Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
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Agradecemos a Fabrice Agou e Alix Boucharlat da Plataforma de Triagem Quimiogenômica e Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Pesquisa (C2RT) do Institut Pasteur Paris por sugestões úteis sobre o protocolo, a todos os membros da Unidade BGPB por apoio e discussões científicas e a Simon Legood pela leitura crítica do manuscrito. O trabalho foi financiado pelas Iniciativas de Cuidados Globais do Instituto Carnot Doenças Infecciosas e do Instituto Carnot Micróbios e Saúde (15 CARN 0017-01 e 16 CARN 0023-01).

1. Preparação de enzimas e substratos
<ol><li>Purificação da enzima
	<ol><li>Produzir e purificar a enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas em detergente, conforme descrito anteriormente 4,8. Resumidamente, induzir a expressão do gene lnt-strep, codificando Lnt com uma etiqueta Strep C-terminal, a OD 600 de 0,6 com tetraciclina anidra (200 ng/mL) a 37 °C por 16 h.</li>
		<li>Colher as células por centrifugaçã...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

O protocolo para o ensaio de Lnt aqui descrito, baseado na detecção de fluorescência do produto triacilado, é sensível e reprodutível. A ligação específica e eficiente da biotina à estreptavidina é um elemento-chave no ensaio. O substrato Alquino-PAPA deixado após a conclusão da reação Lnt também é marcado fluorescentemente com FAME, mas é eficientemente removido após a ligação às placas de estreptavidina por várias etapas de lavagem. Além disso, a adição de DMSO não afeta a atividade de Lnt e ...

As lipoproteínas bacterianas são caracterizadas por ácidos graxos covalentemente ligados em seus amino-termini através dos quais são ancoradas em membranas 1,2. A parte madura da proteína é altamente diversificada em estrutura e função, explicando assim o papel das lipoproteínas em vários processos biológicos no envelope celular bacteriano.
As lipoproteínas são modificadas por ácidos graxos derivados de fosfolipídios após a inserção na membrana citoplasmática. As prolipoproteínas contêm um motivo de assinatura, a lipocaixa, que contém um resíduo de cisteína invariante que se torna acilado e o primeiro aminoácido na proteína madura. O primeiro passo desta via é catalisado pela prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacylglyceryl transferase (Lgt), que transfere o grupo diacilgliceril do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína através de uma ligação tioéter entre diacilgliceril e cisteína. A peptidase de sinal II (Lsp) cliva o peptídeo de sinal da prolipoproteína diacilglicerila, resultando em uma apolipoproteína que é ancorada na membrana através de sua porção diacilgliceril. A terceira e última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt), que adiciona um ácido graxo da posição sn-1 do fosfolipídeo à apolipoproteína, resultando em lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. A reação Lnt é uma reação de pingue-pongue de duas etapas onde um intermediário estável da enzima tioéster acila é formado. O subproduto lisofosfolipídio é liberado antes da acilação do substrato apolipoprotéico na segunda etapa da reação.
A especificidade do substrato fosfolipídico é determinada em um ensaio de Lnt com base no deslocamento de mobilidade do peptídeo N-acilo diacilglicerilo em uma alta porcentagem de ureia Tris-Tritrina SDS-PAGE4. Fosfolipídios com pequenos grupos polares, saturados [sn-1] e não saturados [sn-2], foram substratos preferenciais 4. O ensaio de deslocamento de gel não é apropriado para estudos cinéticos extensivos da apolipoproteína N-aciltransferase nem para a HTS identificar moléculas inibitórias. A química do clique usando ácidos graxos alquinos tem sido usada com sucesso para estudar a modificação de lipoproteínas em bactérias5 e o metabolismo de ácidos graxos em eucariotas6. Recentemente, um ensaio in vitro de palmitoilação de Ras foi relatado para identificar inibidores7.
No método descrito aqui, o Lnt ativo purificado em detergente é incubado com substratos em micelas mistas para formar peptídeo alquino-triacilado que é subsequentemente detectado por espectrometria de fluorescência.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

As lipoproteínas de proteobactérias são modificadas pós-translacionalmente por ácidos graxos derivados de fosfolipídios de membrana pela ação de três enzimas integrais de membrana, resultando em proteínas triacilatadas. O primeiro passo na via de modificação da lipoproteína envolve a transferência de um grupo diacilglicerila do fosfatidilglicerol para a prolipoproteína, resultando em prolipoproteína diacilglicerila. Na segunda etapa, o peptídeo de sinal da prolipoproteína é clivado formando uma apolipoproteína, que por sua vez é modificada por um terceiro ácido graxo derivado de um fosfolipídio. Esta última etapa é catalisada pela apolipoproteína N-aciltransferase (Lnt). A via de modificação da lipoproteína é essencial na maioria das γ-proteobactérias, tornando-se um alvo potencial para o desenvolvimento de novos agentes antibacterianos. Descrito aqui é um ensaio sensível para Lnt que é compatível com triagem de alto rendimento de pequenas moléculas inibitórias. A enzima e os substratos são moléculas embutidas na membrana; por conseguinte, o desenvolvimento de um ensaio in vitro não é simples. Isso inclui a purificação da enzima ativa na presença de detergente, a disponibilidade de alquinofosfolipídios e substratos peptídicos diacilglicerilos e as condições de reação em micelas mistas. Além disso, para usar o teste de atividade em uma configuração de triagem de alto rendimento (HTS), a leitura direta do produto da reação é preferida às reações enzimáticas acopladas. Neste ensaio enzimático fluorométrico, o produto peptídico alquino-triacilado é tornado fluorescente através de uma reação de click-chemistry e detectado em um formato de placa multipoço. Este método é aplicável a outras aciltransferases que utilizam substratos contendo ácidos gordos, incluindo fosfolipídios e acil-CoA.

Na reação Lnt, o ácido graxo sn-1 dos fosfolipídios é transferido para um peptídeo diacilglicerila, resultando em peptídeo triacilado maduro8. O ensaio de Lnt in vitro descrito aqui é projetado para usar fosfolipídios contendo um ácido graxo alcino (alquino-POPE) e FSL-1-biotina como substratos, resultando na formação de alquino-FSL-1-biotina. Após uma reação de click-chemistry com azido-FAM, este produto deve ser marcado fluorescentemente e detectado por espectrometria de ...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Apresentamos aqui um ensaio de fluorescência sensível para monitorar a atividade da apolipoproteína N-aciltransferase usando peptídeo diacilglicerilo e alquino-fosfolipídios como substratos com click-química.

Ensaio fluorométrico baseado em química de cliques para apolipoproteína N-aciltransferase da caracterização enzimática à triagem de alto rendimento

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