Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
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この作品は、フンダソン・パラ・ア・シエンシア・エ・ア・テクノロジア(FCT)、ポルトガル(UIDB/04565/2020)がプログラム・オペラシオナル・リージョナル・デ・リスボア2020、プロジェクトN.007317によって支援されました。 PD/BD/105773/2014からT.P.SとPD/BD/128376/2017からD.E.S.N.へ、FEDER(PORリスボア2020)が共同出資するプロジェクト 2020)とFCTは、PAC精密リスボア-01-0145-FEDER-016394および運動失調研究のための小脳オルガノイドのCEREBEX世代を通じてLISBOA-01-0145-FEDER-029298を付与します。欧州連合(EU)のHorizon 2020研究イノベーションプログラムからも資金が寄せられたのは、助成金協定番号739572(再生精密医療発見センターH2020-WIDESPREAD-01-2016-2017)の下で行われました。

1. 単層培養におけるヒトiPSCの継ぎ手と維持
<ol><li>プレートの準備<ol>
<li>4 °Cで基部膜マトリックス( 材料表を参照)ストックを解凍し、60 μLアリコートを調製します。アリコートを-20°Cで凍らせます。</li>
		<li>6ウェルプレートのウェルをコーティングするには、氷の上に基部膜マトリックスの1アリコートを解凍します。解凍すると、60 μL を 6 mL の DMEM-F12 に加えます。上下にピ?...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

大規模な細胞数と、薬物スクリーニングおよび再生医療用途向けに特定の細胞タイプを生成するための定義された培養条件の必要性が、スケーラブルな培養システムの開発を推進してきました。近年、いくつかのグループは、神経前駆物質および機能的ニューロンのスケーラブルな生成を報告しています32,,33,,34,神経変性?...

ヒト多能性幹細胞(PSC)の出現は、再生医療および疾患モデリングのための優れたツールを表しており、これらの細胞は人体11,2のほとんどの細胞系統に分化することができるからである。その発見以来、多様なアプローチを用いたPSC分化は、神経変性疾患33、4、5、64,5を含む異なる疾患を6モデル化することが報告されている。
近年、ヒトの脳構造に似たPSC由来の3D培養が報告されている。これらは脳オルガノイド33、7、87と呼ばれています。健康な、患者固有のPSCの両方からのこれらの構造の生成は、人間の発達および神経発達障害をモデル化する貴重な機会を提供する。しかし、これらのよく組織化された脳構造を生成するために使用される方法は、その大規模な生産に適用することは困難です。オルガノイド内部の壊死を伴わずに組織形態形成を再現するのに十分な大きさの構造を作り出すために、プロトコルは静的条件下での初期神経コミットメントに依存し、続いてヒドロゲル中のカプセル化および動的系におけるその後の培養3。しかし、そのようなアプローチは、オルガノイド産生の潜在的なスケールアップを制限する可能性がある。皮質、線条体、中脳,、脊髄ニューロン9、10、11、12を含む中枢神経系の特定の領域にPSC分化を指示9する努力がなされているにもかかわらず、10,11動的な状態で特定の脳領域の生成は依然として課題である。12特に、3D構造における成熟小脳ニューロンの生成については、まだ記載されていない。Mugurumaら.は、初期の小脳の発達13を再現する培養条件の生成を開拓し、最近、ヒト胚性幹細胞が第1三期小脳7を連想させる偏光構造を生成することを可能にするプロトコルを報告した。しかしながら、報告された研究における小脳ニューロンの成熟は、オルガノイドの解離、小脳前駆腫の分類、および単層培養系7、14、15、1614,15におけるフィーダー細胞との共培養を必要7とする16。したがって、規定された条件下での疾患モデリングのための所望の小脳オルガノイドの再現性のある生成は、培養およびフィーダー源変動に関連する課題である。
このプロトコルは、単回使用垂直車輪バイオリアクター(仕様については 材料表 を参照)を用いた小脳ニューロンへのヒトPSCの3D拡張および効率的な分化のための最適な培養条件を提示し、以下バイオリアクターと呼ばれる。バイオリアクターは、U字型の底部と組み合わせた大きな垂直インペラを装備しており、容器内のより均質なせん断分布を提供し、攪拌速度17を低下させた穏やかで均一な混合および粒子懸濁液を可能にする。このシステムにより、形状およびサイズ制御された細胞凝集体が得られ、より均質で効率的な分化のために重要である。さらに、より多くのiPSC由来オルガノイドは、より手間のかかわりのない方法で生成することができます。
通常幹細胞から形成される3D多細胞構造であるオルガノイドの主な特徴は、ヒト形態形成18、19、2019,20に見られるような特定の形状を形成する異なる細胞18型の自己組織化である。したがって、オルガノイド形態は、分化過程で評価される重要な基準である。オルガノイドの細分化と、さらに特定の抗体を用いたオルガノイドスライスの免疫染色により、細胞増殖、分化、細胞集団の同一性、アポトーシスを解析する分子マーカーの空間的可視化が可能になります。このプロトコルを用いて、オルガノイド・クライオセクションを免疫染色することにより、分化の7日目により初期の効率的な神経コミットメントが観察される。分化の間、小脳の同一性を有する複数の細胞集団が観察される。この動的系で35日後、小脳神経エピテリウムは、前駆細胞および基底位置した近味神経系の前駆細胞および基底位置の素端層を有するアピコ基底軸に沿って組織する。成熟過程では、35~90日目の分化から、プルキンエ細胞(カルビンビン+)、顆粒細胞(PAX6+/MAP2+)、ゴルジ細胞(ニューログラニン+、ユニポーラブラシ細胞+(TBR2+)、深小+脳核投影ニューロン(TBR1+)+を含む、異なるタイプの小脳ニューロンが見られる。+また、培養で90日後に発生した小脳オルガノイドでは、有意でない量の細胞死が観察される。
このシステムでは、ヒトiPSC由来オルガノイドは異なる小脳ニューロンに成熟し、解離およびフィーダーの共培養を必要とせずに最大3ヶ月間生存し、疾患モデリングのためのヒト小脳ニューロンの供給源を提供する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

