Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Questo lavoro è stato sostenuto da Fundao para a Ciància e a Tecnologia (FCT), Portogallo (UIDB/04565/2020 attraverso Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Progetto N. 007317, DA PD/BD/105773/2014 a T.P.S e da PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), progetti cofinanziati da FEDER (POR Lisboa 2020 -Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 20 2020) e FCT attraverso sovvenzione PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 e CEREBEX Generazione di Organoidi Cerebellar per Ataxia Research sovvenzione LISBOA-01-0145-FEDER-029298. I finanziamenti sono stati ricevuti anche dal programma orizzonte 2020 dell'Unione europea per la ricerca e l'innovazione, nell'ambito dell'accordo di sovvenzione numero 739572: il Centro di scoperta per la medicina rigenerativa e di precisione H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passare e il mantenimento degli iPSC umani nella cultura monostrato
<ol><li>Preparazione delle piastre<ol>
<li>Scongelare la matrice della membrana delseminterrato (vedi Tabella dei Materiali ) stock a 4 gradi centigradi e preparare 60 aliquots di 60 L. Congelare gli aliquots a -20 gradi centigradi.</li>
		<li>Per rivestire i pozzi di una piastra di 6 pozzi, scongelare un aliquot della matrice di membrana seminterrato sul ghiaccio. Una volta scongelato, aggiungere 60 L a 6 mL di DMEM-F12. Rispendere...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. 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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

La necessità di grandi numeri di cellulare e di condizioni di coltura definite per generare tipi di cellule specifiche per lo screening farmacologico e le applicazioni di medicina rigenerativa ha guidato lo sviluppo di sistemi di coltura scalabili. Negli ultimi anni, diversi gruppi hanno segnalato la generazione scalabile di progenitori neurali e neuroni funzionali32,33,34, fornendo progressi significativi nello sviluppo di nuo...

