Name: scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining
Uploaded: 2020-06-13T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal (UIDB/04565/2020 genom Programa Operacional Regional de Lisboa 2020, Project N. 007317, PD/BD/105773/2014 till T.P.S och PD/BD/128376/2017 till D.E.S.N.), projekt som samfinansieras av FEDER (POR Lisboa 2020—Programa Operacional Regional de Lisboa PORTUGAL 2020) och FCT genom bidrag PAC-PRECISE LISBOA-01-0145-FEDER-016394 och CEREBEX Generation av Cerebellar Organoider för Ataxia Research bevilja LISBOA-01-0145-FEDER-029298. Finansiering mottogs också från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020, inom ramen för bidragsavtalet nummer 739572—"The Discoveries Centre for Regenerative and Precision Medicine H2020-wideSPREAD-01–2016–2017".

1. Passaging och underhåll av mänskliga iPSCs i monolayer kultur
<ol><li>Beredning av plattor<ol>
<li>Tina källaren membranmatris (se Tabell över material) lager vid 4 °C och förbereda 60 μL alikvoter. Frys alikvoterna vid -20 °C.</li>
		<li>Att belägga brunnarna i en 6 brunnsplatta, tina en alikvot av källaren membranmatris på is. När tinas tillsätt 60 μL till 6 mL DMEM-F12. Försiktigt återanvänd genom pipettering upp och ner.</li>
		<li>Tillsätt 1 mL utspädd källarmembranmatrislö...

