Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 gjennom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 til T.P.S og PD/BD/128376/2017 til D.E.S.N.), prosjekter finansiert av FEDER (POR Lisboa 2020– Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) og FCT gjennom tilskudd PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 og CEREBEX Generasjon av Cerebellar Organoids for Ataxia Research stipend LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Det ble også mottatt midler fra EUs Horizon 2020 Research and Innovation Programme, i henhold til tilskuddsavtalen nummer 739572 – The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Passaging og vedlikehold av menneskelige iPSCer i monolayer kultur
<ol><li>Utarbeidelse av plater<ol>
<li>Tin kjellermembranmatrisen (se Materialtabell)ved 4 °C og klargjør 60 μL aliquots. Frys aliquots ved -20 °C.</li>
		<li>For å belegge brønnene på en 6 brønnplate, tin en aliquot av kjelleren membran matrise på is. Når tinet tilsett 60 μL til 6 ml DMEM-F12. Forsiktig resuspend ved pipettering opp og ned.</li>
		<li>Tilsett 1 ml fortynnet kjellermembranmatriseløsning til hver brønn av...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

Behovet for store celletall samt definerte kulturforhold for å generere spesifikke celletyper for narkotikascreening og regenerative medisinapplikasjoner har drivt utviklingen av skalerbare kultursystemer. I de senere årene har flere grupper rapportert den skalerbare generasjonen av nevrale stamfar og funksjonelle nevroner32,33,34, noe som gir betydelige fremskritt i utviklingen av nye modeller for nevrodegenerative lidelser. ...