L'emergere di cellule staminali pluripotenti umane (PSC) rappresenta un ottimo strumento per la medicina rigenerativa e la modellazione della malattia, perché queste cellule possono essere differenziate nella maggior parte delle linee cellulari del corpoumano 1,2. Dalla loro scoperta, la differenziazione PSC utilizzando approcci diversi è stata segnalata per modellare diverse malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi3,4,5,6.
Recentemente, ci sono state segnalazioni di colture 3D derivate da PSC simili a strutture cerebrali umane; questi sono chiamati organoidi cerebrali3,7,8. La generazione di queste strutture da PSC sani e specifici per il paziente offre una preziosa opportunità per modellare lo sviluppo umano e i disturbi del neurosviluppo. Tuttavia, i metodi utilizzati per generare queste strutture cerebrali ben organizzate sono difficili da applicare per la loro produzione su larga scala. Per produrre strutture sufficientemente grandi da ricapitolare la morfogenesi dei tessuti senza necrosi all'interno degli organoidi, i protocolli si basano sull'impegno neurale iniziale in condizioni statiche, seguito dall'incapsulamento negli idrogel e dalla successiva coltura nei sistemidinamici 3. Tuttavia, tali approcci possono limitare il potenziale aumento della produzione di organoidi. Anche se sono stati fatti sforzi per dirigere la differenziazione PSC a specifiche regioni del sistema nervoso centrale, tra cui corticale, striatale, midbrain, e neuroni del midollo spinale9,10,11,12, la generazione di regioni cerebrali specifiche in condizioni dinamiche è ancora una sfida. In particolare, la generazione di neuroni cerebellari maturi in strutture 3D deve ancora essere descritta. Muguruma et al. ha aperto la strada alla generazione di condizioni di coltura che ricapitolano lo sviluppo cerebellareprecoce 13 e ha recentemente riportato un protocollo che consente alle cellule staminali embrionali umane di generare una struttura polarizzata che ricorda il primo cervellettodel trimestre 7. Tuttavia, la maturazione dei neuroni cerebellari negli studi riportati richiede la dissociazione degli organoidi, lo smistamento dei progenitori cerebellari e la coculazione con cellule di alimentazione in un sistema di coltura monostrato7,14,15,16. Pertanto, la generazione riproducibile degli organoidi cerebellari desiderati per la modellazione della malattia in condizioni definite è ancora una sfida associata alla variabilità della coltura e dell'alimentazione.
Questo protocollo presenta condizioni di coltura ottimali per l'espansione 3D e la differenziazione efficiente dei PSC umani nei neuroni cerebellari utilizzando bioreattori a ruota verticale monoiose (vedi Tabella dei materiali per le specifiche), in seguito chiamati bioreattori. I bioreattori sono dotati di un grande impeller verticale, che in combinazione con un fondo a forma di U, fornisce una distribuzione di taglio più omogenea all'interno del vaso, consentendo una miscelazione delicata e uniforme e sospensioni di particelle con velocità di agitazioneridotte 17. Con questo sistema, è possibile ottenere aggregati cellulari controllati da forma e dimensioni, che è importante per una differenziazione più omogenea ed efficiente. Inoltre, un maggior numero di organoidi derivati da iPSC può essere generato in modo meno laborioso.
La caratteristica principale degli organoidi, che sono strutture multicellulari 3D di solito formate da cellule staminali, è l'auto-organizzazione di diversi tipi di cellule che forma forme specifiche come quelle osservate nella morfogenesiumana 18,19,20. Pertanto, la morfologia organoide è un criterio importante da valutare durante il processo di differenziazione. La criosezione degli organoidi e l'ulteriore immunosostenimento delle fette di organoidi con un insieme specifico di anticorpi consentono la visualizzazione spaziale dei marcatori molecolari per analizzare la proliferazione cellulare, la differenziazione, l'identità della popolazione cellulare e l'apoptosi. Con questo protocollo, immunostaining criosezioni organoidi, un impegno neurale efficiente iniziale è osservatodal 7 esimo giorno di differenziazione. Durante la differenziazione, vengono osservate diverse popolazioni di cellule con identità cerebellare. Dopo 35 giorni in questo sistema dinamico, il neuroepithelium cerebellare si organizza lungo un asse apicobasale, con uno strato apico di progenitori proliferanti e neuroni postmitotici situati in modo basalmente. Durante il processo di maturazione, dai giorni 35-90 di differenziazione, si possono vedere tipi distinti di+neuroni cerebellari, tra cui le cellule Purkinje (Calbindin , , le cellule di granulo (PAX6+- /MAP2, le cellule di Golgi (Neurogranin+), le cellule del pennello unipolare (TBR2+) e i neuroni di proiezione nuclei cerebellari profondi (TBR1 ) .+ Inoltre, una quantità non significativa di morte cellulare è osservata negli organoidi cerebellari generati dopo 90 giorni in coltura.
In questo sistema, gli organoidi umani derivati da iPSC maturano in diversi neuroni cerebellari e sopravvivono fino a 3 mesi senza la necessità di dissociazione e coculazione di alimentatori, fornendo una fonte di neuroni cerebellari umani per la modellazione della malattia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Il cervelletto svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'equilibrio e della coordinazione motoria, e un difetto funzionale in diversi neuroni cerebellari può innescare disfunzione cerebellare. La maggior parte delle conoscenze attuali sui fenotipi neuronali correlati alla malattia si basa sui tessuti post-mortem, il che rende difficile la comprensione della progressione e dello sviluppo della malattia. I modelli animali e le linee cellulari immortalate sono stati utilizzati anche come modelli per i disturbi neurodegenerativi. Tuttavia, non ricapitolano completamente la malattia umana. Le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (iPSC) hanno un grande potenziale per la modellazione della malattia e forniscono una fonte preziosa per gli approcci rigenerativi. Negli ultimi anni, la generazione di organoidi cerebrali da iPSC derivati dal paziente ha migliorato le prospettive per la modellazione delle malattie neurodegenerative. Tuttavia, mancano protocolli che producono un gran numero di organoidi e un'elevata resa di neuroni maturi nei sistemi di coltura 3D. Il protocollo presentato è un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile di organoidi umani derivati da iPSC in condizioni chimicamente definite utilizzando bioreattori mono uso scalabili, in cui gli organoidi acquisiscono l'identità cerebellare. Gli organoidi generati sono caratterizzati dall'espressione di marcatori specifici sia a livello di mRNA che di proteine. L'analisi di specifici gruppi di proteine consente di rilevare diverse popolazioni di cellule cerebellari, la cui localizzazione è importante per la valutazione della struttura organoide. La criosezione organoide e l'ulteriore immunosostenimento delle fette organoidi vengono utilizzate per valutare la presenza di specifiche popolazioni di cellule cerebellari e della loro organizzazione spaziale.

Il protocollo è stato avviato promuovendo l'aggregazione cellulare utilizzando i bioreattori 0,1 L (Figura 1A). È stata eseguita l'inoculazione a singola cellula degli iPSC, con 250.000 cellule/mL semitesse in 60 mL di media con una velocità di agitazione di 27 rpm. Questo è stato definito come giorno 0. Dopo 24 h, le cellule formavano in modo efficiente aggregati a forma di sferoide (giorno 1, Figura 1B), e la morfologia era ben mantenuta fino al giorno 5, ...

