Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Эта работа была поддержана Funda'o para a Ci'ncia e a Tecnologia (FCT), Португалия (UIDB/04565/2020 через Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Проект N. 007317, PD/BD/105773/2014 до T.P.S и PD/BD/128376/2017 до D.E.S.N.), проекты, совместно финансируемые FEDER (POR Lisboa 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa) PORTUGAL 2020) и FCT через грант PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 и CEREBEX Поколение мозжечковых органоидов для Ataxia Research грант LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Финансирование было также получено из Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 в соответствии с Грант-соглашением No 739572 -Центр регенеративной и точной медицины H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Пассирование и техническое обслуживание человеческих iPSCs в культуре монослойных
<ol><li>Приготовление тарелок<ol>
<li>Оттепель мембранной матрицы подвала (см.Таблица материалов) запас при 4 градусов по Цельсию и подготовить 60 йл aliquots. Заморозить aliquots при -20 градусов по Цельсию.</li>
...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

Потребность в больших количествах клеток, а также определенных культурных условиях для создания конкретных типов клеток для скрининга наркотиков и применения регенеративной медицины является движущей силой развития масштабируемых систем культуры. В последние годы несколько групп с...

Появление плюрипотентных стволовых клеток человека (PSCs) представляет собой отличный инструмент для регенеративной медицины и моделирования заболеваний, потому что эти клетки могут быть дифференцированы в большинстве клеточных линийчеловеческого тела 1,2. С момента своего открытия, PSC дифференциации с использованием различных подходов, как сообщается, модели различных заболеваний, в том числе нейродегенеративных расстройств3,,4,,5,,6.
В последнее время появились сообщения о 3D-культурах, полученных из ПХК, напоминающих мозговые структуры человека; они называются органоидами мозга3,,7,,8. Поколение этих структур как из здоровых, так и для конкретных пациентов ПКС предоставляет ценную возможность для моделирования развития человека и расстройств нервного развития. Однако методы, используемые для создания этих хорошо организованных мозговых структур, трудно применить для их крупномасштабного производства. Для получения структур, которые достаточно велики, чтобы резюмировать морфогенез тканей без некроза внутри органоидов, протоколы полагаются на первоначальные нейронные обязательства в статических условиях, а затем инкапсуляции в гидрогелях и последующей культуры в динамическихсистемах 3. Однако такие подходы могут ограничить потенциальное масштабирование органоидного производства. Несмотря на то, что были предприняты усилия, чтобы направить дифференциацию PSC к определенным регионам центральной нервной системы, в том числе корковых, стриатальных, среднего мозга инейронов спинного мозга 9,10,11,12, генерация конкретных областей мозга в динамических условиях по-прежнему является проблемой. В частности, еще предстоит описать генерацию зрелых мозжечковых нейронов в 3D-структурах. Muguruma и др. впервые поколения культурных условий, которые recapitulate раннегомозжечка развития 13 и недавно сообщил протокол, который позволяет для человека эмбриональных стволовых клеток для создания поляризованной структуры напоминает первый триместр мозжечка7. Тем не менее, созревание мозжечковых нейронов в зарегистрированных исследованиях требует диссоциации органоидов, сортировки мозжечковых прародителей, и совместной культуры с клетками подачи всистеме культуры монослой 7,14,15,16. Таким образом, воспроизводимое поколение желаемых мозжечковых органоидов для моделирования заболеваний в определенных условиях по-прежнему является проблемой, связанной с культурой и изменчивостью источника подачи.
Этот протокол представляет оптимальные культурные условия для 3D-расширения и эффективной дифференциации человеческих ПКС на мозжечковые нейроны с использованием одноразовых вертикальных биореакторов колес (см. таблицу материалов для спецификаций), далее называемых биореакторами. Биореакторы оснащены большим вертикальным импеллером, который в сочетании с U-образным дном обеспечивает более однородное распределение снора внутри сосуда, позволяя нежному, равномерному смешиванию и подвеске частиц с уменьшенной скоростьювозбуждения 17. С помощью этой системы можно получить агрегаты клеток, контролируемые размером, что важно для более однородной и эффективной дифференциации. Кроме того, большее число органоидов, полученных из iPSC, может быть сгенерировано менее трудоемким образом.