<ol>
	<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+Pluripotent+Stem+Cells+from+Adult+Human+Fibroblasts+by+Defined+Factors.">Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors.</a> Cell. 131 (5), 861-872 (2007).</li><li>Thomson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Blastocysts.">Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts.</a> Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).</li><li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly.">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li><li>Ishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vulnerability+of+Purkinje+Cells+Generated+from+Spinocerebellar+Ataxia+Type+6+Patient-Derived+iPSCs.">Vulnerability of Purkinje Cells Generated from Spinocerebellar Ataxia Type 6 Patient-Derived iPSCs.</a> Cell Reports. 17 (6), 1482-1490 (2016).</li><li>Liu, Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+stem+cells+as+a+model+of+motoneuron+development+and+diseases.">Human stem cells as a model of motoneuron development and diseases.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1198, 192-200 (2010).</li><li>Mariani, J., Coppola, G., Pelphrey, K. A., Howe, J. R., Vaccarino, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXG1-Dependent+Dysregulation+of+GABA/+Glutamate+Neuron+Differentiation+in+Autism+Spectrum+Disorders.">FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/ Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders.</a> Cell. 162 (2), 375-390 (2015).</li><li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Organization+of+Polarized+Cerebellar+Tissue+in+3D+Culture+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Self-Organization of Polarized Cerebellar Tissue in 3D Culture of Human Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li><li>Qian, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+brain+region-specific+organoids+using+a+miniaturized+spinning+bioreactor.">Generation of human brain region-specific organoids using a miniaturized spinning bioreactor.</a> Nature Protocols. 13 (3), 565-580 (2018).</li><li>Aubry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Striatal+progenitors+derived+from+human+ES+cells+mature+into+DARPP32+neurons+in+vitro+and+in+quinolinic+acid-lesioned+rats.">Striatal progenitors derived from human ES cells mature into DARPP32 neurons in vitro and in quinolinic acid-lesioned rats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (43), 16707-16712 (2008).</li><li>Gunhanlar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+protocol+for+differentiation+of+electrophysiologically+mature+neuronal+networks+from+human+induced+pluripotent+stem+cells.">A simplified protocol for differentiation of electrophysiologically mature neuronal networks from human induced pluripotent stem cells.</a> Molecular Psychiatry. 23 (5), 1336-1344 (2018).</li><li>Hu, B. Y., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+spinal+motor+neurons+from+pluripotent+human+stem+cells.">Differentiation of spinal motor neurons from pluripotent human stem cells.</a> Nature Protocols. 4 (9), 1295-1304 (2009).</li><li>Jo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midbrain-like+Organoids+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+Contain+Functional+Dopaminergic+and+Neuromelanin-Producing+Neurons.">Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 248-257 (2016).</li><li>Muguruma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ontogeny-recapitulating+generation+and+tissue+integration+of+ES+cell-derived+Purkinje+cells.">Ontogeny-recapitulating generation and tissue integration of ES cell-derived Purkinje cells.</a> Nature Neurosciences. 13 (10), 1171-1180 (2010).</li><li>Watson, L. M., Wong, M. M. K., Vowles, J., Cowley, S. A., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simplified+Method+for+Generating+Purkinje+Cells+from+Human-Induced+Pluripotent+Stem+Cells.">A Simplified Method for Generating Purkinje Cells from Human-Induced Pluripotent Stem Cells.</a> The Cerebellum. 17 (4), 419-427 (2018).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons.">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Science Reports. 5, 9232 (2015).</li><li>Tao, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+generation+of+mature+cerebellar+Purkinje+cells+from+mouse+embryonic+stem+cells.">Efficient generation of mature cerebellar Purkinje cells from mouse embryonic stem cells.</a> Journal of Neuroscience Research. 88 (2), 234-247 (2010).</li><li>Croughan, M. S., Giroux, D., Fang, D., Lee, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Single-Use+Bioreactors+for+Scale-Up+of+Anchorage-Dependent+Cell+Manufacturing+for+Cell+Therapies.">Novel Single-Use Bioreactors for Scale-Up of Anchorage-Dependent Cell Manufacturing for Cell Therapies.</a> Stem Cell Manufacturing. , 105-139 (2016).</li><li>Simunovic, M., Brivanlou, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryoids,+organoids+and+gastruloids:+new+approaches+to+understanding+embryogenesis.">Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis.</a> Development. 144 (6), 976-985 (2017).</li><li>Lou, Y. R., Leung, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+organoids+for+biomedical+research+and+applications.">Next generation organoids for biomedical research and applications.