Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Ringraziamo Fabrice Agou e Alix Boucharlat della Chemogenomic and Biological Screening Platform, Center for Technological Resources and Research (C2RT) dell'Institut Pasteur Paris per gli utili suggerimenti sul protocollo, tutti i membri dell'Unità BGPB per il supporto e le discussioni scientifiche e Simon Legood per la lettura critica del manoscritto. Il lavoro è stato finanziato dalle Global Care Initiatives dell'Institute Carnot Infectious diseases e dell'Institute Carnot Microbes and Health (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).

1. Preparazione di enzimi e substrati
<ol><li>Purificazione dell'enzima
	<ol><li>Produrre e purificare l'enzima Lnt dalle membrane solubilizzate detergenti come descritto in precedenza 4,8. In breve, indurre l'espressione del gene lnt-streptococco, che codifica per Lnt con un tag C-terminale Streptococco, a OD 600 di 0,6 con tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C per 16 ore.</li>
		<li>Raccogliere le cellule mediante centr...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Il protocollo per il saggio Lnt qui descritto, basato sulla rilevazione a fluorescenza del prodotto triacilato, è sensibile e riproducibile. Il legame specifico ed efficiente della biotina alla streptavidina è un elemento chiave nel test. Anche il substrato alchino-POPE rimasto dopo il completamento della reazione Lnt è marcato in modo fluorescente con FAM, ma viene rimosso in modo efficiente dopo il legame sulle piastre di streptavidina mediante più fasi di lavaggio. Inoltre, l'aggiunta di DMSO non influisce sull'at...

Le lipoproteine batteriche sono caratterizzate da acidi grassi legati covalentemente ai loro amino-termini attraverso i quali sono ancorati nelle membrane 1,2. La parte matura della proteina è molto diversificata nella struttura e nella funzione, spiegando così il ruolo delle lipoproteine in vari processi biologici nell'involucro cellulare batterico.
Le lipoproteine sono modificate dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi dopo l'inserimento nella membrana citoplasmatica. Le prolipoproteine contengono un motivo distintivo, il lipobox, che contiene un residuo di cisteina invariante che diventa acilato e il primo amminoacido nella proteina matura. Il primo passo di questa via è catalizzato dalla prolipoproteina fosfatidilglicerolo::d iacylglyceryl transferasi (Lgt), che trasferisce il gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina attraverso un legame tioetere tra diacilgliceril e cisteina. La peptidasi segnale II (Lsp) fende il peptide segnale dalla diacilgliceril prolipoproteina, risultando in un'apolipoproteina che è ancorata nella membrana attraverso la sua porzione di diacilglicerile. La terza e ultima fase è catalizzata dall'apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt), che aggiunge un acido grasso dalla posizione sn-1 del fosfolipide all'apolipoproteina, risultando in lipoproteina matura triacilata (Figura 1)3. La reazione Lnt è una reazione ping-pong in due fasi in cui si forma un intermedio enzima acilico tioestere stabile. Il sottoprodotto lisofosfolipide viene rilasciato prima dell'acilazione del substrato dell'apolipoproteina nella seconda fase della reazione.
La specificità del substrato fosfolipidico è determinata in un saggio Lnt basato sullo spostamento della mobilità del peptide N-acildiacilglicerile su un'alta percentuale di Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. I fosfolipidi con piccoli gruppi polari, saturi [sn-1] e non saturi [sn-2], erano substrati preferiti 4. Il test di spostamento del gel non è appropriato per studi cinetici approfonditi sull'apolipoproteina N-aciltransferasi né per HTS per identificare molecole inibitorie. La click-chemistry che utilizza acidi grassi alchini è stata utilizzata con successo per studiare la modificazione delle lipoproteine nei batteri5 e il metabolismo degli acidi grassi negli eucarioti6. Recentemente, è stato riportato un test in vitro di palmitoilazione di Ras per identificare gli inibitori7.
Nel metodo qui descritto, Lnt attivo purificato nel detergente viene incubato con substrati in micelle miste per formare peptide alchino-triacilato che viene successivamente rilevato mediante spettrometria di fluorescenza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Le lipoproteine dei proteobatteri sono modificate post-traduzionalmente dagli acidi grassi derivati dai fosfolipidi di membrana mediante l'azione di tre enzimi integrali di membrana, con conseguente proteine triacilate. Il primo passo nella via di modificazione della lipoproteina comporta il trasferimento di un gruppo diacilglicerile dal fosfatidilglicerolo alla prolipoproteina, con conseguente diacilgliceril prolipoproteina. Nella seconda fase, il peptide segnale della prolipoproteina viene scisso, formando un'apolipoproteina, che a sua volta viene modificata da un terzo acido grasso derivato da un fosfolipide. Quest'ultimo passaggio è catalizzato dall'apolipoproteina N-aciltransferasi (Lnt). La via di modificazione delle lipoproteine è essenziale nella maggior parte dei γ-proteobatteri, rendendola un potenziale bersaglio per lo sviluppo di nuovi agenti antibatterici. Qui è descritto un test sensibile per Lnt che è compatibile con lo screening ad alto rendimento di piccole molecole inibitorie. L'enzima e i substrati sono molecole incorporate nella membrana; Pertanto, lo sviluppo di un test in vitro non è semplice. Ciò include la purificazione dell'enzima attivo in presenza di detergente, la disponibilità di alchino-fosfolipidi e substrati del peptide diacilglicerile e le condizioni di reazione nelle micelle miste. Inoltre, al fine di utilizzare il test di attività in una configurazione di screening ad alta produttività (HTS), la lettura diretta del prodotto di reazione è preferibile rispetto alle reazioni enzimatiche accoppiate. In questo saggio enzimatico fluorometrico, il prodotto peptidico alchino-triacilato viene reso fluorescente attraverso una reazione click-chimica e rilevato in un formato multipozzetto. Questo metodo è applicabile ad altre aciltransferasi che utilizzano substrati contenenti acidi grassi, inclusi fosfolipidi e acil-CoA.

Nella reazione Lnt l'acido grasso sn-1 dai fosfolipidi viene trasferito su un peptide diacilglicerile, risultando inpeptide triacilato 8 maturo. Il test Lnt in vitro qui descritto è progettato per utilizzare fosfolipidi contenenti un acido grasso alchino (alchino-POPE) e FSL-1-biotina come substrati, con conseguente formazione di alchino-FSL-1-biotina. Dopo una reazione chimica a scatto con azido-FAM, questo prodotto dovrebbe essere marcato con fluorescenza e rilevato mediante spettromet...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

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