小脳はバランスと運動協調の維持において重要な役割を果たし、異なる小脳ニューロンの機能的欠陥は小脳機能障害を引き起こす可能性がある。疾患関連の神経細胞型に関する現在の知識のほとんどは、死後の組織に基づいており、疾患の進行と発症の理解が困難です。動物モデルおよび不死化細胞株は、神経変性疾患のモデルとしても使用されている。しかし、彼らは完全に人間の病気を再現しません。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、疾患モデル化の可能性が大きく、再生アプローチの貴重な供給源となります。近年、患者由来のiPSCからの脳オルガノイドの生成は、神経変性疾患モデルの見通しを改善しました。しかし、3D培養系において多数のオルガノイドを産生し、成熟したニューロンの収量が高いプロトコルが欠けている。このプロトコルは、オルガノイドが小脳の同一性を獲得するスケーラブルな単一使用バイオリアクターを使用して、化学的に定義された条件下で、ヒトiPSC由来オルガノイドを再現可能でスケーラブルに生成するための新しいアプローチです。生成されたオルガノイドは、mRNAおよびタンパク質レベルの両方で特異的なマーカーの発現によって特徴付けられる。タンパク質の特定のグループの分析は、その局在化がオルガノイド構造の評価に重要である異なる小脳細胞集団の検出を可能にします。オルガノイド凍結切除およびオルガノイドスライスのさらなる免疫染色は、特定の小脳細胞集団の存在およびそれらの空間組織を評価するために使用される。

プロトコルは、0.1 Lバイオリアクターを用いて細胞凝集を促進することによって開始された(図1A)。iPSCの単一細胞接種を行い、250,000個の細胞/mLを60mLの培地に播種し、撹拌速度は27rpmであった。これは 0 日として定義されました。24時間後、細胞は効率的にスフェロイド状の凝集体(1日目、図1B)を形成し、形態は5日目まで良好に維持され、徐々にサイ...

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Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞の制御されたサイズ凝集体を産生し、単一使用バイオリアクターを使用して化学的に定義されたフィーダーフリー条件下で小脳オルガノイドの分化をさらに刺激する動的培養システムを記述する。