</a> Biotechnology Advances. 36 (1), 132-149 (2018).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+Principles+for+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Organoid+Engineering.">Design Principles for Pluripotent Stem Cell-Derived Organoid Engineering.</a> Stem Cells International. 2019, 1-17 (2019).</li><li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture.">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers of Bioengineering and Biotechnology. , (2020).</li><li>Burridge, P. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+universal+system+for+highly+efficient+cardiac+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+that+eliminates+interline+variability.">A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability.</a> PLoS One. 6 (4), 18293 (2011).</li><li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells.">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).</li><li>Smith, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Activin/Nodal+signaling+promotes+specification+of+human+embryonic+stem+cells+into+neuroectoderm.">Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm.</a> Developmental Biology. 313 (1), 107-117 (2008).</li><li>Yaguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+growth+factor+(FGF)+gene+expression+in+the+developing+cerebellum+suggests+multiple+roles+for+FGF+signaling+during+cerebellar+morphogenesis+and+development.">Fibroblast growth factor (FGF) gene expression in the developing cerebellum suggests multiple roles for FGF signaling during cerebellar morphogenesis and development.</a> Developmental Dynamics. 238 (8), 2058-2072 (2008).</li><li>Fischer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fgf15-mediated+control+of+neurogenic+and+proneural+gene+expression+regulates+dorsal+midbrain+neurogenesis.">Fgf15-mediated control of neurogenic and proneural gene expression regulates dorsal midbrain neurogenesis.</a> Developmental Biology. 350 (2), 496-510 (2011).</li><li>Bagri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemokine+SDF1+regulates+migration+of+dentate+granule+cells.">The chemokine SDF1 regulates migration of dentate granule cells.</a> Development. 129 (18), 4249-4260 (2002).</li><li>Bardy, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+medium+that+supports+basic+synaptic+functions+and+activity+of+human+neurons+in+vitro.">Neuronal medium that supports basic synaptic functions and activity of human neurons in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (20), 2725-2734 (2015).</li><li>Bauwens, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+Human+Embryonic+Stem+Cell+Colony+and+Aggregate+Size+Heterogeneity+Influences+Differentiation+Trajectories.">Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories.</a> Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+embryoid+body+microenvironment+to+direct+embryonic+stem+cell+differentiation.">Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation.</a> Biotechnology Progress. 25 (1), 43-51 (2009).</li><li>Miranda, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+temporal+control+of+cell+aggregation+efficiently+directs+human+pluripotent+stem+cells+towards+neural+commitment.">Spatial and temporal control of cell aggregation efficiently directs human pluripotent stem cells towards neural commitment.</a> Biotechnology Journal. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li><li>Miranda, C. C., Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Cabral, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scaling+up+a+chemically-defined+aggregate-based+suspension+culture+system+for+neural+commitment+of+human+pluripotent+stem+cells.">Scaling up a chemically-defined aggregate-based suspension culture system for neural commitment of human pluripotent stem cells.</a> Biotechnology Journal. 11 (12), 1628-1638 (2016).</li><li>Bardy, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcarrier+Suspension+Cultures+for+High-Density+Expansion+and+Differentiation+of+Human+Pluripotent+Stem+Cells+to+Neural+Progenitor+Cells.">Microcarrier Suspension Cultures for High-Density Expansion and Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Neural Progenitor Cells.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 19 (2), 166-180 (2013).</li><li>Rigamonti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-Scale+Production+of+Mature+Neurons+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells+in+a+Three-Dimensional+Suspension+Culture+System.">Large-Scale Production of Mature Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Three-Dimensional Suspension Culture System.</a> Stem Cell Reports. 6 (6), 993-1008 (2016).</li><li>Arora, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+process+engineering+approach+to+increase+organoid+yield.">A process engineering approach to increase organoid yield.</a> Development. 144 (6), 1128-1136 (2017).</li><li>Gimeno, L., Martinez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+chick+Fgf19+and+mouse+Fgf15+orthologs+is+regulated+in+the+developing+brain+by+Fgf8+and+Shh.">Expression of chick Fgf19 and mouse Fgf15 orthologs is regulated in the developing brain by Fgf8 and Shh.</a> Developmental Dynamics. 236 (8), 2285-2297 (2007).</li></ol>

