבות ושונות מקור מאכיל.
פרוטוקול זה מציג תנאי תרבות אופטימליים להרחבת תלת-מיתד ובידול יעיל של PSCs אנושיים לנוירונים המוחליים באמצעות ביו-סיבה של גלגל אנכי חד-ספרתי (ראה טבלת חומרים למפרטים), הנקראים להלן ביו-כואבי החיים. ביו-גורם מצוידים במדחף אנכי גדול, אשר בשילוב עם תחתית בצורת U, לספק התפלגות גייה הומוגנית יותר בתוך כלי השיט, המאפשר עדין, ערבוב אחיד ומתלי חלקיקים עם מהירויות תסיסהמופחתת 17. עם מערכת זו, ניתן להשיג אגרגטים של תאים הנשלטים על-ידי צורה וגודל, דבר שחשוב להבדיל הומוגני ויעיל יותר. יתר על כן, מספר גדול יותר של אורגנואידים נגזר iPSC ניתן ליצור באופן פחות מייגע.
התכונה העיקרית של organoids, שהם מבנים רב תאיים 3D בדרך כלל נוצר מתאי גזע, הוא ארגון עצמי של סוגי תאים שונים שיוצרים צורות ספציפיות כמו אלה לראות מורפוגנזהאנושית 18,,19,20. לכן, מורפולוגיה אורגנואידית היא קריטריון חשוב שיש להעריך במהלך תהליך ההבחנה. Cryosectioning של אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד עם קבוצה ספציפית של נוגדנים לאפשר הדמיה מרחבית של סמנים מולקולריים לנתח התפשטות תאים, בידול, זהות אוכלוסיית התא, אפופטוזיס. עם פרוטוקול זה, על ידי קריוסות אורגנואידים חיסוניות, מחויבות עצבית יעילה ראשונית נצפתה על ידי היוםה-7 של בידול. במהלך בידול, מספר אוכלוסיות תאים עם זהות המוח הקטן נצפו. לאחר 35 ימים במערכת דינמית זו, neuroepithelium המוח הקטן מארגן לאורך ציר apicobasal, עם שכבה apical של פרוגניטורים משגשגים ונוירונים פוסט מיתוטיים הממוקמים בהתבססות. במהלך תהליך ההתבגרות, מימים 35-90 של בידול, ניתן לראות סוגים שונים של נוירונים המוח הקטן, כולל תאי Purkinje (קלבינדין+), תאי גרגר (PAX6+/ MAP2+), תאי גולגי (Neurogranin+ ),תאי מברשת חד קוטביים (TBR2+), ונוירונים הקרנת גרעין המוח הקטן עמוק (TBR1+). כמו כן, כמות לא משמעותית של מוות תאים נצפתה באורגנואידים המוח הקטן שנוצר לאחר 90 ימים בתרבות.
במערכת זו, אורגנואידים הנגזרים על-ידי IPSC אנושיים מתבגרים לנוירונים המוח שונים ושורדים עד 3 חודשים ללא צורך בתחוך ומזון coculture, מתן מקור של נוירונים המוח הקטן האנושי עבור מידול מחלות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