Fremveksten av menneskelige pluripotente stamceller (PSCer) representerer et utmerket verktøy for regenerativ medisin og sykdomsmodellering, fordi disse cellene kan differensieres i de fleste cellelinjer i menneskekroppen1,2. Siden oppdagelsen har PSC differensiering ved hjelp av ulike tilnærminger blitt rapportert å modellere ulike sykdommer, inkludert nevrodegenerativelidelser 3,4,5,6.
Nylig har det vært rapporter om 3D-kulturer avledet fra PSCer som ligner menneskelige hjernestrukturer; disse kalles hjerneorganoider3,7,8. Genereringen av disse strukturene fra både sunne og pasientspesifikke PSCer gir en verdifull mulighet til å modellere menneskelig utvikling og nevroutviklingsforstyrrelser. Metodene som brukes til å generere disse velorganiserte hjernestrukturene, er imidlertid vanskelige å søke om deres store produksjon. For å produsere strukturer som er store nok til å rekafulere vevmorfogenese uten nekrose inne i organoidene, er protokoller avhengige av den første nevrale forpliktelsen i statiske forhold, etterfulgt av innkapsling i hydrogeler og påfølgende kultur i dynamiske systemer3. Slike tilnærminger kan imidlertid begrense den potensielle oppskalering av organoidproduksjon. Selv om det er gjort forsøk på å lede PSC differensiering til bestemte regioner i sentralnervesystemet, inkludert kortikale, striatal, midbrain, og ryggmargsnevroner9,,10,,11,12, er genereringen av spesifikke hjerneregioner under dynamiske forhold fortsatt en utfordring. Spesielt har generasjonen modne cerebellar nevroner i 3D-strukturer ennå ikke blitt beskrevet. Muguruma et al. pionerer generasjonen av kulturforhold som rekafulerer tidlig cerebellar utvikling13 og nylig rapportert en protokoll som gjør det mulig for menneskelige embryonale stamceller å generere en polarisert struktur som minner om første trimester lillehjernen7. Modningen av cerebellar nevroner i de rapporterte studiene krever imidlertid dissosiasjon av organoider, sortering av cerebellar stamfarer og kokultur med materceller i et monolayer kultursystem7,14,15,16. Derfor er den reproduserbare generasjonen av de ønskede lillehjernen organoider for sykdomsmodellering under definerte forhold fortsatt en utfordring forbundet med kultur og materkildevariabilitet.
Denne protokollen presenterer optimale kulturforhold for 3D-utvidelse og effektiv differensiering av menneskelige PSCer i cerebellar nevroner ved hjelp av engangs vertikale hjul bioreaktorer (se Table of Materials for spesifikasjoner), heretter kalt bioreaktorer. Bioreaktorer er utstyrt med et stort vertikalt løpehjul, som i kombinasjon med en U-formet bunn gir en mer homogen skjærfordeling inne i fartøyet, slik at mild, jevn blanding og partikkelsuspensjon med reduserte agitasjonshastigheter17. Med dette systemet kan form og størrelseskontrollerte celleaggregater oppnås, noe som er viktig for en mer homogen og effektiv differensiering. Videre kan et større antall iPSC-avledede organoider genereres på en mindre arbeidskrevende måte.
Hovedtrekket i organoidene, som er 3D flercellede strukturer som vanligvis dannes fra stamceller, er selvorganiserende av forskjellige celletyper som danner bestemte former som de som er sett i menneskelig morfogenese18,19,20. Derfor er organoid morfologi et viktig kriterium som skal evalueres under differensieringsprosessen. Kryoseksjon av organoider og ytterligere immunstaining av organoidskiver med et bestemt sett med antistoffer tillater romlig visualisering av molekylære markører for å analysere cellespredning, differensiering, cellepopulasjonsidentitet og apoptose. Med denne protokollen, ved å immunstaining organoide kryoseksjoner, observeres en innledende effektiv neural forpliktelse avden 7. Under differensiering observeres flere cellepopulasjoner med lillehjernens identitet. Etter 35 dager i dette dynamiske systemet organiserer cerebellar neuroepithelium langs en apicobasal akse, med et apisk lag av voksende forfedre og basalt plassert postmitotiske nevroner. Under modningsprosessen, fra dag 35-90 av differensiering, kan distinkte typer cerebellar nevroner ses, inkludert Purkinje celler (Calbindin+), granulceller (PAX6+/ MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolar børsteceller (TBR2+), og dype lillehjernen kjerner projeksjon nevroner (TBR+). Også en ubetydelig mengde celledød observeres i de genererte lillehjernen organoider etter 90 dager i kultur.
I dette systemet modnes menneskelige iPSC-avledede organoider til forskjellige lillehjernennevroner og overlever i opptil 3 måneder uten behov for dissosiasjon og materkokultur, noe som gir en kilde til menneskelige lillehjernernevroner for sykdomsmodellering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Lillehjernen spiller en kritisk rolle i vedlikehold av balanse og motorisk koordinering, og en funksjonell defekt i forskjellige lillehjernen nevroner kan utløse lillehjernen dysfunksjon. Mesteparten av dagens kunnskap om sykdomsrelaterte nevronale fenotyper er basert på postmortemvev, noe som gjør forståelsen av sykdomsprogresjon og utvikling vanskelig. Dyremodeller og udødelige cellelinjer har også blitt brukt som modeller for nevrodegenerative lidelser. Imidlertid gjenoppretter de ikke helt menneskelig sykdom. Humane induserte pluripotente stamceller (iPSCer) har stort potensial for sykdomsmodellering og gir en verdifull kilde til regenerative tilnærminger. I de senere årene har genereringen av cerebrale organoider fra pasientavledede iPSCer forbedret utsiktene for neurodegenerativ sykdomsmodellering. Imidlertid mangler protokoller som produserer et stort antall organoider og et høyt utbytte av modne nevroner i 3D-kultursystemer. Protokollen som presenteres er en ny tilnærming for reproduserbar og skalerbar generasjon av menneskelige iPSC-avledede organoider under kjemisk definerte forhold ved hjelp av skalerbare engangsbioreaktorer, der organoider får lillehjernens identitet. De genererte organoidene er preget av uttrykk for spesifikke markører på både mRNA og proteinnivå. Analysen av spesifikke grupper av proteiner tillater påvisning av forskjellige lillehjernecellepopulasjoner, hvis lokalisering er viktig for evaluering av organoid struktur. Organoid kryoseksjon og ytterligere immunstaining av organoidskiver brukes til å evaluere tilstedeværelsen av spesifikke lillehjernencellepopulasjoner og deres romlige organisasjon.

Protokollen ble initiert ved å fremme celleaggregasjon ved hjelp av 0,1 L bioreaktorer (figur 1A). Encelle inokulasjon av iPSCene ble utført, med 250 000 celler/ml seeded i 60 ml medium med en agitasjonshastighet på 27 o/min. Dette ble definert som dag 0. Etter 24 timer dannet cellene effektivt spheroidformede aggregater (dag 1, figur 1B), og morfologien ble godt vedlikeholdt til dag 5, med en gradvis økning i størrelse, noe som viste en høy grad av homoge...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Denne protokollen beskriver et dynamisk kultursystem for å produsere kontrollerte størrelsesaggregater av menneskelige pluripotente stamceller og ytterligere stimulere differensiering i lillehjernen organoider under kjemisk definerte og materfrie forhold ved hjelp av en engangsbioreaktor.