Behovet av stora cellnummer samt definierade odlingsförhållanden för att generera specifika celltyper för läkemedelsscreening och regenerativa medicintillämpningar har varit drivande i utvecklingen av skalbara odlingssystem. Under de senaste åren har flera grupper rapporterat skalbar generation av neurala progenitors och funktionella nervceller32,33,34, ger betydande framsteg i utvecklingen av nya modeller för neurodegen...

Uppkomsten av mänskliga pluripotenta stamceller (PSC) utgör ett utmärkt verktyg för regenerativ medicin och sjukdom modellering, eftersom dessa celler kan differentieras till de flesta cell härstamningar av människokroppen1,2. Sedan upptäckten har PSC-differentiering med olika metoder rapporterats för att modellera olika sjukdomar, inklusive neurodegenerativa sjukdomar3,4,5,6.
Nyligen har det förekommit rapporter om 3D-kulturer som härrör från PSCS liknar mänskliga cerebrala strukturer; dessa kallas hjärnorganoider3,7,8. Genereringen av dessa strukturer från både friska och patientspecifika PSCs ger en värdefull möjlighet att modellera mänsklig utveckling och neuroutvecklingsstörningar. Men de metoder som används för att generera dessa välorganiserade cerebrala strukturer är svåra att tillämpa för sin storskaliga produktion. För att producera strukturer som är tillräckligt stora för att rekapitulera vävnadsmorkosogenes utan nekros inuti organoiderna, protokoll förlita sig på den inledande neurala engagemang i statiska förhållanden, följt av inkapsling i hydrogeler och efterföljande kultur i dynamiska system3. Sådana tillvägagångssätt kan dock begränsa den potentiella uppskalning av organoid produktion. Även om ansträngningar har gjorts för att direkt PSC differentiering till specifika regioner i centrala nervsystemet, inklusive kortikala, striatal, mellanhjärnan, och ryggmärgen nervceller9,10,11,12, är generering av specifika hjärnregioner i dynamiska förhållanden fortfarande en utmaning. I synnerhet har generationen av mogna cerebellar nervceller i 3D-strukturer ännu inte beskrivas. Muguruma et al. banat väg för generering av kultur villkor som rekapitulera tidigt cerebellar utveckling13 och nyligen rapporterade ett protokoll som gör det möjligt för mänskliga embryonala stamceller för att generera en polariserad struktur som påminner om den första trimestern lillhjärnan7. Dock kräver mognaden av cerebellar nervceller i de rapporterade studierna dissociation av de organoider, sortering av cerebellar progenitors, och kokultur med matarceller i en monolayer kultur system7,14,15,16. Därför är reproducerbara generationen av de önskade cerebellar organoider för sjukdom modellering under definierade förhållanden fortfarande en utmaning i samband med kultur och feeder källa variabilitet.
Detta protokoll presenterar optimala odlingsförhållanden för 3D-expansion och effektiv differentiering av mänskliga PSC till cerebellar nervceller med användning av engångsbruk vertikala hjul bioreaktorer (se Tabell över material för specifikationer), nedan kallade bioreaktorer. Bioreaktorer är utrustade med en stor vertikal pumphjul, som i kombination med en U-formad botten, ger en mer homogen skjuvning fördelning inuti kärlet, vilket möjliggör mild, enhetlig blandning och partikel suspension med minskad agitation hastigheter17. Med detta system kan man få form och storleksstyrda cellaggregat, vilket är viktigt för en mer homogen och effektiv differentiering. Dessutom kan ett större antal iPSC-härledda organoider genereras på ett mindre mödosamt sätt.
Det viktigaste inslaget i de organoider, som är 3D flercelliga strukturer som vanligtvis bildas från stamceller, är självorganisering av olika celltyper som bildar specifika former som de som ses i människans morfogenes18,19,20. Därför är organoid morfologi ett viktigt kriterium som ska utvärderas under differentieringsprocessen. Kryosektioner av organoider och ytterligare immunfärgning av organoidskivor med en specifik uppsättning antikroppar möjliggör den rumsliga visualiseringen av molekylära markörer för att analysera cellproliferation, differentiering, cellpopulationsidentitet och apoptos. Med detta protokoll, genom immunostaining organoid cryosections, en initial effektiv neurala engagemang observeras av den 7dagen av differentiering. Under differentiering observeras flera cellpopulationer med cerebellär identitet. Efter 35 dagar i detta dynamiska system, organiserar cerebellar neuroepithelium längs en apicobasal axel, med ett apikalt lager av proliferering progenitors och basally ligger postmitotiska nervceller. Under mognadsprocessen, från dagar 35–90 av differentiering, kan distinkta typer av cerebellär nervceller ses, inklusive Purkinje celler (Calbindin+), granulatceller (PAX6+/MAP2+), Golgi celler (Neurogranin+), unipolär pensel celler (TBR2+), och djupa cerebellar nukleiprojektion nervceller (TBR1+). Också observeras en icke obetydlig mängd celldöd i de genererade cerebellarorganoiderna efter 90 dagar i kultur.
I detta system mognar mänskliga iPSC-härledda organoider till olika cerebellar-nervceller och överlever i upp till 3 månader utan behov av dissociation och matarkokultur, vilket ger en källa till mänskliga cerebellära nervceller för sjukdomsmodellering.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>3MM paper</td>
			<td>WHA3030861</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>A6964 - 500mL</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>cell detachment medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-BARHL1 Antibody</td>
			<td>HPA004809</td>
			<td>Atlas Antibodies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Calbindin D-28k Antibody</td>
			<td>CB28</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-MAP2 Antibody</td>
			<td>M4403</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-N-Cadherin Antibody</td>
			<td>610921</td>
			<td>BD Transduction</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NESTIN Antibody</td>
			<td>MAB1259-SP</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-OLIG2 Antibody</td>
			<td>MABN50</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PAX6 Antibody</td>
			<td>PRB-278P</td>
			<td>Covance</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-SOX2 Antibody</td>
			<td>MAB2018</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR1 Antibody</td>
			<td>AB2261</td>
			<td>Millipore</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TBR2 Antibody</td>
			<td>ab183991</td>
			<td>Abcam</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-TUJ1 Antibody</td>
			<td>801213</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Apo-transferrin</td>
			<td>T1147</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BrainPhys Neuronal Medium N2-A &#38; SM1 Kit</td>
			<td>5793 - 500mL</td>
			<td>Stem cell tecnhnologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chemically defined lipid concentrate</td>
			<td>11905031</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips 24x60mm</td>
			<td>631-1575</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystallization-purified BSA</td>
			<td>5470</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>10236276001</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dibutyryl cAMP</td>
			<td>SC- 201567B -500mg</td>
			<td>Frilabo</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM-F12</td>
			<td>32500-035</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from bovine skin</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Copling Jar</td>
			<td>E94</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax I</td>
			<td>10566-016</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>MB014001</td>
			<td>NZYtech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F12</td>
			<td>21765029</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Episomal iPSC Line</td>
			<td>A18945</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>iPSC6.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMDM</td>
			<td>12440046</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iPS DF6-9-9T.B</td>
			<td></td>
			<td>WiCell</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-pentane</td>
			<td>PHR1661-2ML</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>A-92902</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>354230</td>
			<td>Corning</td>
			<td>basement membrane matrix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monothioglycerol</td>
			<td>M6154</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol</td>
			<td>475904</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>85850 -500ml</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N2 supplement</td>
			<td>17502048</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>12348017</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>158127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-0.1 Single-Use Vessel</td>
			<td>SKU: IA-0.1-D-001</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS-MINI MagDrive Base Unit</td>
			<td>SKU: IA-UNI-B-501</td>
			<td>PBS Biotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human BDNF</td>
			<td>450-02</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human bFGF/FGF2</td>
			<td>100-18B</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human FGF19</td>
			<td>100-32</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human GDNF</td>
			<td>450-10</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human SDF1</td>
			<td>300-28A</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROCK inhibitor Y-27632</td>
			<td>72302</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB431542</td>
			<td>S4317</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>S7903</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Microscope slides</td>
			<td>12372098</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>adhesion microscope slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td>
			<td>25608-930</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-HCL 1M</td>
			<td>T3038-1L</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>9002-93-1</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>P1379</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>15575020</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable generation of mature cerebellar organoids from human pluripotent stem cells and characterization by immunostaining