Главной особенностью органоидов, которые являются 3D многоклеточные структуры обычно образуются из стволовых клеток, является самоорганизации различных типов клеток, которые образуют конкретные формы, как те, которыевидели в человеческих морфогенеза 18,19,20. Таким образом, органоидная морфология является важным критерием, который должен быть оценен в процессе дифференциации. Криозирование органоидов и дальнейшее иммуностентирование органоидных ломтиков с определенным набором антител позволяют пространственной визуализации молекулярных маркеров анализировать пролиферацию клеток, дифференциацию, идентичность популяции клеток и апоптоз. С помощью этого протокола, путем иммуностения органоидных cryosections, первоначальный эффективный нейронной приверженности наблюдается на7-й день дифференциации. Во время дифференциации наблюдается несколько популяций клеток с мозжечковой идентичностью. После 35 дней в этой динамической системе, мозжечковый нейроэпителий организуется вдоль апикобазальной оси, с апическим слоем размножающихся прародителей и базально расположенных постмитотических нейронов. Во время процесса созревания, с 35-90 дней дифференциации, различные типы мозжечковых нейронов можно увидеть, в том числе клетки Пуркинье (Calbindin+), гранулевые клетки (PAX6+/MAP2), Golgi клетки (Нейрогранин),однополярные клетки кисти (TBR2+), и глубокие мозжечковые ядра проекционныхнейронов(TBR1). Кроме того, незначительное количество клеточной смерти наблюдается в генерируемых мозжечковых органоидов после 90 дней в культуре.
В этой системе органоиды, полученные человеком iPSC, созревают в различные мозжечковые нейроны и выживают до 3 месяцев без необходимости диссоциации и кормушки кокультуры, обеспечивая источник мозжечковых нейронов человека для моделирования заболеваний.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Мозжечок играет важную роль в поддержании баланса и двигательной координации, а функциональный дефект в различных мозжечковых нейронах может вызвать мозжечковую дисфункцию. Большинство современных знаний о связанных с болезнями фенотипах нейронов основано на посмертных тканях, что затрудняет понимание прогрессирования и развития болезни. Модели животных и увековеченные клеточные линии также используются в качестве моделей для нейродегенеративных расстройств. Тем не менее, они не в полной мере повторить болезни человека. Индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs) имеют большой потенциал для моделирования заболеваний и являются ценным источником регенеративных подходов. В последние годы генерация церебральных органоидов из iPSCs, полученных пациентом, улучшила перспективы моделирования нейродегенеративных заболеваний. Тем не менее, протоколы, которые производят большое количество органоидов и высокий выход зрелых нейронов в системах 3D культуры отсутствуют. Представленный протокол представляет если представить новый подход к воспроизводимому и масштабируемому поколению органоидов, полученных человеком iPSC, в химически определенных условиях с использованием масштабируемых одноразових биореакторов, в которых органоиды приобретают мозжечковую идентичность. Генерируемые органоиды характеризуются экспрессией специфических маркеров как на уровне мРНК, так и на уровне белка. Анализ конкретных групп белков позволяет выявлять различные популяции мозжечковых клеток, локализация которых важна для оценки органоидной структуры. Органоидная криозирование и дальнейшее иммуностеление органоидных ломтиков используются для оценки присутствия конкретных популяций мозжечковых клеток и их пространственной организации.

Протокол был инициирован путем поощрения агрегации клеток с использованием биореакторов 0,1 л(рисунок 1A). Была проведена одноклеточная прививка iPSCs, при этом 250 000 клеток/мл посеяны в 60 мл среды со скоростью возбуждения 27 об/мин. Это было определено как день 0. После 24 ч, клет...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Этот протокол описывает динамическую культурную систему для производства контролируемых агрегатов размеров человеческих плюрипотентных стволовых клеток и дальнейшего стимулирования дифференциации мозжечковых органоидов в условиях, свободных от химических и фидерных, с использованием одноразового биореактора.

