Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
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我々は、プロトコルに関する有益な提案をしてくれたパリパスツール研究所の技術資源研究センター(C2RT)のケモゲノミクスおよび生物学的スクリーニングプラットフォームのFabrice AgouとAlix Boucharlat、サポートと科学的議論のためのBGPBユニットのすべてのメンバー、および原稿の批判的な読書のためのSimon Legoodに感謝します。この研究は、カルノー感染症研究所およびカルノー微生物と健康研究所のグローバルケアイニシアチブ(15 CARN 0017-01および16 CARN 0023-01)によって資金提供されました。

1.酵素および基質の調製
<ol><li>酵素の精製
	<ol><li>前述のように洗剤可溶化膜からLnt酵素を生成および精製する4,8。簡単に説明すると、C末端連鎖球菌タグを持つLntをコードするlnt-strep遺伝子の発現を、無水テトラサイクリン(200 ng / mL)で37°Cで16時間、0.6のOD600で誘導します。</li>
		<li>4,000 x g で10分間遠心分離して細...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

ここで説明するLntアッセイのプロトコルは、トリアシル化生成物の蛍光検出に基づいて、高感度で再現性があります。ビオチンとストレプトアビジンの特異的かつ効率的な結合は、アッセイの重要な要素です。Lnt反応の完了後に残ったAlkyne-POPE基質もFAMで蛍光標識されますが、複数の洗浄ステップによってストレプトアビジンプレートに結合した後に効率的に除去されます。さらに、DMSOの添?...

細菌リポタンパク質は、それらのアミノ末端において共有結合した脂肪酸によって特徴付けられ、それを通してそれらは膜に固定される1,2。タンパク質の成熟部分は構造および機能において非常に多様であり、それによって細菌細胞エンベロープにおける様々な生物学的過程におけるリポタンパク質の役割を説明する。
リポタンパク質は、細胞質膜への挿入後にリン脂質由来の脂肪酸によって修飾される。プロリポタンパク質は、アシル化される不変のシステイン残基および成熟タンパク質の最初のアミノ酸を含むシグネチャーモチーフであるリポボックスを含む。この経路の最初のステップは、ジアシルグリセリルとシステインの間のチオエーテル結合を介してホスファチジルグリセロールからプロリポタンパク質にジアシルグリセリル基を転移するプロリポタンパク質ホスファチジルグリセロール::d iacylグリセリルトランスフェラーゼ(Lgt)によって触媒されます。シグナルペプチダーゼII(Lsp)は、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質からシグナルペプチドを切断し、ジアシルグリセリル部分を介して膜に固定されたアポリポタンパク質を生成します。最後の3番目のステップは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ(Lnt)によって触媒され、リン脂質の sn-1位から脂肪酸をアポリポタンパク質に付加し、トリアシル化された成熟リポタンパク質を生成します(図1)3。Lnt反応は、安定なチオエステルアシル酵素中間体が形成される2段階のピンポン反応です。リゾリン脂質副産物は、反応の第2段階においてアポリポタンパク質基質のアシル化の前に放出される。
リン脂質基質特異性は、高パーセンテージのトリス-トリシン尿素SDS-PAGE4上のN-アシルジアシルグリセリルペプチドの移動度シフトに基づくLntアッセイで決定されます。小さな極性ヘッド基を有するリン脂質、飽和[sn-1]および非飽和[sn-2]は、基質4に好適であった。ゲルシフトアッセイは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼの広範な速度論的研究や、HTSが阻害分子を同定するのには適していません。アルキン脂肪酸を用いたクリックケミストリーは、細菌5のリポタンパク質修飾および真核生物6の脂肪酸代謝の研究に成功しています。最近、Rasパルミトイル化のインビトロアッセイにより、阻害剤7を同定することが報告されました。
ここで説明する方法では、界面活性剤中の精製された活性Lntは、混合ミセル中の基質と共にインキュベートされてアルキントリアシル化ペプチドを形成し、続いて蛍光分析によって検出される。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

プロテオバクテリア由来のリポタンパク質は、3つの内在性膜酵素の作用により膜リン脂質由来の脂肪酸によって翻訳後修飾され、トリアシル化タンパク質が得られます。リポタンパク質修飾経路の最初のステップは、ホスファチジルグリセロールからプロリポタンパク質へのジアシルグリセリル基の転移を含み、ジアシルグリセリルプロリポタンパク質をもたらす。第2の工程では、プロリポタンパク質のシグナルペプチドが切断されてアポリポタンパク質を形成し、アポリポタンパク質はリン脂質に由来する第3の脂肪酸によって修飾される。この最後のステップは、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ(Lnt)によって触媒されます。リポタンパク質修飾経路は、ほとんどのγプロテオバクテリアに不可欠であり、新規抗菌剤の開発の潜在的な標的となっています。ここで説明するのは、低分子阻害分子のハイスループットスクリーニングに適合するLntの高感度アッセイです。酵素と基質は膜に埋め込まれた分子です。したがって、in vitroテストの開発は簡単ではありません。これには、界面活性剤の存在下での活性酵素の精製、アルキンリン脂質およびジアシルグリセリルペプチド基質の利用可能性、および混合ミセルでの反応条件が含まれます。さらに、ハイスループットスクリーニング(HTS)セットアップで活性試験を使用するためには、共役酵素反応よりも反応生成物の直接読み出しが好ましい。この蛍光酵素アッセイでは、アルキントリアシル化ペプチド生成物はクリックケミストリー反応によって蛍光を発現し、マルチウェルプレートフォーマットで検出されます。この方法は、リン脂質やアシルCoAなどの脂肪酸含有基質を使用する他のアシルトランスフェラーゼにも適用できます。

Lnt反応では、リン脂質由来の sn-1脂肪酸がジアシルグリセリルペプチド上に転移し、成熟トリアシル化ペプチド8が得られる。ここで説明するin vitro Lntアッセイは、アルキン脂肪酸(アルキン-POPE)およびFSL-1-ビオチンを含むリン脂質を基質として使用するように設計されており、その結果、アルキン-FSL-1-ビオチンが形成されます。アジド-FAMとのクリックケミストリー反?...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

ここでは、ジアシルグリセリルペプチドとアルキンリン脂質を基質としてクリックケミストリーを用いて、アポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼ活性をモニターするための高感度蛍光アッセイを紹介します。

酵素特性評価からハイスループットスクリーニングまでのアポリポタンパク質N-アシルトランスフェラーゼのクリックケミストリーベースの蛍光アッセイ(英語)

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