Lillhjärnan spelar en avgörande roll i underhållet av balans och motorisk koordination, och en funktionell defekt i olika cerebellar nervceller kan utlösa cerebellar dysfunktion. De flesta av de nuvarande kunskaperna om sjukdomsrelaterade neuronala fenotyper är baserad på postmortem vävnader, vilket gör förståelsen av sjukdomsprogression och utveckling svårt. Djurmodeller och förevigade cellinjer har också använts som modeller för neurodegenerativa störningar. De rekapitulerar dock inte helt sjukdomar hos människor. Mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har stor potential för sjukdomsmodellering och utgör en värdefull källa för regenerativa metoder. Under de senaste åren, generering av cerebrala organoider från patient-härledda iPSCs förbättrat utsikterna för neurodegenerativa sjukdom modellering. Men, protokoll som producerar ett stort antal organoider och en hög avkastning av mogna nervceller i 3D-kultursystem saknas. Det protokoll som presenteras är en ny metod för reproducerbara och skalbara generationen av mänskliga iPSC-härledda organoider under kemiskt definierade förhållanden med hjälp av skalbara engångsbioreaktorer, där organoider förvärva cerebellar identitet. De genererade organoiderna kännetecknas av uttryck av specifika markörer på både mRNA och proteinnivå. Analysen av specifika grupper av proteiner möjliggör detektion av olika cerebellarcellpopulationer, vars lokalisering är viktig för utvärdering av organoidstruktur. Organoid cryosectioning och ytterligare immunostaining av organoid skivor används för att utvärdera förekomsten av specifika cerebellar cell populationer och deras rumsliga organisation.

