Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Esta obra fue apoyada por la Fundación Para la Ciudad y la Tecnología (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 a través del Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Proyecto N. 007317, PD/BD/105773/2014 a T.P.S y PD/BD/128376/2017 a D.E.S.N.), proyectos cofinanciados por FEDER (POR Lisboa 2020—Programación Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 32020) y FCT a través de la subvención PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 y CEREBEX Generación de Organoides Cerebelosos para Ataxia Research subvención LISBOA-01-0145-FEDER-029298. La financiación también se recibió del Programa de Investigación e Innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea, en virtud del Acuerdo de Subvención número 739572—El Centro de Descubrimientos de Medicina Regenerativa y de Precisión H2020-WIDESPREAD-01-2016-2017.

1. Aprobación y mantenimiento de iPSC humanos en cultivo monocapa
<ol><li>Preparación de placas<ol>
<li>Descongelar la matriz de membrana del sótano (ver Tabla de Materiales)a 4oC y preparar alícuotas de 60 l. Congele las alícuotas a -20 oC.</li>
		<li>Para cubrir los pozos de una placa de 6 pozos, descongele una alícuota de la matriz de membrana del sótano sobre hielo. Una vez descongelado añadir 60 s a 6 ml de DMEM-F12. Resuspend suavemente pipeteando arriba y abajo.</li>
		<li>Añadir 1 ml d...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. 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M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

La necesidad de grandes números de células, así como condiciones de cultivo definidas para generar tipos celulares específicos para la detección de fármacos y aplicaciones de medicina regenerativa ha estado impulsando el desarrollo de sistemas de cultivo escalables. En los últimos años, varios grupos han reportado la generación escalable de progenitores neuronales y neuronas funcionales32,33,34, proporcionando avances s...

La aparición de células madre pluripotentes humanas (PSC) representa una excelente herramienta para la medicina regenerativa y el modelado de enfermedades, ya que estas células se pueden diferenciar en la mayoría de los linajes celulares del cuerpo humano1,,2. Desde su descubrimiento, la diferenciación de PSC utilizando diversos enfoques se ha informado para modelar diferentes enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos3,,4,5,6.
Recientemente, ha habido informes de culturas 3D derivadas de PSC que se asemejan a estructuras cerebrales humanas; estos se llaman organoides cerebrales3,7,8. La generación de estas estructuras a partir de PSC saludables y específicos para el paciente proporciona una valiosa oportunidad para modelar el desarrollo humano y los trastornos del neurodesarrollo. Sin embargo, los métodos utilizados para generar estas estructuras cerebrales bien organizadas son difíciles de aplicar para su producción a gran escala. Para producir estructuras lo suficientemente grandes como para recapitular la morfogénesis tisular sin necrosis dentro de los organoides, los protocolos se basan en el compromiso neuronal inicial en condiciones estáticas, seguido de encapsulación en hidrogeles y cultivo posterior en sistemas dinámicos3. Sin embargo, estos enfoques pueden limitar la posible ampliación de la producción de organoides. A pesar de que se han hecho esfuerzos para dirigir la diferenciación de PSC a regiones específicas del sistema nervioso central, incluyendo las neuronas cortical, estriado, de cerebro medio y de la médula espinal9,,10,11,12, la generación de regiones cerebrales específicas en condiciones dinámicas sigue siendo un desafío. En particular, la generación de neuronas cerebelosas maduras en estructuras 3D aún no se ha descrito. Muguruma et al. fueron pioneros en la generación de condiciones de cultivo que recapitulan el desarrollo cerebelo temprano13 y recientemente informaron de un protocolo que permite que las células madre embrionarias humanas generen una estructura polarizada que recuerda al primer trimestre cerebelo7. Sin embargo, la maduración de las neuronas cerebelosas en los estudios notificados requiere la disociación de los organoides, la clasificación de los progenitores cerebelosos, y la cocultura con células alimentadoras en un sistema de cultivo monocapa7,14,15,16. Por lo tanto, la generación reproducible de los organoides cerebelosos deseados para el modelado de enfermedades en condiciones definidas sigue siendo un desafío asociado con el cultivo y la variabilidad de la fuente del alimentador.
Este protocolo presenta condiciones óptimas de cultivo para la expansión 3D y la diferenciación eficiente de las PSC humanas en neuronas cerebelosas utilizando biorreactores de rueda vertical de un solo uso (ver Tabla de Materiales para especificaciones), en adelante llamados biorreactores. Los biorreactores están equipados con un gran impulsor vertical, que en combinación con un fondo en forma de U, proporcionan una distribución de cizallamiento más homogénea dentro del recipiente, permitiendo una mezcla suave y uniforme y la suspensión de partículas con velocidades de agitación reducidas17. Con este sistema, se pueden obtener agregados celulares controlados por forma y tamaño, lo que es importante para una diferenciación más homogénea y eficiente. Además, un mayor número de organoides derivados de iPSC se pueden generar de una manera menos laboriosa.
La característica principal de los organoides, que son estructuras multicelulares 3D generalmente formadas a partir de células madre, es la auto-organización de diferentes tipos celulares que forma formas específicas como las observadas en la morfogénesis humana18,,19,,20. Por lo tanto, la morfología organoide es un criterio importante a evaluar durante el proceso de diferenciación. La criosectación de organoides y la inmunostaining de rodajas organoides con un conjunto específico de anticuerpos permiten la visualización espacial de marcadores moleculares para analizar la proliferación celular, la diferenciación, la identidad de la población celular y la apoptosis. Con este protocolo, mediante la inmunodetermación de criocciones organoides, un compromiso neuronal eficiente inicial se observa por el día7 de diferenciación. Durante la diferenciación, se observan varias poblaciones celulares con identidad cerebelosa. Después de 35 días en este sistema dinámico, el neuroepithelium cerebeloso se organiza a lo largo de un eje apicobasal, con una capa apical de progenitores proliferantes y neuronas postmitoticas ubicadas basalmente. Durante el proceso de maduración, de los días 35-90 de diferenciación, se pueden observar distintos tipos de neuronas cerebelosas, incluyendo células de Purkinje (Calbindin+), células de gránulos (PAX6+/MAP2+), células Golgi (Neurogranin+), células de cepillo unipolar (TBR2+), y neuroleins de proyección de núcleos cerebelosos profundos (TBR1+). Además, se observa una cantidad no insignificante de muerte celular en los organoides cerebelosos generados después de 90 días en el cultivo.
En este sistema, los organoides humanos derivados de iPSC maduran en diferentes neuronas cerebelosas y sobreviven hasta 3 meses sin necesidad de disociación y cocultura alimentadora, proporcionando una fuente de neuronas cerebelosas humanas para el modelado de enfermedades.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