ヒト多能性幹細胞からの成熟小脳オルガノイドのスケーラブルな生成と免疫染色による特徴付け

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

我々は初めて、単回使用バイオリアクターを用いて、再現性と拡張性の高い生成、小脳オルガノイドで誘導されるIPS細胞の新しいアプローチ、および化学的に定義された条件を提示する。バイオリアクターを播種するための細胞を得るために、ヒトiPSCの6つのウェルプレートの各ウェルに、細胞剥離培地を1ミリリットル加える。穏やかな揺れがウェルから細胞を簡単に取り外すまで、37°Cでプレートを7分間インキュベートします。P1000マイクロピペットを用いて、細胞剥離培地を、上下に、細胞が単一細胞に解離するまでピレットする。次に、完全な細胞培養培地の2ミリリットルを各ウェルに加え、酵素消化を不活性化する。次にピペットを使用して、細胞を滅菌状の円錐管に穏やかに移します。チューブを210倍の重力で3分間遠心分離します。上清を取り除き、培養培地中の細胞ペレットを再懸濁した。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、トリパンブルー染料。iPSCの1ミリリットル当たり250,000細胞の密度でバイオリアクター容器を参照してください。バイオリアクター容器をユニバーサルベースユニットに挿入し、摂氏37度、湿度95%、二酸化炭素5%のインキュベーターに挿入します。iPSC凝集を促進するには、ベースコントロールユニットの攪拌速度を27 RPMに設定します。1日目には、ゼロ日目がバイオリアクターを播種する日で、バイオリアクターとベースユニットを無菌フローフードに入れ、血清ピペットを使用して細胞懸濁液の1ミリリットルサンプルを採取する。細胞懸濁液を超低い取り付け、24ウェルプレートに入れます。顕微鏡を用い、iPSC由来の凝集体が形成されたことを確認する。その場合、40 Xまたは100 X.iPSCとバイオリアクターの培養を続けるで、凝集体とバイオリアクターの平均直径が100マイクロメートルになるまで、その後、岩石阻害剤のない新鮮なMT01で培地の80%を置き換えます。凝集体が直径200〜250マイクロメートルに達すると、すべてのオルガノイドを生体反応器の底に落ち着かせ、その後、すべての使用済み培地をgfCDM分化培地に置き換えます。基底ユニットとバイオリアクターをインキュベーターに入れ、撹拌を25RPMに減らします。保存されたオルガノイドから上清を取り除いた後、ペレットに15%スクロースの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻いてよく混ぜます。オルガノイドを一晩、摂氏4度でインキュベートした後、スクロース溶液を取り除き、15%スクロース、7.5%ゼラチンの1ミリリットルを加え、穏やかに渦巻くことによって素早く混ぜます。オルガノイドは摂氏37度でインキュベートしている間、15%スクロース7.5%ゼラチン溶液で途中でプラスチック容器を充填し、固化させます。オルガノイドが1時間インキュベートされた後、パスツールピペットを使用して、凝固したスクロースとゼラチンの上にオルガノイドスクロースゼラチン混合物の滴を置く。滴が固まるのを15分待った後、プラスチック容器の残りの部分を15%以上のスクロース、7.5%ゼラチンで満たし、室温で完全に固まり、摂氏4度で20分間インキュベートします。ゼラチンを立方体に切り、中央にオルガノイドを入れ、OCT化合物を滴下して立方体を段ボールに固定し、250ミリリットルのイポペンタンを500ミリリットルのカップに入れ、適切な容器に液体窒素を充填します。鉗子と厚い手袋を使用して、慎重に液体窒素の表面に、イポレタンのカップを置きます。イセペンタンと液体窒素は、有害な試薬である。これら2つの試薬の使用は、厚い手袋と十分な換気を含む個人的な保護具を必要とする。イセオペンタンが80°Cの負の80度まで冷却したら、ゼラチンキューブをイセプタンに入れ、凍るまで置きます。よく凍結された立方体は、軽く鉗子で叩くと金属音を生成し、それが保存される準備ができていることを示す。オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを5分間1XPBSで5分間洗浄し、そのスライドをコプリン瓶に移し、新鮮な1X PBSを含む。スライドをコプリン瓶に移し、調製したグリシン50ミリリットルを室温で10分間インキュベートし、スライドをコプリン瓶に移し、0.1%トリトンの50ミリリットルを含み、室温で10分間透過させた。スライドを1X PBSで2回、毎回5分間洗います。免疫染色皿を3ミリメートル紙で準備し、1X PBSに浸します。スライドをスライスの周りのティッシュで乾かして、3ミリメートル紙の上に置きます。パスツールピペットで、各スライドを0.5ミリリットルのブロッキング溶液で覆います。室温で30分間インキュベートした後、余分なブロッキング溶液を取り除き、すべてのスライスの周りに、組織でスライドを駆動します。各スライドに希釈された一次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップでそれらをカバーします。スライドをレースし、以前に準備した免疫染色皿で、摂氏4度でインキュベートします。一晩のインキュベーションの後、スライドをコプリン瓶に移し、50ミリリットルのTBSTでカバースリップを落とし、そのスライドをTBSTで3回洗い、毎回5分間洗います。各スライドに希釈二次抗体の50マイクロリットルを置き、カバースリップで覆います。スライドを入れ、あらかじめ調製した免疫染色皿に、光から保護された室温で30分間インキュベートする。スライドをもう一度コプリン瓶に移し、毎回5分間、50ミリリットルのTBSTで3回洗います。パスツールピペットを使用して、ダッピー溶液の0.5ミリリットルで、各スライドの全表面にわたって、室温で5分間インキュベートします。バイオリアクターで24時間後、iPSCの効率的に形成されたスフェロイド状の凝集体。形態は5日目までよく維持され、サイズは徐々に増加した。高度な均質性を実証する。顕微鏡による定量分析では、1日目の集合体サイズの正規分布も明らかにされ、両方の細胞株は2日目までに最適な集合体サイズを達成した。所望の凝集直径が達成された後、神経コミットメントが誘発され、そしてその後、異なる小脳前駆物質の生成が促進された。分化オルガノイドの間に、発光空間を有する神経管様構造に類似した、より顕著な上皮化を示した。さらに、オルガノイド径分布は、14日目まで初期小脳コミットメントの間に均質であった。免疫蛍光分析は、iPSC由来オルガノイドの効率的な神経コミットメントが既に達成されていることを、7日目の分化によって支持する。免疫染色はまた、実証, 効率的な小脳コミットメントと小脳オルガノイドの効率的な成熟.さらに、バイオリアクターで80日後、オルガノイドの生きた死染色は高い細胞生存率を示し、壊死領域の証拠はなかった。この技術は、病理学的経路を研究するための重要なツールを表し、新薬の治療効果を評価するために観察された小脳の変性に関与する。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

腹部皮膚からの成人ヒト皮膚線維芽細胞の分離と非積分法を用いた人工多能性幹細胞の生成

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

スクリーニング用途のための線維芽細胞由来ヒト工学的結合組織

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...