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Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Questo protocollo descrive un sistema di coltura dinamica per produrre aggregati di dimensioni controllate delle cellule staminali pluripotenti umane e stimolare ulteriormente la differenziazione negli organoidi cerebellari in condizioni chimicamente definite e senza alimentatori utilizzando un bioreaettore monouso.

Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione da immunostaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Presentiamo per la prima volta un nuovo approccio per la generazione riproducibile e scalabile, di cellule IPS derivate presso Organoidi Cerebellari, e condizioni chimiche definite, utilizzando bioreattori ad uso singolo. Per ottenere cellule per la semina del bio-reattore, aggiungere un millilitro di mezzo di distacco cellulare, ad ogni pozzo di una piastra di sei pozzi di iPSC umani. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per sette minuti, fino a quando uno scuotimento delicato stacca facilmente le cellule, dal pozzo.Utilizzando una micropipetta P 1000, pipettare il mezzo di distacco cellulare, su e giù, fino a quando le cellule non si dissociano in singole cellule. Successivamente aggiungere due millilitri, di mezzo di coltura cellulare completo ad ogni pozzo, questo inattiva la digestione enzimatica. Quindi utilizzare la pipetta, per trasferire delicatamente le cellule in un tubo conico sterile.Centrifugare il tubo a 210 volte la gravità per tre minuti. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare nel mezzo di coltura. Contare le cellule usando un emocitometro e una tintura blu di tripano.Vedi il vaso bioreattore con l'iPSC, ad una densità di 250.000 cellule per millilitro. Inserire il recipiente bioreattore, nell'unità di base universale, in un incubatore a 37 gradi Celsius, 95% di umidità e 5% di anidride carbonica. Per promuovere l'aggregazione iPSC, impostare il tasso di agitazione dell'unità di controllo di base su 27 RPM.Il primo giorno, con il giorno zero che è il giorno della semina del bioreattore, posizionare il bioreattore e l'unità di base in una cappa di flusso sterile, quindi utilizzare una pipetta sierologica, per raccogliere un campione di millilitro, della sospensione cellulare. Placcare le sospensioni cellulari in un attacco ultra basso, piastra da 24 pozzi. Utilizzare un microscopio per confermare che si sono formati aggregati derivati da iPSC.In tal caso, catturare le immagini degli aggregati a 40 X o 100 X.Continuare a coltivare l'iPSC e il bioreattore, fino a quando il diametro medio degli aggregati, è di 100 micrometri, quindi sostituire l'80% del mezzo, con MT01 fresco senza inibitore della roccia. Quando gli aggregati, raggiungono i 200-250 micrometri di diametro, lasciare depositare tutti gli organoidi, nella parte inferiore del bioreattore, quindi sostituire tutto il mezzo speso, con il mezzo di differenziazione gfCDM. Posizionare l'unità di base e il bioreattore nell'incubatore e diminuire l'agitazione a 25 giri/min.Dopo aver rimosso il supernatante dagli organoidi immagazzinati, aggiungere un millilitro di saccarosio al 15% al pellet e mescolare bene ruotando delicatamente. Dopo aver incubato gli organoidi durante la notte, a quattro gradi Celsius, rimuovere la soluzione di saccarosio, quindi aggiungere un millilitro di saccarosio al 15%, gelatina al 7,5% e mescolare rapidamente ruotando delicatamente. Mentre gli organoidi stanno incubando a 37 gradi Celsius riempiono un contenitore di plastica a metà strada con la soluzione di gelatina al 15% di saccarosio al 7,5% e gli permettono di solidificarsi.Dopo che gli organoidi hanno incubato per un'ora, utilizzare una pipetta Pasteur, per posizionare una goccia della miscela di gelatina di saccarosio organoide, sopra il saccarosio solidificato e la gelatina. Dopo aver aspettato 15 minuti che la goccia si solidifichi, riempire il resto del contenitore di plastica, con più 15% di saccarosio, 7,5% di gelatina, lasciarlo solidificare completamente a temperatura ambiente e quindi incubarlo per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Tagliare la gelatina in un cubo, con gli organoidi al centro, fissare il cubo a un pezzo di cartone, con una goccia di composto OCT, quindi posizionare 250 millilitri di Isopentane, in una tazza da 500 millilitri, riempire un contenitore appropriato, con azoto liquido.Utilizzando forcep e guanti spessi, posizionare con cura la tazza di Isopentane, sulla superficie dell'azoto liquido. Gli azoto isopentane e liquidi sono reagenti pericolosi. L'uso di questi due reagenti richiede dispositivi di protezione individuale, compresi guanti spessi e un'adeguata ventilazione.Quando l'Isopentane, si è raffreddato a -80 gradi Celsius, posizionare il cubo di gelatina nell'Isopentane