El cerebelo desempeña un papel crítico en el mantenimiento del equilibrio y la coordinación motora, y un defecto funcional en diferentes neuronas cerebelosas puede desencadenar disfunción cerebelosa. La mayor parte del conocimiento actual sobre los fenotipos neuronales relacionados con la enfermedad se basa en los tejidos postmortem, lo que dificulta la comprensión de la progresión y el desarrollo de la enfermedad. Modelos animales y líneas celulares inmortalizadas también se han utilizado como modelos para trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, no recapitulan completamente la enfermedad humana. Las células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (iPSC) tienen un gran potencial para el modelado de enfermedades y proporcionan una valiosa fuente para enfoques regenerativos. En los últimos años, la generación de organoides cerebrales a partir de iPSC derivados del paciente mejoró las perspectivas de modelado de enfermedades neurodegenerativas. Sin embargo, faltan protocolos que producen un gran número de organoides y un alto rendimiento de neuronas maduras en sistemas de cultivo 3D. El protocolo presentado es un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable de organoides humanos derivados de iPSC en condiciones definidas químicamente utilizando biorreactores escalables de un solo uso, en los que los organoides adquieren identidad cerebelosa. Los organoides generados se caracterizan por la expresión de marcadores específicos tanto a nivel de ARNm como de proteínas. El análisis de grupos específicos de proteínas permite la detección de diferentes poblaciones de células cerebelosas, cuya localización es importante para la evaluación de la estructura organoide. La criocisión organoidea y la inmunostaining de las rodajas organoides se utilizan para evaluar la presencia de poblaciones específicas de células cerebelosas y su organización espacial.

El protocolo se inició promoviendo la agregación celular utilizando los biorreactores 0.1 L (Figura 1A). Se realizó la inoculación de una sola célula de los iPSC, con 250.000 células/ml sembradas en 60 ml de medio con una velocidad de agitación de 27 rpm. Esto se definió como el día 0. Después de 24 h, las células formaron eficientemente agregados en forma de esferoides (día 1, Figura 1B),y la morfología se mantuvo bien hasta el día 5, con un aumen...

