Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Nous remercions Fabrice Agou et Alix Boucharlat de la Plateforme de Criblage Chimiogénomique et Biologique du Centre de Ressources Technologiques et de Recherche (C2RT) de l’Institut Pasteur Paris pour leurs suggestions utiles sur le protocole, tous les membres de l’Unité BGPB pour le soutien et les discussions scientifiques, et Simon Legood pour la lecture critique du manuscrit. Les travaux ont été financés par Global Care Initiatives de l’Institut Carnot Maladies infectieuses et de l’Institut Carnot Microbes et Santé (15 CARN 0017-01 et 16 CARN 0023-01).

1. Préparation d’enzymes et de substrats
<ol><li>Purification de l’enzyme
	<ol><li>Produire et purifier l’enzyme Lnt à partir de membranes solubilisées détergentes comme décrit précédemment 4,8. Brièvement, induire l’expression du gène lnt-streptocoque, codant pour Lnt avec un marqueur streptococcique C-terminal, à OD 600 de 0,6 avec de la tétracycline anhydre (200 ng/mL) à 37 °C pendant 16 h.</li>
		<li...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Le protocole du test Lnt décrit ici, basé sur la détection par fluorescence du produit triacylé, est sensible et reproductible. La liaison spécifique et efficace de la biotine à la streptavidine est un élément clé du test. Le substrat alcyne-POPE laissé après l’achèvement de la réaction Lnt est également marqué par fluorescence avec FAM, mais est efficacement éliminé après s’être lié aux plaques de streptavidine par plusieurs étapes de lavage. De plus, l’ajout de DMSO n’affecte pas l’activi...

Les lipoprotéines bactériennes sont caractérisées par des acides gras liés par covalence au niveau de leurs amino-terminus à travers lesquels elles sont ancrées dans les membranes 1,2. La partie mature de la protéine est très diversifiée dans sa structure et sa fonction, ce qui explique le rôle des lipoprotéines dans divers processus biologiques dans l’enveloppe cellulaire bactérienne.
Les lipoprotéines sont modifiées par les acides gras dérivés des phospholipides après insertion dans la membrane cytoplasmique. Les prolipoprotéines contiennent un motif de signature, la lipobox, qui contient un résidu de cystéine invariant qui devient acylé et le premier acide aminé dans la protéine mature. La première étape de cette voie est catalysée par la prolipoprotéine phosphatidylglycérol::d iacylglycéryl transférase (Lgt), qui transfère le groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine via un lien thioéther entre le diacylglycéryle et la cystéine. La peptidase signal II (Lsp) clive le peptide signal de la prolipoprotéine diacylglycéryle, ce qui donne une apolipoprotéine qui est ancrée dans la membrane par sa fraction diacylglycéryle. La troisième et dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt), qui ajoute un acide gras de la position sn-1 du phospholipide sur l’apolipoprotéine, ce qui donne des lipoprotéines matures triacylées (Figure 1)3. La réaction Lnt est une réaction de ping-pong en deux étapes où un intermédiaire de l’enzyme acyle thioester stable est formé. Le sous-produit lysophospholipide est libéré avant l’acylation du substrat de l’apolipoprotéine dans la deuxième étape de la réaction.
La spécificité du substrat phospholipide est déterminée dans un test Lnt basé sur le décalage de mobilité du peptide N-acyl diacylglycéryle sur un pourcentage élevé de tris-tricine urée SDS-PAGE4. Les phospholipides avec de petits groupes de tête polaires, saturés [sn-1] et non saturés [sn-2], étaient des substrats préférés 4. Le test de décalage de gel n’est pas approprié pour des études cinétiques approfondies de l’apolipoprotéine N-acyltransférase ni pour que HTS identifie des molécules inhibitrices. La chimie du clic utilisant des acides gras alcynes a été utilisée avec succès pour étudier la modification des lipoprotéines chez les bactéries5 et le métabolisme des acides gras chez les eucaryotes6. Récemment, un essai in vitro de Ras palmitoylation a été signalé pour identifier les inhibiteurs7.
Dans la méthode décrite ici, le Lnt actif purifié dans le détergent est incubé avec des substrats dans des micelles mixtes pour former un peptide alcyne-triacylé qui est ensuite détecté par spectrométrie de fluorescence.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Les lipoprotéines des protéobactéries sont modifiées post-traductionnellement par des acides gras dérivés des phospholipides membranaires par l’action de trois enzymes membranaires intégrales, ce qui donne des protéines triacylées. La première étape de la voie de modification des lipoprotéines implique le transfert d’un groupe diacylglycéryle du phosphatidylglycérol à la prolipoprotéine, ce qui entraîne la prolipoprotéine diacylglycéryle. Dans la deuxième étape, le peptide signal de la prolipoprotéine est clivé, formant une apolipoprotéine, qui à son tour est modifiée par un troisième acide gras dérivé d’un phospholipide. Cette dernière étape est catalysée par l’apolipoprotéine N-acyltransférase (Lnt). La voie de modification des lipoprotéines est essentielle dans la plupart des γ-protéobactéries, ce qui en fait une cible potentielle pour le développement de nouveaux agents antibactériens. Décrit ici est un test sensible pour le Lnt qui est compatible avec le criblage à haut débit de petites molécules inhibitrices. L’enzyme et les substrats sont des molécules enfouies dans la membrane; Par conséquent, le développement d’un test in vitro n’est pas simple. Cela comprend la purification de l’enzyme active en présence de détergent, la disponibilité d’alcynes-phospholipides et de substrats peptidiques diacylglycéryliques, et les conditions de réaction dans des micelles mixtes. De plus, afin d’utiliser le test d’activité dans une configuration de criblage à haut débit (HTS), la lecture directe du produit de réaction est préférable aux réactions enzymatiques couplées. Dans ce dosage enzymatique fluorométrique, le produit peptidique alcyne-triacylé est rendu fluorescent par une réaction de chimie de clic et détecté dans un format de plaque multipuits. Cette méthode est applicable à d’autres acyltransférases qui utilisent des substrats contenant des acides gras, y compris les phospholipides et l’acyl-CoA.

Dans la réaction Lnt, l’acide gras sn-1 des phospholipides est transféré sur un peptide diacylglycéryle, ce qui donne un peptide triacylé8 mature. Le test Lnt in vitro décrit ici est conçu pour utiliser des phospholipides contenant un acide gras alcyne (alcyne-POPE) et FSL-1-biotine comme substrats, entraînant la formation d’alcyne-FSL-1-biotine. Lors d’une réaction de chimie de clic avec l’azido-FAM, ce produit doit être marqué par fluorescence et détecté par spectro...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Présenté ici est un test de fluorescence sensible pour surveiller l’activité de l’apolipoprotéine N-acyltransférase en utilisant le peptide diacylglycéryle et les alcyne-phospholipides comme substrats avec la chimie click.

Dosage fluorométrique basé sur la chimie Clic pour l’apolipoprotéine N-acyltransférase de la caractérisation enzymatique au criblage à haut débit

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