Protokollet initierades genom att man främjade cellaggregering med hjälp av bioreaktorerna 0,1 L (figur 1A). Single cell inympning av iPSCs utfördes, med 250.000 celler/mL seedade i 60 mL medium med en agitation hastighet på 27 rpm. Detta definierades som dag 0. Efter 24 h bildade cellerna effektivt sfäroidformade aggregat (dag 1, figur 1B), och morfologin var väl underhållen fram till dag 5, med en gradvis ökning i storlek, vilket visar en hög grad av ...

Watch this Scientific Journal Video about Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining at JoVE.com

Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining

Detta protokoll beskriver ett dynamiskt odlingssystem för att producera kontrollerade storleksaggregat av mänskliga pluripotenta stamceller och ytterligare stimulera differentiering i cerebellar organoider under kemiskt definierade och feeder-fria förhållanden med hjälp av en engångsbioreaktor.

Skalbar Generation av Mogna Cerebellar Organoids från Mänskliga Pluripotenta stamceller och karakterisering av Immunfärgning

The cerebellum plays a critical role in the maintenance of balance and motor coordination, and a functional defect in different cerebellar neurons can ...

Vi presenterar för första gången, en ny metod för reproducerbar och skalbar generering, av IPS-celler som härrör från Cerebellar Organoids, och en kemisk definierade villkor, med användning av engångsbioreaktorer. För att få celler för sådd bio-reaktorn, tillsätt en milliliter cellavlossning medium, till varje brunn av en sex brunnsplatta av mänskliga iPSC's. Inkubera plattan vid 37 grader Celsius i sju minuter, tills mild skakning lätt lossnar cellerna, från brunnen.Med hjälp av en P 1000 mikropipette, pipet cellen lossnar medium, upp och ner, tills cellerna separeras i enstaka celler. Nästa lägga till två milliliter, av komplett cellodling medium till varje brunn, kommer detta inaktivera enzymatisk matsmältning. Använd sedan pipetten, för att försiktigt överföra cellerna till ett sterilt koniskt rör.Centrifugera röret vid 210 gångers gravitation i tre minuter. Ta bort supernatanten och dra upp cellpelleten på åter i odlingsmediet. Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer, och trypan blått färgämne.Se bioreaktorkärlet med iPSC:s, vid en densitet på 250, 000 celler per milliliter. För in bioreaktorkärlet, i Universal Base Unit, i en inkubator vid 37 grader Celsius, 95%luftfuktighet och 5%koldioxid. Om du vill främja iPSC-aggregering, ställer du in agitationshastigheten för Baskontrollenheten på 27 RPM.På dag ett, med dag noll är dagen för sådd bioreaktorn, placera bioreaktorn, och basenheten i ett sterilt flöde huva, sedan använda en serologisk pipett, för att samla en en milliliter prov, av cellen suspension. Platta cellen suspensionen i en ultra låg infästning, 24 väl platta. Använd ett mikroskop, för att bekräfta att iPSC härledda aggregat har bildats.Om så är så, fånga bilder av aggregaten på 40 X eller 100 X.Fortsätt culturing iPSC: s och bioreaktorn, tills den genomsnittliga diametern på aggregaten, är 100 mikrometer, sedan ersätta 80%av mediet, med färska MT01 utan berghämmare. När aggregaten, nå 200 till 250 mikrometer i diameter, låt alla organoider bosätta sig, i botten av bioreaktorn, sedan ersätta alla förbrukade medium, med gfCDM differentiering medium. Placera basenheten och bioreaktorn i inkubatorn och minska agitationen till 25 RPM.När du har tagit bort supernatanten från de lagrade organoiderna, tillsätt en milliliter av 15%sackaros till pelleten, och blanda väl genom att snurra försiktigt. Efter inkubering av organoiderna över natten, vid fyra grader Celsius, ta bort sackaroslösningen, tillsätt sedan en milliliter av 15%sackaros, 7,5%gelatin, och blanda snabbt genom att försiktigt virvla. Medan organoiderna inkuberar vid 37 grader Celsius fylla en plastbehållare halvvägs med 15%sackaros 7,5%gelatin lösning, och låta den stelna.Efter att organoiderna har inkuberat i en timme, använd en Pasteurpipett, för att placera en droppe av den organoida sackarosgelatinblandningen, ovanpå den stelnade sackaros och gelatin. Efter att ha väntat 15 minuter för att droppen ska stelna, fyll återstoden av plastbehållaren, med mer 15%sackaros, 7,5%gelatin, låt den stelna helt i rumstemperatur och sedan inkubera den i 20 minuter vid fyra grader Celsius. Skär gelatinet i en kub, med organoiderna i mitten, fixera kuben till en bit