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Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Este protocolo describe un sistema de cultivo dinámico para producir agregados de tamaño controlado de células madre pluripotentes humanas y estimular aún más la diferenciación en organoides cerebelosos en condiciones definidas químicamente y libres de alimentadores utilizando un biorreactor de un solo uso.

Generación escalable de organoides cerebelosos maduros a partir de células madre pluripotentes humanas y caracterización por inmunosuización

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Presentamos por primera vez, un nuevo enfoque para la generación reproducible y escalable, de células IPS derivadas en organoides cerebelosos, y una condición química definida, utilizando biorreactores de un solo uso. Para obtener células para la siembra del biorres reactor, agregue un mililitro de medio de desprendimiento celular, a cada pozo de una placa de seis pozos de iPSC humano. Incubar la placa a 37 grados Celsius durante siete minutos, hasta que el suave temblor separe fácilmente las células del pozo.Usando una micropipeta P 1000, pipetee el medio de desprendimiento de celdas, hacia arriba y hacia abajo, hasta que las células se disociquen en células individuales. A continuación añadir dos mililitros, de medio de cultivo celular completo a cada pozo, esto inactivará la digestión enzimática. A continuación, utilice la pipeta para transferir suavemente las células a un tubo cónico estéril.Centrifugar el tubo a 210 veces la gravedad durante tres minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en un medio de cultivo. Cuente las células usando un hemocicómetro y tripa de colorante azul.Vea el recipiente del biorreactor con el iPSC, a una densidad de 250.000 células por mililitro. Inserte el recipiente del biorreactor, en la Unidad Base Universal, en una incubadora a 37 grados Celsius, 95% de humedad y 5% dióxido de carbono. Para promover la agregación iPSC, establezca la tasa de agitación de la unidad de control base en 27 RPM.En el primer día, siendo el día cero de la siembra del biorreactor, coloque el biorreactor y la unidad base en una campana de flujo estéril, luego use una pipeta serológica, para recoger una muestra de un mililitro, de la suspensión celular. Placa la suspensión celular en un accesorio ultra bajo, placa de 24 pozos. Utilice un microscopio para confirmar que se han formado agregados derivados de iPSC.Si es así, capturar imágenes de los agregados a 40 X o 100 X.Continúe cultivando los iPSC y el biorreactor, hasta que el diámetro medio de los agregados, es de 100 micrómetros, luego reemplace el 80% del medio, con MT01 fresco sin inhibidor de roca. Cuando los agregados, alcancen 200 a 250 micrometros de diámetro, dejen que todos los organoides se asienten, en la parte inferior del biorreactor, luego reemplacen todo el medio gastado, con el medio de diferenciación de gfCDM. Coloque la unidad base y el biorreactor en la incubadora y disminuya la agitación a 25 RPM.Después de retirar el sobrenadante de los organoides almacenados, agregue un mililitro de 15% de sacarosa al pellet, y mezcle bien girando suavemente. Después de incubar los organoides durante la noche, a cuatro grados Centígrados, retire la solución de sacarosa, luego agregue un mililitro de 15%sacarosa, 7.5% gelatina, y mezcle rápidamente arremolinando suavemente. Mientras que los organoides están incubando a 37 grados Celsius llenar un recipiente de plástico a mitad de camino con la solución de 15%sacarosa 7.5%gelatina, y permitir que se solidifique.Después de que los organoides hayan estado incubando durante una hora, utilice una pipeta Pasteur, para colocar una gota de la mezcla de gelatina de sacarosa organoides, encima de la sacarosa solidificada y gelatina. Después de esperar 15 minutos para que la gota se solidifique, llene el resto del recipiente de plástico, con más 15%sacarosa, 7.5% gelatina, permita que se solidifique completamente a temperatura ambiente y luego incubarlo durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Cortar la gelatina en un cubo, con los organoides en el centro, fijar el cubo a un pedazo de cartón, con una gota de compuesto OCT, luego colocado 250 mililitros de Isopentane, en una taza de 500 mililitros, llenar un recipiente apropiado, con nitrógeno líquido.Usando fórceps y guantes gruesos, coloque cuidadosamente la copa de Isopentane, en la superficie del nitrógeno líquido. El isopentano y los nitrógenos líquidos, son reactivos peligrosos. El uso de estos dos reactivos, requieren equipo de protección personal, incluyendo guantes gruesos y una ventilación adecuada.Cuando el Isopentane, se haya enfriado a 80 grados Celsius negativos, coloque el cubo de gelatina en el Isopentane hasta que se congele. Un cubo bien congelado, produce un sonido metálico cuando se toca ligeramente con fórceps, lo que indica que está listo para ser almacenado. Lave los portaobjetos del microscopio que contienen las secciones organoides, con 50 mililitros 1X PBS durante cinco minutos, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contiene 1X PBS fresco.Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de glicina recién preparada e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, luego transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, que contenga 50 mililitros de 0,1% Tritón, y permeabilizado durante 10 minutos a temperatura ambiente. Lave los portaobjetos dos veces con 1X PBS, durante cinco minutos cada vez. Preparar el plato de inmunosuchado, con papel de tres milímetros, empapado en 1X PBS.Seque los portaobjetos con un pañuelo alrededor de las rodajas y colóquelos en el papel de tres milímetros. Con una pipeta Pasteur, cubra cada diapositiva con 0,5 mililitros de solución de bloqueo. Después de incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, retire el exceso de solución de bloqueo y conduzca los portaobjetos con un pañuelo, alrededor de las rodajas.Coloque 50 microlitros de anticuerpo primario diluido, en cada diapositiva y cúbralos con resbalones de cubierta. Encaje los portaobjetos, en el plato de inmunostaining previamente preparado, e incubarlos a cuatro grados centígrados. Después de la incubación durante la noche, transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin, con 50 mililitros de TBST, dejando que la cubierta se caiga, luego lave los portaobjetos tres veces con TBST, durante cinco minutos cada vez.Coloque 50 microlitros, de anticuerpo secundario diluido en cada diapositiva, y cubra con los resbalones de la cubierta. Coloque los portaobjetos, en el plato de inmunosuchado previamente preparado, incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegidos de la luz. Transfiera los portaobjetos a un frasco de Coplin de nuevo y lávelos tres veces con 50 mililitros de TBST, durante cinco minutos cada vez.Usando una pipeta Pasteur, a 0,5 mililitros de solución de ondas, sobre toda la superficie de cada tobogán e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de 24 horas en el biorreactor, los agregados en forma de esferoides de iPSC formaron eficientemente. La morfología estuvo bien mantenida hasta el día cinco, con un aumento gradual de tamaño.Demostrando un alto grado de homogeneidad. Un análisis cuantitativo por microscopía, también reveló una distribución normal, de tamaños agregados por el primer día, y ambas líneas celulares alcanzaron el tamaño agregado óptimo en el segundo día. Después de alcanzar el diámetro agregado deseado, se indujo el compromiso neural, y luego se promovió la generación de diferentes progenitores cerebelosos.Durante la diferenciación de organoides, mostró una epitelización más pronunciada similar a las estructuras similares a los tubos neurales con espacio luminal. Además, la distribución del diámetro organoide, fue homogénea durante el compromiso cerebeloso inicial hasta el día 14. El análisis de inmunofluorescencia apoya que ya se haya logrado un compromiso neuronal eficiente, de los organoides derivados del iPSC, para el séptimo día de diferenciación.La inmunostaining también demostró un compromiso cerebeloso eficiente y una maduración eficiente de los organoides cerebelosos. Además, después de 80 días en el biorreactor, la tinción muerta viva de organoides mostró una alta viabilidad celular, y ninguna evidencia de áreas necróticas. Esta técnica representa una herramienta importante, para el estudio de las vías patológicas, implicada en la degeneración del cerebelo observada en y para evaluar el efecto terapéutico de nuevos fármacos.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Eficiente generación y edición de IPSCs alimentador-libre de las células pancreáticas humanas utilizando el sistema CRISPR Cas9

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detección de endotoxinas en las formulaciones Nano mediante ensayos de Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Crecimiento y caracterización de organoides irradiados de glándulas mamarias

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Aislamiento de fibroblastos dérmicos humanos adultos de la piel abdominal y generación de células madre pluripotentes inducidas utilizando un método no integrador

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Diferenciación guiada de podocitos renales maduros de células madre pluripotentes inducidas por humanos en condiciones químicamente definidas

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Tejido conectivo de ingeniería humana derivado de fibroblastos para aplicaciones de detección

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...