Name: click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening
Uploaded: 2020-05-13T13:30:00
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Agradecemos a Fabrice Agou y Alix Boucharlat de la Plataforma de Detección Quimiogenómica y Biológica, Centro de Recursos Tecnológicos e Investigación (C2RT) en el Instituto Pasteur de París por sus útiles sugerencias sobre el protocolo, a todos los miembros de la Unidad BGPB por el apoyo y las discusiones científicas, y a Simon Legood por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo fue financiado por Global Care Initiatives del Instituto Carnot de Enfermedades Infecciosas y el Instituto Carnot Microbios y Salud (15 CARN 0017-01 y 16 CARN 0023-01).

1. Preparación de enzimas y sustratos
<ol><li>Purificación de la enzima
	<ol><li>Producir y purificar la enzima Lnt a partir de membranas solubilizadas detergentes como se describió anteriormente 4,8. Brevemente, inducir la expresión del gen lnt-estreptococo, codificando Lnt con una etiqueta de estreptococo C-terminal, en OD 600 de 0,6 con tetraciclina anhidra (200 ng/mL) a 37 °C durante 16 h.</li>
		<li>Recolectar cél...

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+mechanism+of+bacterial+lipoprotein+modification--how,+when+and+why.">The molecular mechanism of bacterial lipoprotein modification--how, when and why.</a> FEMS Microbiology Reviews. 39 (2), 246-261 (2015).</li><li>Kovacs-Simon, A., Titball, R. W., Michell, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoproteins+of+bacterial+pathogens.">Lipoproteins of bacterial pathogens.</a> Infections and Immunity. 79 (2), 548-561 (2010).</li><li>Jackowski, S., Rock, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+fatty+acids+from+the+1-position+of+phosphatidylethanolamine+to+the+major+outer+membrane+lipoprotein+of+Escherichia+coli.">Transfer of fatty acids from the 1-position of phosphatidylethanolamine to the major outer membrane lipoprotein of Escherichia coli.</a> Journal of Biological Chemistry. 261, 11328-11333 (1986).</li><li>Hillmann, F., Argentini, M., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+and+phospholipid+specificity+of+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Kinetics and phospholipid specificity of apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (32), 27936-27946 (2011).</li><li>Rangan, K. J., Yang, Y. Y., Charron, G., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Visualization+and+Large-Scale+Profiling+of+Bacterial+Lipoproteins+with+Chemical+Reporters.">Rapid Visualization and Large-Scale Profiling of Bacterial Lipoproteins with Chemical Reporters.</a> Journal of American Chemical Society. 132 (31), 10628-10629 (2010).</li><li>Thiele, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+fatty+acid+metabolism+by+click-chemistry.">Tracing fatty acid metabolism by click-chemistry.</a> ACS Chemical Biology. 7 (12), 2004-2011 (2012).</li><li>Ganesan, L., Shieh, P., Bertozzi, C. R., Levental, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click-Chemistry+Based+High+Throughput+Screening+Platform+for+Modulators+of+Ras+Palmitoylation.">Click-Chemistry Based High Throughput Screening Platform for Modulators of Ras Palmitoylation.</a> Science Reports. 7, 41147 (2017).</li><li>Nozeret, K., Boucharlat, A., Agou, F., Buddelmeijer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+fluorescence-based+assay+to+monitor+enzymatic+activity+of+the+essential+integral+membrane+protein+Apolipoprotein+N-acyltransferase+(Lnt).">A sensitive fluorescence-based assay to monitor enzymatic activity of the essential integral membrane protein Apolipoprotein N-acyltransferase (Lnt).</a> Science Reports. 9 (1), 15978 (2019).</li><li>Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Statistical+Parameter+for+Use+in+Evaluation+and+Validation+of+High+Throughput+Screening+Assays.">A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays.</a> Journal of Biomolecules Screening. 4 (2), 67-73 (1999).</li><li>Mao, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+lipoprotein+diacylglyceryl+transferase.">Crystal structure of E. coli lipoprotein diacylglyceryl transferase.</a> Nature Communication. 7, 10198 (2016).</li><li>Vogeley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+of+lipoprotein+signal+peptidase+II+action+and+inhibition+by+the+antibiotic+globomycin.">Structural basis of lipoprotein signal peptidase II action and inhibition by the antibiotic globomycin.</a> Science. 351 (6275), 876-880 (2016).</li><li>Wiktor, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+mechanism+of+the+membrane+integral+N-acyltransferase+step+in+bacterial+lipoprotein+synthesis.">Structural insights into the mechanism of the membrane integral N-acyltransferase step in bacterial lipoprotein synthesis.</a> Nature Communication. 8, 15952 (2017).</li><li>Noland, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+lipoprotein+N-acylation+by+Escherichia+coli+apolipoprotein+N-acyltransferase.">Structural insights into lipoprotein N-acylation by Escherichia coli apolipoprotein N-acyltransferase.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 114 (30), 6044-6053 (2017).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+E.+coli+apolipoprotein+N-acyl+transferase.">Crystal structure of E. coli apolipoprotein N-acyl transferase.</a> Nature Communication. 8, 15948 (2017).</li></ol>