המוח הקטן ממלא תפקיד קריטי בתחזוקה של איזון וקואורדינציה מוטורית, פגם תפקודי בנוירונים המוח שונים יכול לעורר תפקוד המוח הקטן. רוב הידע הנוכחי על פנוטיפים עצביים הקשורים למחלות מבוסס על רקמות שלאחר המוות, מה שהופך את ההבנה של התקדמות המחלה ופיתוח קשה. מודלים של בעלי חיים וקווי תאים מונצחים שימשו גם כמודלים להפרעות ניווניות. עם זאת, הם אינם לגמרי לסיכום מחלות אנושיות. תאי גזע פלורופוטנטיים המושרה על ידי בני אדם (iPSCs) יש פוטנציאל גדול עבור מידול מחלות ולספק מקור יקר ערך עבור גישות רגנרטיביות. בשנים האחרונות, הדור של אורגנואידים מוחיים מ-iPSCs הנגזרים ממטופל שיפר את הסיכויים למודלים של מחלות ניווניות. עם זאת, פרוטוקולים המייצרים מספר גדול של אורגנואידים ותשואה גבוהה של נוירונים בוגרים במערכות תרבות 3D חסרים. הפרוטוקול שהוצג הוא גישה חדשה לדור רפרודוק ומדרגי של אורגנואידים אנושיים הנגזרים מ-iPSC בתנאים המוגדרים כימית באמצעות ביו-כוערים חד-פעמיות מדרגיים, שבהם אורגנואידים רוכשים זהות מוחית. האורבנואידים שנוצרו מאופיינים בביטוי של סמנים ספציפיים הן ברמת mRNA והן ברמת החלבון. הניתוח של קבוצות ספציפיות של חלבונים מאפשר זיהוי של אוכלוסיות שונות של תאים המוח הקטן, אשר התיור חשוב להערכת מבנה אורגנואיד. cryosectioning אורגנואידים וחיסונים נוספים של פרוסות אורגנואיד משמשים כדי להעריך את הנוכחות של אוכלוסיות ספציפיות של תאים המוח הקטן והארגון המרחבי שלהם.

הפרוטוקול החל על ידי קידום צבירת תאים באמצעות 0.1 L bioreactors (איור 1A). חסון תא יחיד של iPSCs בוצע, עם 250,000 תאים / מ"ל זרעו ב 60 מ"ל של בינוני עם מהירות תסיסה של 27 סל"ד. זה הוגדר כיהי 0. לאחר 24 שעות, התאים יצרו ביעילות אגרגטים בצורת ספרואיד (יום 1, איור 1B),והמורפולוגיה נשמרה הי...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

