Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Мы благодарим Фабриса Агу и Аликс Бушарла из Платформы химиогеномного и биологического скрининга, Центра технологических ресурсов и исследований (C2RT) в Институте Пастера в Париже за полезные предложения по протоколу, всех членов подразделения BGPB за поддержку и научные обсуждения и Саймона Легуда за критическое прочтение рукописи. Работа финансировалась Глобальными инициативами по уходу Института инфекционных заболеваний Карно и Института микробов и здоровья Карно (15 CARN 0017-01 и 16 CARN 0023-01).

1. Ферментная и субстратная подготовка
<ol><li>Очистка фермента
	<ol><li>Производят и очищают фермент Lnt от моющих солюбилизированных мембран, как описано ранее 4,8. Вкратце, индуцируют экспрессию гена lnt-стрептокка, кодирующего Lnt с помощью С-конце?...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

Протокол для анализа Lnt, описанный здесь, основанный на флуоресцентном обнаружении триацилированного продукта, является чувствительным и воспроизводимым. Специфическое и эффективное связывание биотина со стрептавидином является ключевым элементом анализа. Субстрат Alkyne-POPE, оставший?...

Бактериальные липопротеины характеризуются ковалентно связанными жирными кислотами на их амино-концах, через которые они закрепляются в мембранах 1,2. Зрелая часть белка очень разнообразна по структуре и функции, тем самым объясняя роль липопротеинов в различных биологических процессах в оболочке бактериальной клетки.
Липопротеины модифицируются жирными кислотами, полученными из фосфолипидов, после введения в цитоплазматическую мембрану. Пролипопротеины содержат фирменный мотив, липобокс, который содержит инвариантный остаток цистеина, который становится ацилированным и первой аминокислотой в зрелом белке. Первая стадия этого пути катализируется пролипопротеином фосфатидилглицерином: :d яцилглицерилтрансферазой (Lgt), которая переносит диацилглицерильную группу из фосфатидилглицерина в пролипопротеин через тиоэтерную связь между диацилглицерилом и цистеином. Сигнальная пептидаза II (Lsp) расщепляет сигнальный пептид от диацилглицерильного пролипопротеина, в результате чего образуется аполипопротеин, который закрепляется в мембране через его диацилглицерильный фрагмент. Третья и последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt), которая добавляет жирную кислоту из положения sn-1 фосфолипида на аполипопротеин, в результате чего образуется триацилированный зрелый липопротеин (рисунок 1)3. Реакция Lnt представляет собой двухступенчатую реакцию пинг-понга, в которой образуется стабильный промежуточный продукт тиоэфирного ацилового фермента. Побочный продукт лизофосфолипида высвобождается до ацилирования аполипопротеинового субстрата на второй стадии реакции.
Специфичность фосфолипидного субстрата определяется в анализе Lnt на основе сдвига подвижности N-ацилдиацилглицерилового пептида на высоком процентном содержании Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Фосфолипиды с небольшими полярными головными группами, насыщенными [sn-1] и ненасыщенными [sn-2], были предпочтительными субстратами4. Анализ сдвига геля не подходит для обширных кинетических исследований аполипопротеина N-ацилтрансферазы или для HTS для идентификации ингибирующих молекул. Click-химия с использованием алкиновых жирных кислот была успешно использована для изучения модификации липопротеинов у бактерий5 и метаболизма жирных кислот у эукариот6. Недавно сообщалось, что анализ пальмитоилирования Ras пальмитоилирования in vitro выявил ингибиторы7.
В способе, описанном здесь, очищенный активный Lnt в моющем средстве инкубируют с субстратами в смешанных мицеллах с образованием алкин-триацилированного пептида, который впоследствии обнаруживается флуоресцентной спектрометрией.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Липопротеины из протеобактерий посттрансляционно модифицируются жирными кислотами, полученными из мембранных фосфолипидов под действием трех интегральных мембранных ферментов, в результате чего образуются триацилированные белки. Первый этап в пути модификации липопротеинов включает перенос диацилглицерильной группы из фосфатидилглицерина в пролипопротеин, что приводит к диацилглицериловому пролипопротеину. На второй стадии сигнальный пептид пролипопротеина расщепляется, образуя аполипопротеин, который в свою очередь модифицируется третьей жирной кислотой, полученной из фосфолипида. Эта последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt). Путь модификации липопротеинов имеет важное значение в большинстве γ-протеобактерий, что делает его потенциальной мишенью для разработки новых антибактериальных агентов. Здесь описан чувствительный анализ для Lnt, который совместим с высокопроизводительным скринингом малых ингибирующих молекул. Фермент и субстраты представляют собой мембранно-внедренные молекулы; поэтому разработка теста in vitro не является простой. Это включает в себя очистку активного фермента в присутствии моющего средства, наличие алкин-фосфолипидов и субстратов диацилглицерильных пептидов, а также условия реакции в смешанных мицеллах. Кроме того, чтобы использовать тест активности в высокопроизводительной системе скрининга (HTS), прямое считывание реакционного продукта предпочтительнее связанных ферментативных реакций. В этом флуорометрическом ферментном анализе алкин-триацилированный пептидный продукт становится флуоресцентным посредством реакции щелчка-химии и обнаруживается в формате многоязычной пластины. Этот способ применим к другим ацилтрансферазам, в которых используются субстраты, содержащие жирные кислоты, включая фосфолипиды и ацил-КоА.

В реакции Lnt жирная кислота sn-1 из фосфолипидов переносится на диацилглицерилпептид, в результате чего образуется зрелый триацилированный пептид8. Анализ in vitro Lnt, описанный здесь, предназначен для использования фосфолипидов, содержащих алкиновую жирную кислоту (alkyne-POPE...

Watch this Scientific Journal Video about Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening at JoVE.com

Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Здесь представлен чувствительный флуоресцентный анализ для мониторинга активности аполипопротеина N-ацилтрансферазы с использованием диацилглицерилпептида и алкин-фосфолипидов в качестве субстратов с клик-химией.

Флюорометрический анализ на основе Click-Химии для аполипопротеин N-ацилтрансферазы от характеристики ферментов до высокопроизводительного скрининга

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

Высокопроизводительный скрининг углеводного-разрушающие ферменты Использование Роман Нерастворимые хромогенного субстрата Пробирной Kits

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Способ идентификации низкомолекулярных соединений ингибиторов белок-белкового взаимодействия между HCN1 и TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

A High-Throughput Luciferase Assay to Evaluate Proteolysis of the Single-Turnover Protease PCSK9

Высок объём Люцифераза Assay для оценки протеолиза PCSK9 сингл оборот протеазы

Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 (PCSK9) is a single-turnover protease which regulates serum low-density lipoprotein (LDL) levels and, ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  ÃƒÅ½Ã‚Â² Reporter Assay

Скрининг на фитоэстрогены с помощью клеточного рецептора эстрогена β Reporter Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

Optimized Incorporation of Alkynyl Fatty Acid Analogs for the Detection of Fatty Acylated Proteins using Click Chemistry

Оптимизированное включение аналогов алкиниловых жирных кислот для обнаружения жирных ацилированных белков с помощью Click Chemistry

Fatty acylation, the covalent addition of saturated fatty acids to protein substrates, is important in regulating a myriad of cellular functions in ...

A High-Throughput Enzyme-Coupled Activity Assay to Probe Small Molecule Interaction with the dNTPase SAMHD1

Sterile alpha motif and HD domain-containing protein 1 (SAMHD1) is a pivotal regulator of intracellular deoxynucleoside triphosphate (dNTP) pools, as this ...