El protocolo para el ensayo Lnt descrito aquí, basado en la detección de fluorescencia del producto triacilado, es sensible y reproducible. La unión específica y eficiente de la biotina a la estreptavidina es un elemento clave en el ensayo. El sustrato de alquino-papa que queda después de completar la reacción Lnt también se marca fluorescentemente con FAM, pero se elimina de manera eficiente después de unirse a las placas de estreptavidina mediante múltiples pasos de lavado. Además, la adición de DMSO no afec...

Las lipoproteínas bacterianas se caracterizan por ácidos grasos unidos covalentemente en sus aminoácidos a través de los cuales se anclan en membranas 1,2. La parte madura de la proteína es muy diversa en estructura y función, lo que explica el papel de las lipoproteínas en diversos procesos biológicos en la envoltura celular bacteriana.
Las lipoproteínas son modificadas por ácidos grasos derivados de fosfolípidos después de la inserción en la membrana citoplasmática. Las prolipoproteínas contienen un motivo característico, el lipobox, que contiene un residuo de cisteína invariante que se acila y el primer aminoácido en la proteína madura. El primer paso de esta vía es catalizado por la prolipoproteína fosfatidilglicerol::d iacilgliceril transferasa (Lgt), que transfiere el grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína a través de un enlace tioéter entre diacilglicerilo y cisteína. La peptidasa señal II (Lsp) escinde el péptido señal de la prolipoproteína diacilglicerilo, lo que resulta en una apolipoproteína que se ancla en la membrana a través de su fracción diacilglicerilo. El tercer y último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt), que agrega un ácido graso de la posición sn-1 del fosfolípido a la apolipoproteína, lo que resulta en una lipoproteína madura triacilada (Figura 1)3. La reacción Lnt es una reacción de ping-pong de dos pasos donde se forma un intermediario de enzima acilo tioéster estable. El subproducto lisofosfolípido se libera antes de la acilación del sustrato de apolipoproteína en el segundo paso de la reacción.
La especificidad del sustrato de fosfolípidos se determina en un ensayo Lnt basado en el cambio de movilidad del péptido N-acil diacilglicerilo en un alto porcentaje de Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Los fosfolípidos con pequeños grupos polares, saturados [sn-1] y no saturados [sn-2], fueron sustratos preferidos 4. El ensayo de desplazamiento de gel no es apropiado para estudios cinéticos extensos de apolipoproteína N-aciltransferasa ni para HTS para identificar moléculas inhibidoras. La química de clics utilizando ácidos grasos alquinos se ha utilizado con éxito para estudiar la modificación de lipoproteínas en bacterias5 y el metabolismo de ácidos grasos en eucariotas6. Recientemente, se informó de un ensayo in vitro de palmitoilación de Ras para identificar inhibidores7.
En el método descrito aquí, el Lnt activo purificado en detergente se incuba con sustratos en micelas mixtas para formar un péptido alquino-triacilado que posteriormente se detecta mediante espectrometría de fluorescencia.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#196;kta Purifier FPLC system</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>NA</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>alkyne-POPE</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>900414P</td>
			<td>Purity: &#62;99% 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Azido-FAM</td>
			<td>Lumiprobe</td>
			<td>A4130</td>
			<td>Purity: 100% (pure) 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioPhotometer Plus</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			OD 600 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioTek ELX 405 Select plate washer</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>N&#176; serie 115800, n&#176; materiel 405 Select</td>
			<td>Purity: NA 
			Wash steps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>biotin-fluorescein</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>53608</td>
			<td>Purity: &#8805;90% 
			Fluorescence control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper(II) sulfate pentahydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3036</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DDM</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>D310A</td>
			<td>Purity: &#8805; 99% &#946;+&#945;; &#60; 15% &#945; 
			Detergent for Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D12435</td>
			<td>Purity: anhydrous 
			Solbilization Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL</td>
			<td>INTEGRA</td>
			<td>4721</td>
			<td>Purity: NA 
			Handling reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>French Pressure Cell</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell disruption</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FSL-1-biotin</td>
			<td>EMC microcollections</td>
			<td>L7030</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>781091</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding</td>
			<td>Greiner</td>
			<td>655097</td>
			<td>Purity: NA 
			Black with transparent bottom (up or bottom reading)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate)</td>
			<td>Anatrace</td>
			<td>S110MT</td>
			<td>Purity: ~100% 
			Thiol specific inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optically Clear Adhesive Seal Sheets</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td>Purity: NA 
			Foil to seal multi-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>GE28-9356-04</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StrepTactin Sepharose 50 %</td>
			<td>IBA Biotechnology</td>
			<td>2-1201-010</td>
			<td>Purity: NA 
			Lnt purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>streptavidin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S4762-1MG</td>
			<td>Purity: &#8805;13 units/mg protein 
			Biotin binding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>678937</td>
			<td>Purity: 97% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>75259</td>
			<td>Purity: &#8805;98% 
			Click reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite F500</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TECAN Infinite M1000 pro</td>
			<td>Tecan</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td>Purity: NA 
			Heated lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93443</td>
			<td>Purity: 10% in H2O 
			Lnt reaction buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra centrifuge</td>
			<td>Beckman LC</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purity: NA 
			Cell fractionation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein n-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening

Las lipoproteínas de proteobacterias son modificadas postraduccionalmente por ácidos grasos derivados de fosfolípidos de membrana por la acción de tres enzimas integrales de membrana, lo que resulta en proteínas triaciladas. El primer paso en la vía de modificación de la lipoproteína implica la transferencia de un grupo diacilglicerilo del fosfatidilglicerol a la prolipoproteína, lo que resulta en la prolipoproteína diacilglicerilo. En el segundo paso, el péptido señal de la prolipoproteína se escinde, formando una apolipoproteína, que a su vez es modificada por un tercer ácido graso derivado de un fosfolípido. Este último paso es catalizado por la apolipoproteína N-aciltransferasa (Lnt). La vía de modificación de lipoproteínas es esencial en la mayoría de las γ-proteobacterias, por lo que es un objetivo potencial para el desarrollo de nuevos agentes antibacterianos. Aquí se describe un ensayo sensible para Lnt que es compatible con el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas inhibidoras. La enzima y los sustratos son moléculas incrustadas en la membrana; Por lo tanto, el desarrollo de una prueba in vitro no es sencillo. Esto incluye la purificación de la enzima activa en presencia de detergente, la disponibilidad de sustratos de péptidos alquinos-fosfolípidos y diacilglicerilo, y las condiciones de reacción en micelas mixtas. Además, para utilizar la prueba de actividad en una configuración de cribado de alto rendimiento (HTS), se prefiere la lectura directa del producto de reacción sobre las reacciones enzimáticas acopladas. En este ensayo enzimático fluorométrico, el producto peptídico alquino-triacilado se vuelve fluorescente a través de una reacción de química de clic y se detecta en un formato de placa de múltiples pocillos. Este método es aplicable a otras aciltransferasas que utilizan sustratos que contienen ácidos grasos, incluidos los fosfolípidos y el acil-CoA.

En la reacción Lnt, el ácido graso sn-1 de los fosfolípidos se transfiere a un péptido diacilglicerilo, lo que resulta en un péptido triacilado maduro8. El ensayo Lnt in vitro descrito aquí está diseñado para utilizar fosfolípidos que contienen un ácido graso alquino (alquino-POPE) y FSL-1-biotina como sustratos, lo que resulta en la formación de alquino-FSL-1-biotina. Tras una reacción química de clic con azido-FAM, este producto debe marcarse fluorescentemente y detectarse ...

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Click-Chemistry Based Fluorometric Assay for Apolipoprotein N-acyltransferase from Enzyme Characterization to High-Throughput Screening

Aquí se presenta un ensayo de fluorescencia sensible para monitorear la actividad de la apolipoproteína N-aciltransferasa utilizando péptido diacilglicerilo y alquino-fosfolípidos como sustratos con química de clic.

Ensayo fluorométrico basado en química de clics para la apolipoproteína N-aciltransferasa desde la caracterización enzimática hasta el cribado de alto rendimiento

Lipoproteins from proteobacteria are posttranslationally modified by fatty acids derived from membrane phospholipids by the action of three integral ...

Research

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