fino a quando non si congela. Un cubo ben congelato, produce un suono metallico quando leggermente maschiato con forcep, indicando che è pronto per essere conservato. Lavare i vetrini del microscopio contenenti le sezioni organoidi, con 50 millilitri 1X PBS per cinque minuti, quindi trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente PBS fresco 1X.Trasferire le diapositive in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri di glicina appena preparata e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi trasferire gli scivoli in un barattolo coplin, contenente 50 millilitri dello 0,1% di Tritone, e permeabili per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavare le diapositive due volte con 1X PBS, per cinque minuti ogni volta. Preparare il piatto immunostaining, con carta da tre millimetri, imbevuto di 1X PBS.Asciugare gli scivoli con un tessuto tutto intorno alle fette e posizionarli sulla carta da tre millimetri. Con una pipetta Pasteur, coprire ogni diapositiva con 0,5 millilitri di soluzione di blocco. Dopo aver incubato per 30 minuti a temperatura ambiente, rimuovere la soluzione di blocco in eccesso e guidare le diapositive con un tessuto, tutto intorno alle fette.Posizionare 50 microlitri di anticorpo primario diluito, su ogni diapositiva e coprirli con scivolamenti di copertura. Allagare le diapositive, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, e incubarle a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna, trasferire le diapositive in un barattolo di Coplin, con 50 millilitri di TBST, lasciando cadere il coperchio, quindi lavare gli scivoli tre volte con TBST, per cinque minuti ogni volta.Posizionare 50 microlitri, di anticorpi secondari diluiti su ogni scivolo, e coprire con gli scivolamenti di copertura. Posizionare gli scivoli, nel piatto immunostaining precedentemente preparato, incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, protetti dalla luce. Trasferire nuovamente le diapositive in un barattolo coplin e lavarle tre volte con 50 millilitri di TBST, per cinque minuti ogni volta.Utilizzando una pipetta Pasteur, a 0,5 millilitri di soluzione dappy, su tutta la superficie di ogni scivolo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Dopo 24 ore nel bioreattore, gli aggregati a forma di sferoide formati in modo efficiente di iPSC. La morfologia è stata ben mantenuta fino al quinto giorno, con un graduale aumento delle dimensioni.Dimostrando un alto grado di omogeneità. Un'analisi quantitativa per microscopia, ha rivelato anche la distribuzione normale, delle dimensioni aggregate per primo giorno, ed entrambe le linee cellulari hanno raggiunto la dimensione aggregata ottimale per il secondo giorno. Dopo aver raggiunto il diametro aggregato desiderato, è stato indotto l'impegno neurale, e quindi la generazione di diversi progenitori cerebellari è stata promossa.Durante la differenziazione organoidi, ha mostrato un'epitelializzazione più pronunciata simile alle strutture simili a tubi neurali con spazio luminare. Inoltre, la distribuzione del diametro organoide, era omogenea durante l'impegno cerebellare iniziale fino al giorno 14. L'analisi dell'immunofluorescenza supporta, che un impegno neurale efficiente, degli organoidi derivati dall'iPSC, è già raggiunto, al settimo giorno di differenziazione.Immunostaining ha anche dimostrato, efficiente impegno cerebellare e maturazione efficiente degli organoidi cerebellari. Inoltre, dopo 80 giorni nel bioreattore, la colorazione morta viva degli organoidi ha mostrato un'elevata vitalità cellulare e nessuna evidenza di aree necrotiche. Questa tecnica rappresenta uno strumento importante, per lo studio delle vie patologiche, coinvolto nella degenerazione del cerebellare osservato in e per valutare l'effetto terapeutico di nuovi farmaci.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Ricerca

Bioingegneria

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Efficiente generazione e la modifica di IPSCs privo di alimentatore da cellule pancreatiche umane utilizzando il sistema di CRISPR-Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Crescita e caratterizzazione di organoidi irradiati da ghiandole mammarie

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolamento di fibroblasti dermici umani adulti dalla pelle addominale e generazione di cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando un metodo non integrato

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Differenziazione guidata di podociti renali maturi da cellule staminali pluripotenti indotte umane in condizioni chimicamente definite

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tessuto connettivo ingegnerizzato umano derivato da fibroblasti per applicazioni di screening

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...