kartong, med en droppe OCT-förening, placeras sedan 250 milliliter Isopentane, i en 500 milliliter kopp, fyll en lämplig behållare, med flytande kväve.Med hjälp av tång och tjocka handskar, placera försiktigt kopp isopentan, på ytan av det flytande kvävet. Isopentane och flytande kväve, är farliga reagenser. Användningen av dessa två reagenser, kräver personlig skyddsutrustning, inklusive tjocka handskar och en tillräcklig ventilation.När Isopentan, har svalnat till negativa 80 grader Celsius, placera gelatin kuben i Isopentan tills den fryser. En väl frusen kub, ger ett metalliskt ljud när lätt knackade med tlyck, vilket visar att det är redo att lagras. Tvätta mikroskopet diabilder som innehåller organoid sektioner, med 50 milliliter 1X PBS i fem minuter, sedan överföra diabilder till en Coplin burk, som innehåller färska 1X PBS.Överför rutschbanorna till en Coplinburk, som innehåller 50 milliliter nyberedda glycin och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur, överför sedan objektglasen till en Coplinburk, som innehåller 50 milliliter på 0,1%Triton, och permeabiliserade i 10 minuter vid rumstemperatur. Tvätta objektglasen två gånger med 1X PBS, i fem minuter varje gång. Förbered immunfärgningsfatet, med tre millimeters papper, indränkt i 1X PBS.Torka diabilderna med en vävnad runt skivorna och placera dem på tre millimeters papper. Med en Pasteur-pipett, täck varje objektglas med 0,5 milliliter blockerande lösning. Efter inkubation i 30 minuter i rumstemperatur, ta bort överflödig blockerande lösning och driva bilderna med en vävnad, runt skivorna.Placera 50 mikroliter av utspädd primär antikropp, på varje objektglas och täck dem med täckglidningar. Spetsa diabilderna, i den tidigare beredda immunfärgningsfatet, och inkubera dem i fyra grader Celsius. Efter nattens inkubation överför du bilderna till en Coplinburk, med 50 milliliter TBST, låter täcksliorna ramla av och tvätta sedan bilderna tre gånger med TBST, i fem minuter varje gång.Placera 50 mikroliter, av utspädd sekundär antikropp på varje objektglas, och täck med täcksliorna. Placera objektglasen, i den tidigare beredda immunfärgningsskålen, inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur, skyddade från ljus. Överför diabilderna till en Coplin burk igen, och tvätta dem tre gånger med 50 milliliter TBST, i fem minuter varje gång.Med hjälp av en Pasteur Pipette, vid 0,5 milliliter dappy lösning, över hela ytan av varje objektglas och inkubera i fem minuter vid rumstemperatur. Efter 24 timmar i bioreaktorn, iPSC: s effektivt bildade sfäroidformade aggregat. Morfologin var väl underhållen fram till dag fem, med en gradvis ökning i storlek.Demonstrerar en hög grad av homogenitet. En kvantitativ analys genom mikroskopi, visade också normalfördelning, av sammanlagda storlekar av dag ett, och båda cellinjerna uppnått den optimala sammanlagda storleken av dag två. Efter den önskade sammanlagda diametern uppnåddes, neurala engagemang var inducerad, och sedan generation, av olika cerebellar progenitors främjades.Under differentiering organoider, visade en mer uttalad epitelisering liknar neurala röret-liknande strukturer med luminal utrymme. Dessutom var den organoid diameter fördelningen, homogen under den inledande cerebellar åtagandet fram till dag 14. Immunofluorescens analys stöder, att en effektiv neurala engagemang, av iPSC härledda organoider, är redan uppnått, genom dag sju av differentiering.Immunostaining också visat, effektiv cerebellar engagemang och effektiv mognad av cerebellar organoider. Vidare, efter 80 dagar i bioreaktorn, levande döda färgning av organoider visade hög cell livskraft, och inga bevis på necrotic områden. Denna teknik representerar ett viktigt verktyg, för att studera patologiska vägar, involverade i degeneration av cerebellären observeras i av och för utvärdering av terapeutiska effekten av nya läkemedel.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utveckling, expansion och<em&gt; In vivo</em&gt; Övervakning av humana NK celler från mänskliga embryonala stamceller (hESCs) och och inducerad pluripotenta stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation av inducerad Pluripotent Stamcell-härledd Mesoangioblast-liknande Myogena föregångare i musmodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Efficient Generation and Editing of Feeder-free IPSCs from Human Pancreatic Cells Using the CRISPR-Cas9 System