Масштабируемое поколение зрелых мозжечковых органоидов из плюрипотентных стволовых клеток человека и характеристика иммуностимулированием

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Мы представляем впервые новый подход к воспроизводимой и масштабируемой генерации, клеток IPS, полученных в мозжечковых органоидах, и химически определенные условия, использующие биореакторы с одним использованием. Чтобы получить клетки для посева биореатра, добавьте один миллилитр клеточной отслоения среды, к каждому колодец из шести хорошо пластины человека iPSC's. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в течение семи минут, пока не нежное встряхивание легко отделяет клетки, от колодец.Используя микропайпец P 1000, трубят клеточное отслоение среды, вверх и вниз, пока клетки не разобщаются в одиночные клетки. Далее добавьте два миллилитров, полной среды культуры клеток к каждому хорошо, это будет инактивировать энзиматическое пищеварение. Затем используйте пипетку, чтобы аккуратно перенести клетки в стерильную коническую трубку.Центрифуга трубки при 210 раз тяжести в течение трех минут. Удалите супернатант и повторно приостановив гранулы клеток в среде культуры. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и попробуйте синий краситель.Посмотрите на сосуд биореактора с iPSC с плотностью 250 000 клеток на миллилитр. Вставьте сосуд биореактора в универсальный базовый блок в инкубатор при 37 градусах Цельсия, влажности 95% и 5%углекислом газе. Для содействия агрегированию iPSC установите агитационный курс базового блока управления до 27 об/мин.В первый день, когда нулевой день является днем посева биореактора, поместите биореактор и базовый блок в стерильный капюшон потока, а затем используйте серологическую пипетку, чтобы собрать один миллилитр образца клеточной подвески. Плита подвески ячейки в ультра низкой крепления, 24 хорошо пластины. Используйте микроскоп, чтобы подтвердить, что iPSC производные агрегаты сформировались.Если это так, захват изображения агрегатов на 40 X или 100 X.Продолжить культивирование iPSC и биореактор, до среднего диаметра агрегатов, составляет 100 микрометров, а затем заменить 80% среды, со свежим MT01 без ингибитора породы. Когда агрегаты достигают от 200 до 250 микрометров в диаметре, пусть все органоиды оседают, в нижней части биореактора, а затем заменить все оттраченные среды, с gfCDM дифференциации среды. Поместите базовый блок и биореактор в инкубатор и уменьшите агитацию до 25 об/мин.После удаления супернатанта из хранящихся органоидов, добавить один миллилитр 15%сахарозы в гранулы, и хорошо перемешать, закрученного мягко. После инкубации органоидов на ночь, при четырех градусах по Цельсию, удалите раствор сахарозы, затем добавьте один миллилитр 15%сахарозы, 7,5% желатина и быстро перемешайте, аккуратно закрученные. В то время как органоиды инкубируют при 37 градусах по Цельсию заполнить пластиковый контейнер на полпути с 15% сахарозы 7,5%желатиновый раствор, и дать ему затвердеть.После того, как органоиды были инкубации в течение одного часа, используйте пастер пипетку, чтобы поместить каплю органоидной сахарозы желатиновой смеси, на вершине затвердевания сахарозы и желатина. После ожидания 15 минут для падения затвердеть, заполнить оставшуюся часть пластикового контейнера, с более чем 15% сахарозы, 7,5% желатина, дайте ему затвердеть полностью при комнатной температуре, а затем инкубировать его в течение 20 минут при четырех градусах цельсия. Разрежьте желатин на кубик, с органоидами в центре, зафиксните куб к куску картона, с каплей соединения OCT, затем поместьте 250 миллилитров изопентанов, в чашку 500 миллилитров, заполните соответствующий контейнер жидким азотом.Используя типсы и толстые перчатки, аккуратно поместите чашку изопентанов на поверхность жидкого азота. Изопентан и жидкий азот являются опасными реагентами. Для использования этих двух реагентов требуется средства индивидуальной защиты, включая толстые перчатки и адекватную вентиляцию.Когда изопентан остынет до отрицательных 80 градусов по Цельсию, поместите кубик желатина в изопентан до тех пор, пока он не замерзнет. Хорошо замороженный куб, производит металлический звук, когда слегка постучал с типсами, указывая, что он готов к хранимому. Вымойте микроскоп слайды, содержащие органоидные секции, с 50 миллилитров 1X PBS в течение пяти минут, а затем передать слайды в банку Coplin, содержащий свежие 1X PBS.Перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 50 миллилитров свежеприготовленного глицина и инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре, затем перенесите слайды в банку Coplin, содержащую 50 миллилитров 0,1%Triton, и пронизывает в течение 10 минут при комнатной температуре. Вымойте слайды дважды с 1X PBS, в течение пяти минут каждый раз. Приготовьте иммуностеинированную тарелку с трехмиллиметровой бумагой, пропитанной 1X PBS.Высушите горки салфеткой вокруг ломтиков и поместите их на трехмиллиметровую бумагу. С помощью пипетки Pasteur накройте каждый слайд 0,5 миллилитров блокирующего раствора. После инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре, удалить избыток блокирующего раствора и диск слайды с тканью, все вокруг ломтиков.Поместите 50 микролитров разбавленного первичного антитела на каждый слайд и накройте их крышкой. Кружева слайды, в ранее подготовленных иммуностеинации блюдо, и инкубировать их при четырех градусах по Цельсию. После ночной инкубации, перенесите слайды в банку Coplin, с 50 миллилитров TBST, позволяя крышке скользит упасть, а затем мыть слайды три раза с TBST, в течение пяти минут каждый раз.Поместите 50 микролитров, разбавленных вторичных антител на каждом слайде, и накройте крышкой скользит. Поместите горки, в ранее приготовленное иммуностейн, инкубировать в течение 30 минут при комнатной температуре, защищенной от света. Перенесите слайды в банку Coplin снова, и мыть их три раза с 50 миллилитров TBST, в течение пяти минут каждый раз.Использование Pasteur Pipette, на 0,5 миллилитров раствора dappy, по всей поверхности каждой горки и инкубировать в течение пяти минут при комнатной температуре. После 24 часов в биореакторе, iPSC эффективно формируется сфероидной формы агрегатов. Морфология была в хорошо поддерживается до пяти дней, с постепенным увеличением размера.Демонстрация высокой степени однородности. Количественный анализ с помощью микроскопии также показал нормальное распределение совокупных размеров на первый день, и обе клеточные линии достигли оптимального совокупного размера на второй день. После достижения желаемого совокупного диаметра была индуцирована нервная приверженность, а затем было повышено поколение различных мозжечковых прародителей.Во время дифференциации органоиды показали более выраженную эпителиализацию, похожую на нервные трубоподобные структуры с светящимся пространством. Кроме того, распределение органоидного диаметра, было однородным во время первоначального мозжечкового обязательства до 14-го дня. Иммунофлюоресценция анализ подтверждает, что эффективная нейронная приверженность, из iPSC производных органоидов, уже достигнута, на седьмой день дифференциации.Иммуностимулирование также продемонстрировало, эффективную мозжечковую приверженность и эффективное созревание мозжечковых органоидов. Кроме того, после 80 дней в биореакторе, живые мертвые окрашивания органоидов показали высокую жизнеспособность клеток, и никаких доказательств некротических областях. Этот метод представляет собой важный инструмент, для изучения патологических путей, участвующих в дегенерации мозжечка наблюдается в и для оценки терапевтического эффекта новых препаратов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Эффективное создание и редактирование фидер свободный IPSCs от человеческих клеток поджелудочной железы, с использованием системы ТРИФОСФАТЫ Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Обнаружения эндотоксинов в нано составов с помощью анализов Lysate (Лал) Amoebocyte Limulus

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Рост и характеристика облученных органоидов из молочных желез

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Изоляция взрослых человека дермальных фибробластов от кожи брюшной полости и поколение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток с использованием неинтегрирующего метода

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Управляемая дифференцировка зрелых почечных подоцитов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток в химически определенных условиях

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Фибробласт, полученный из искусственной соединительной ткани человека для скрининга

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...