Skalerbar generasjon av modne cerebellar organoider fra humane pluripotente stamceller og karakterisering ved immunstaining

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Vi presenterer for første gang, en ny tilnærming for reproduserbar og skalerbar generasjon, av IPS-celler avledet ved Cerebellar Organoids, og en kjemisk definert forhold, ved hjelp av engangs bioreaktorer. For å få celler for såing bio-reaktoren, legg til en milliliter celleavløsningsmedium, til hver brønn av en seks brønnplate av menneskelig iPSCs. Inkuber platen ved 37 grader Celsius i syv minutter, til mild risting lett løsner cellene, fra brønnen.Bruk en P 1000 mikropipette til å pipe celleavløsningsmediet, opp og ned, til cellene dissosierer seg i enkeltceller. Deretter legger du til to milliliter, av komplett cellekulturmedium til hver brønn, dette vil inaktivere enzymatisk fordøyelse. Bruk deretter pipetten, for å forsiktig overføre cellene til et sterilt konisk rør.Sentrifuger røret på 210 ganger tyngdekraften i tre minutter. Fjern det overnaturlige, og re-suspendere cellepellet i kulturmedium. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer, og trypan blå fargestoff.Se bioreaktorbeholderen med iPSCs, med en tetthet på 250 000 celler per milliliter. Sett bioreaktorbeholderen inn i universalbaseenheten, i en inkubator ved 37 grader Celsius, 95 % fuktighet og 5 %karbondioksid. Hvis du vil fremme iPSC-aggregasjon, setter du agitasjonshastigheten for basekontrollenheten til 27 RPM.På dag én, med dag null som er dagen for såing bioreaktoren, plasser bioreaktoren, og baseenheten i en steril strømningshette, og bruk deretter en serologisk pipette, for å samle en en milliliter prøve, av cellefjæringen. Plate celle suspensjon i en ultra lav vedlegg, 24 godt plate. Bruk et mikroskop, for å bekrefte at iPSC avledede aggregater har dannet.I så fall, ta bilder av aggregatene på 40 X eller 100 X.Fortsett å kultere iPSC og bioreaktoren, til den gjennomsnittlige diameteren på aggregatene, er 100 mikrometer, og erstatt deretter 80% av mediet, med fersk MT01 uten steinhemmer. Når aggregatene, nå 200 til 250 mikrometer i diameter, la alle organoider bosette seg, på bunnen av bioreaktoren, og deretter erstatte alle brukte medium, med gfCDM differensieringsmedium. Plasser baseenheten og bioreaktoren i inkubatoren og reduser omrøringen til 25 o/min.Etter å ha fjernet supernatant fra de lagrede organoidene, legg til en milliliter 15% sukrose til pelleten, og bland godt ved å virvle forsiktig. Etter inkubering av organoider over natten, ved fire grader Celsius, fjern sukroseløsningen, legg deretter til en milliliter 15% sukrose, 7,5% gelatin, og bland raskt ved forsiktig virvlende. Mens organoidene inkuberer ved 37 grader Celsius, fyller du en plastbeholder halvveis med 15% sukrose 7,5% gelatinløsning, og la den stivne.Etter at organoidene har ruget i en time, bruk en Pasteur pipette, for å plassere en dråpe organoid sukrose gelatinblanding, på toppen av den størknede sukrose og gelatin. Etter å ha ventet 15 minutter på at fallet skal stivne, fyll resten av plastbeholderen, med mer 15% sukrose, 7,5% gelatin, la den stivne helt ved romtemperatur og deretter inkubere den i 20 minutter ved fire grader Celsius. Skjær gelatinen i en kube, med organoidene i midten, fest kuben til et stykke papp, med en dråpe OCT-forbindelse, og legg deretter 250 milliliter isopentan, i en 500 milliliter kopp, fyll en passende beholder, med flytende nitrogen.Bruk tang og tykke hansker, legg forsiktig koppen isopentan, på overflaten av det flytende nitrogenet. Isopentan og flytende nitrogener, er farlige reagenser. Bruken av disse to reagensene, krever personlig verneutstyr, inkludert tykke hansker og tilstrekkelig ventilasjon.Når Isopentane, har avkjølt til negativ 80 grader Celsius, plasser gelatinkuben i Isopentane til den fryser. En godt frossen kube, produserer en metallisk lyd når den er lett tappet med tang, noe som indikerer at den er klar til å lagres. Vask mikroskopskliene som inneholder organoidseksjonene, med 50 