Effektiv produktion och redigering av Feeder-fri IPSCs från mänsklig bukspottkörtelns celler med hjälp av CRISPR-Cas9-systemet

Embryonic and induced pluripotent stem cells can self-renew and differentiate into multiple cell types of the body. The pluripotent cells are thus coveted ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Påvisande av Endotoxin i Nano-formuleringar använder Limulus immobiliserat Lysate (LAL) analyser

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Tillväxt och karakterisering av bestrålade Organoider från bröst körtlar

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Isolering av vuxna humana dermal fibroblaster från buk hud och generering av inducerade pluripotenta stamceller med en icke-integrerande metod

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Guided Differentiation of Mature Kidney Podocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Under Chemically Defined Conditions

Guidad differentiering av mogna njurpodocyter från mänskliga inducerade pluripotenta stamceller under kemiskt definierade förhållanden

Kidney disease affects more than 10% of the global population and costs billions of dollars in federal expenditures. The most severe forms of kidney ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Encellig optisk åtgärd potentiell mätning hos mänskliga inducerade pluripotenta stamcellsbaserade kardiomyocyter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

Fibroblast Derived Human Engineered Connective Tissue for Screening Applications

Fibroblast härledd mänsklig konstruerad bindväv för screeningapplikationer

Fibroblasts are phenotypically highly dynamic cells, which quickly transdifferentiate into myofibroblasts in response to biochemical and biomechanical ...