אנו מציגים לראשונה, גישה חדשה לדור ניתן לשחזור ומדרגי, של תאי IPS המופקים באורגנואידים מוחיים, ותנאים מוגדרים כימיים, באמצעות ביו-רקטורים חד-משתמשים. כדי להשיג תאים לזרוע את הכור הביולוגי, להוסיף מיליליטר אחד של מדיום ניתוק תאים, לכל באר של צלחת שש באר של iPSC האנושי. דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך שבע דקות, עד רעידות עדינות בקלות מנתק את התאים, מן הטוב.באמצעות מיקרופיפט P 1000, צינור ניתוק התא בינוני, למעלה ולמטה, עד התאים להתנתק לתאים בודדים. הבא להוסיף שני מיליליטר, של תרבות תאים מלאה בינוני לכל באר, זה יהיה להשבית עיכול אנזימטי. ואז להשתמש פיפטה, כדי להעביר בעדינות את התאים לצינור חרוט סטרילי.צנטריפוגה הצינור ב 210 פעמים כבידה במשך שלוש דקות. הסר את supernatant, ולהשעות מחדש את גלולת התא במדיום תרבות. לספור את התאים באמצעות hemocytometer, ו לצבוע כחול trypan.ראה את כלי הביוריאקטור עם iPSC של, בצפיפות של 250, 000 תאים למיליליטר. הכנס את כלי הביו-ריאקטור, ליחידת הבסיס האוניברסלית, באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 95% לחות ו-5% פחמן דו-חמצני. כדי לקדם צבירת iPSC, הגדר את קצב התסיסה של יחידת בקרת הבסיס ל- 27 סל"ד.ביום הראשון, כשהיום האפס הוא היום של זריעת הביו-ריאקטור, מניחים את הביו-ריאקטור, ואת יחידת הבסיס במכסה המנוע של זרימה סטרילית, ואז משתמשים בפיפלטה סרולוגית, כדי לאסוף דגימה של מיליליטר אחד, של ההשעיה של התא. צלחת ההשעיה התא בקובץ מצורף נמוך במיוחד, 24 צלחת גם. השתמש במיקרוסקופ, כדי לאשר כי אגרגטים נגזר iPSC נוצרו.אם כן, ללכוד תמונות של אגרגטים ב 40 X או 100 X.Continue culturing של iPSC ואת bioreactor, עד הקוטר הממוצע של אגרגטים, הוא 100 מיקרומטר, ולאחר מכן להחליף 80% של המדיום, עם MT01 טרי ללא מעכבי סלע. כאשר אגרגטים, להגיע 200 כדי 250 מיקרו מטר קוטר, לתת את כל האורגנואידים להתיישב, בחלק התחתון של bioreactor, ולאחר מכן להחליף את כל המדיום בילה, עם אמצעי הבידול gfCDM. מניחים את יחידת הבסיס ואת הביוריאקטור באינקובטור ולהקטין את התסיסה ל 25 סל"ד.לאחר הסרת העל-טבעי מהאיברואידים המאוחסנים, מוסיפים מיליליטר אחד של 15% סוכרוז לכדור, ומערבבים היטב על-ידי מערבולת עדין. לאחר הדגירה אורגנואידים לילה, בארבע מעלות צלזיוס, להסיר את פתרון סוכרוז, ולאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של 15% סוכרוז, 7.5% ג'לטין, ומערבבים במהירות על ידי מערבולת בעדינות. בעוד האורגנואידים דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למלא מיכל פלסטיק באמצע הדרך עם 15% סוכרוז 7.5% פתרון ג'לטין, ולאפשר לו להתגבש.לאחר האורגנואידים כבר דגירה במשך שעה אחת, להשתמש פיפטה פסטר, כדי למקם טיפה של תערובת ג'לטין סוכרוז אורגנואיד, על גבי סוכרוז מוצק וג'לטין. לאחר המתנה של 15 דקות עד שהירידה תתחזק, מלאו את שאר מיכל הפלסטיק, עם יותר מ-15% סוכרוז, 7.5% ג'לטין, אפשרו לו להתגבש לחלוטין בטמפרטורת החדר ולאחר מכן הדגירה במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. חותכים את הג'לטין לקוביה, עם האורגנואידים במרכז, מתקנים את הקובייה לחתיכת קרטון, עם טיפה של תרכובת OCT, ואז הניחו 250 מיליליטר של Isopentane, ב 500 מיליליטר, למלא מיכל מתאים, עם חנקן נוזלי.באמצעות מדפים וכפפות עבות, מניחים בזהירות את Isopentane, על פני השטח של החנקן הנוזלי. חנקן וחנקן נוזלי, הם רייגנטים מסוכנים. השימוש בשני רייגנטים אלה דורש ציוד מגן אישי, כולל כפפות עבות ואוורור הולם.כאשר Isopentane, התקרר שלילי 80 מעלות צלזיוס, מניחים את קוביית הג'לטין ב Isopentane עד שהוא קופא. קוביה קפואה היטב, מייצרת צליל מתכתי כאשר טפח קלות עם מדפים, המציין כי הוא מוכן לאחסן. לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ המכיל את החלקים organoid, עם 50 מיליליטר 1X PBS במשך חמש דקות, ולאחר מכן להעביר את השקופיות לצנצנת קופלין, המכיל PBS 1X טרי.מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין, המכילה 50 מיליליטר גליצין ודגירה טריים במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ואז מעבירים את המגלשות לצנצנת קופלין, המכילה 50 מיליליטר של 0.1% טריטון, ומחלחלת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף את השקופיות פעמיים עם 1X PBS, במשך חמש דקות בכל פעם. הכינו את המנה לכשל חיסוני, עם נייר של שלושה מילימטרים, ספוגה ב-PBS 1X.מייבשים את השקופיות עם רקמה מסביב לפרוסות ומ מניחים אותן על הנייר של שלושת המילימטרים. עם פיפטה פסטר, לכסות כל שקופית עם 0.5 מיליליטר של פתרון חסימה. לאחר דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, להסיר פתרון חסימה עודף לנהוג שקופיות עם רקמה, סביב הפרוסות.מניחים 50 מיקרוליטרים של נוגדן ראשוני מדולל, על כל שקופית ומכסים אותם עם תלושי כיסוי. תחרה את המגלשות, בצלחת immunostaining שהוכן בעבר, ו דגירה אותם בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה לילה, להעביר את השקופיות לצנצנת קופלין, עם 50 מיליליטר של TBST, לתת את תלושי הכיסוי ליפול, ולאחר מכן לשטוף את השקופיות שלוש פעמים עם TBST, במשך חמש דקות בכל פעם.מניחים 50 מיקרוליטרים, של נוגדן משני מדולל על כל שקופית, ומכסים עם החלקות הכיסוי. מניחים את השקופיות, בצלחת immunostaining שהוכן בעבר, דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. העבר את השקופיות לצנצנת קופלין שוב, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם 50 מיליליטר של TBST, במשך חמש דקות בכל פעם.באמצעות פיפט פסטר, ב 0.5 מיליליטר של פתרון דאפי, על פני כל פני השטח של כל שקופית ודגירה במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר 24 שעות בביו-ריירקטור, אגרגטים בצורת ספרואידים שנוצרו ביעילות על-ידי IPSC. המורפולוגיה הייתה מטופחת עד היום החמישי, עם עלייה הדרגתית בגודלה.הפגנת רמה גבוהה של הומוגניות. ניתוח כמותי של מיקרוסקופיה חשף גם התפלגות תקינה, בגדלים מצטברים לפי יום אחד, ושני קווי התאים הגיעו לגודל המצטבר האופטימלי ביום השני. לאחר שהושג הקוטר המצטבר הרצוי, הושרתה מחויבות עצבית, ולאחר מכן דור, של בני דור שלם שונים קודמו.במהלך אורגנואידים בידול, הראה אפיתליזציה בולטת יותר דומה מבנים דמויי צינור עצבי עם מרחב זוהר. בנוסף, התפלגות קוטר האורגנואידים, הייתה הומוגנית במהלך המחויבות המוחית הראשונית עד היום ה -14. ניתוח Immunofluorescence תומך, כי מחויבות עצבית יעילה, של אורגנואידים נגזר iPSC, כבר מושגת, על ידי היום השביעי של בידול.Immunostaining גם הפגין, מחויבות מוחית יעילה התבגרות יעילה של אורגנואידים מוחיים. יתר על כן, לאחר 80 ימים ב bioreactor, כתמים מתים חיים של אורגנואידים הראו כדאיות תאים גבוהה, ואין ראיות של אזורים נמקיים. טכניקה זו מייצגת כלי חשוב, לחקר מסלולים פתולוגיים, המעורבים בניוון המוח הקטן שנצפה בהם ולהערכת ההשפעה הטיפולית של תרופות חדשות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

דור יעיל ועריכה של נטול מזין IPSCs מתאי הלבלב האנושי באמצעות מערכת CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

זיהוי של אנדוטוקסין ניסוחים-Nano באמצעות מבחני Lysate (LAL) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

צמיחה ואפיון של אורגנואידים לקרינה מבלוטות החלב

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

בידוד של האדם למבוגרים פיברוכדורים מעור הבטן הדור של המושרה בתאי גזע Pluriפוטנטי באמצעות שיטה שאינה משלבת

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

הבחנה מודרכת של פודוקיטים בוגרים של כליות מתאי גזע פלוריפוטנטיים הנגרמים על ידי האדם בתנאים מוגדרים כימית

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

פיברובלסט נגזר רקמת חיבור מהונדסת אנושית עבור יישומי הקרנה

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...