milliliter 1X PBS i fem minutter, og overfør deretter lysbildene til en Coplin-krukke, som inneholder fersk 1X PBS.Overfør lysbildene til en Coplin krukke, som inneholder 50 milliliter nylaget glycin og inkuber i 10 minutter ved romtemperatur, og overfør deretter lysbildene til en Coplin-krukke, som inneholder 50 milliliter på 0,1% Triton, og permeabilisert i 10 minutter ved romtemperatur. Vask lysbildene to ganger med 1X PBS, i fem minutter hver gang. Forbered immunstaining parabolen, med tre millimeter papir, gjennomvåt i 1X PBS.Tørk lysbildene med et vev rundt skivene og legg dem på tre millimeterpapiret. Med en Pasteur pipette, dekk hvert lysbilde med 0,5 milliliter blokkeringsløsning. Etter inkubering i 30 minutter ved romtemperatur, fjern overflødig blokkeringsløsning og kjør lysbildene med et vev, rundt skivene.Plasser 50 mikroliter fortynnet primært antistoff, på hvert lysbilde og dekk dem med dekselslips. Snøre lysbildene, i den tidligere tilberedte immunstaining parabolen, og inkubere dem på fire grader Celsius. Etter overnattingsinkubasjon, overfør lysbildene til en Coplin-krukke, med 50 milliliter TBST, la dekselet sklier falle av, og vask deretter lysbildene tre ganger med TBST, i fem minutter hver gang.Plasser 50 mikroliter, av fortynnet sekundært antistoff på hvert lysbilde, og dekk med dekselets slips. Plasser lysbildene, i den tidligere tilberedte immunstainende parabolen, inkuber i 30 minutter ved romtemperatur, beskyttet mot lys. Overfør lysbildene til en Coplin krukke igjen, og vask dem tre ganger med 50 milliliter TBST, i fem minutter hver gang.Bruk en Pasteur Pipette, på 0,5 milliliter dappy løsning, over hele overflaten av hvert lysbilde og inkubere i fem minutter ved romtemperatur. Etter 24 timer i bioreaktoren, iPSCs effektivt dannede sfæroidformede aggregater. Morfologien ble godt vedlikeholdt til dag fem, med en gradvis økning i størrelse.Viser en høy grad av homogenitet. En kvantitativ analyse av mikroskopi, viste også normal fordeling, av aggregerte størrelser etter dag én, og begge cellelinjene oppnådde den optimale aggregerte størrelsen etter dag to. Etter at ønsket samlet diameter ble oppnådd, ble neural forpliktelse indusert, og deretter generasjon, av forskjellige cerebellar stamfarer ble fremmet.Under differensiering organoider, viste en mer uttalt epitelisering ligner nevrale rør-lignende strukturer med luminal plass. I tillegg var organoid diameter fordelingen homogen under den første lillehjernen forpliktelse til dag 14. Immunofluorescence analyse støtter, at en effektiv neural forpliktelse, av iPSC avledede organoider, allerede er oppnådd, ved dag syv av differensiering.Immunstaining viste også, effektiv cerebellar forpliktelse og effektiv modning av cerebellar organoider. Videre, etter 80 dager i bioreaktoren, viste levende døde flekker av organoider høy cellelevelighet, og ingen tegn på nekrotiske områder. Denne teknikken representerer et viktig verktøy, for å studere patologiske veier, involvert i degenerasjon av lillehjernen observert i og for å evaluere den terapeutiske effekten av nye legemidler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv generasjon og redigering av mater-gratis IPSCs fra menneskelige bukspyttkjertelen celler ved hjelp av CRISPR-Cas9 System

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Deteksjon av Endotoxin i Nano-formuleringer bruker Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Vekst og karakterisering av bestrålt Organoids fra Brystkjertler

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av voksen Human dermal fibroblaster fra abdominal hud og generering av indusert Pluripotent stamceller ved hjelp av en ikke-integrering metode

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Veiledet differensiering av modne nyrekapocytter fra menneskeskapte pluripotente stamceller under kjemisk definerte forhold

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast avledet menneskekonstruert bindevev for screeningapplikasjoner

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...