Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

نشكر جميع أعضاء مختبر Hippenmeyer على المناقشة ، ومرفق التصوير البيولوجي ، ومرفق علوم الحياة ، ومرفق ما قبل السريرية في IST Austria للحصول على الدعم التقني. وقد دعم هذا العمل الصناديق المؤسسية IST Austria؛ تلقى برنامج Lise-Meitner (M 2416) دعما من صندوق العلوم النمساوي (FWF). تلقت N.A الدعم من صندوق العلوم النمساوي (FWF) Firnberg-Programm (T 1031)؛ تلقت GC الدعم من برنامج الاتحاد الأوروبي للبحوث والابتكار في أفق 2020 بموجب اتفاقية منحة ماري سكودودوسكا - كوري رقم 754411 كزميلة ما بعد الدكتوراه في ISTplus؛ تلقى أ. هـ. الدعم من زمالة الدكتوراه في الأكاديمية النمساوية للعلوم. وقد تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج الاتحاد الأوروبي للبحث والابتكار أفق 2020 (اتفاقية منحة رقم 725780 LinPro) إلى S.H.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

يتم وصف طريقة لاستخدام MADM لتتبع نسب الخلايا من RGPs الفردية في الجسم الحي في القشرة الجديدة النامية. عند دمجها مع TM-غير قابل للتكرير T2، يمكن توقيت أحداث MADM بدقة ، مما يوفر قراءات بصرية نوعية وكمية للغاية لأنماط انقسام الخلايا الجذعية على مستوى الخلية الواحدة. عن طريق المعايرة جرعة من TM تسليمها، في حالة مثالية يمكن الحصول على في المتوسط من استنساخ واحد أقل من واحد في نصف الكرة القشرية، وتوفير فصل المكانية كافية للتمييز بشكل لا لبس فيه استنساخ الفردية. من خلال الحفاظ على سلامة الأنسجة، وهذا الأسلوب يلتقط أيضا المعلومات الأساسية بشأن الموقف، مورفولوجيا، وأرقام الخلايا المطلقة. MADM كاسيت على Chr. 117,11,12,46,56,57, على Chr.7 51, وMM الأصلي في Rosa2647,53,وقد استخدمت59 في دراسات تحليل clonal MADM. عالية الدقة من الخلايا الفردية يوفر نظرة غير مسبوقة في كل من مورفولوجيا والعلاقة التخفي من الخلايا ابنة ويسمح التصوير الحي للخلايا الجذعية المتكاثرة والمستنسخات الناشئة46,52.
العملية القيصرية وتعزيز الجراء لتحليل المستنسخات في النقاط الزمنية بعد الولادة هي خطوة ضرورية وحاسمة في البروتوكول. اعتمادا على الحالة الصحية للسد الحوامل المعالجة TM، قد لا يكون من الضروري إجراء عملية قيصرية. ومع ذلك ، لا يزال من الضروري تربية الجراء مع أم بالتبني ، لأن الأم المعالجة TM قد تواجه مشكلة في المرضعات. لم تلاحظ أي اختلافات في الحاجة إلى تعزيز مع مختلف السائقين CreERT2. يتم الاحتفاظ بخطوط MADM والأمهات الحاضنات على خلفية CD-1 ذاتية. إذا لم تكن العملية القيصرية ضرورية، يمكن إعادة استخدام السد الحامل المعالج TM المستخدم لتوليد الجراء التجريبية للتكاثر التجريبي الإضافي وفقًا لمبادئ 3R (لاحظ أنه لا يمكن القيام بذلك إلا إذا وافقت تراخيص التجارب على الحيوانات على هذه الممارسة). ويمكن استخدام الأمهات الحاضنات لرعاية الجراء في غضون يومين بعد الولادة، ولكن لوحظت معدلات نجاح أعلى عندما تلد الأمهات الحاضنات في نفس اليوم الذي تلد فيه الفئران التجريبية التي يجب تعزيزها. ولذلك، من المهم إعداد التزاوج في الوقت المناسب للأمهات الحاضنات بالتوازي مع التزاوج التجريبي في الخطوة 1-1. ويمكن للحفاظ على عدد مماثل من القمامة مثل القمامة الأم الحاضنة الأصلية تحسين معدل البقاء على قيد الحياة من الجراء برعاية، وبالتالي إزالة بعض إلى كل من القمامة الأصلية قد يكون من الضروري. وتشمل الخطوات الإضافية التي قد تحسن من تعزيز فرك قفازات المجرب مع القمامة والغذاء (لإزالة رائحة القفازات)؛ فرك الجراء بلطف بعد العملية القيصرية مع شظايا من القمامة الأم الحاضنة متسخة وعش; ووضع الجراء على اتصال وثيق مع الجراء الأم بالتبني قبل وضعها في قفص الماوس بالتبني.
كما هو الحال في أساليب تتبع النسب الأخرى المستندة إلى المراسلين ، يجب أخذ الاعتبار الدقيق عند اختيار برنامج تشغيل CreERT2 الأمثل للتجارب المنعزلة MADM. أولاً، يجب على المروج المستخدم التعبير عن إعادة التركيب الزمني والمكاني في السكان السلف الذين ينهمون. العثور على هذا المروج يمكن أن يكون تحديا، لأن بعض المروجين قد تغير أنماط التعبير أو تصبح صامتة في مراحل مختلفة من التنمية. لتحسين نوع الخلية خصوصية متعددة موقع محدد recombinases ، كل مدفوعة من قبل المروجين منفصلة ، وقد استخدمت. عندما يتم التعبير عن واحد أو كليهما في نفس الخلية، وهذا التسمية الخلية وذريتها مع مراسل الفلورسنت74،75،76،77. باختصار، من المهم اختيار برنامج تشغيل CreER T2 الذي هو محدد إلى عدد السلف التي يتم تحليلها.
الخطوة الأكثر أهمية في هذا الأسلوب هو تعريف استنساخ لأنه يجب أن تكون كافة الخلايا مشتقة بشكل لا لبس فيه من حدث إعادة تجميع واحد (الخطوة 8.1). المعايرة من تركيز TM يضمن أقل من مجموعة واحدة من الخلايا الحمراء / الخضراء في نصف الكرة الدماغي ويزيد من احتمال تحليل استنساخ واحد (الخطوة 2.2)7،11. وينبغي التخلص من المستنسخات في حالة حدوث مجموعات مجاورة من الخلايا داخل 500 ميكرومتر من استنساخ الفائدة. لذلك، من المهم فحص عدة مقاطع قبل وبعد ظهور استنساخ للتأكد من أن هناك أية أحداث إعادة اشوب إضافية في مكان قريب. بسبب ضعف إشارة الفلوروفوروريس، من الضروري إجراء الكيمياء المناعية لـ eGFP وtdT في المستنسخات الجنينية (انظر القسم 6). ويوصى بذلك فقط في المستنسخات البالغة إذا كانت المستضدات الإضافية ستكون كولايغن. عند استنساخ التصوير ، من المهم التقاط العرض الكامل للقشرة حيث يوجد الاستنساخ (أي ، من سطح بيجال إلى الكلوسوم ؛ انظر الخطوة 8.4) لعدم تفويت أي خلايا. وهذا أيضا يسهل محاذاة الصورة أثناء معالجة الصور (القسم 9). يتطلب القسم 8 من البروتوكول مجهرًا مقلوبًا ولكن يمكن تكييفه اعتمادًا على إعداد المجهر المتاح. يمكن استخدام المجهر Epifluorescence ، ولكن ينصح بالمجهر confocal لأن هذا يؤدي إلى انخفاض في التلوث الضوئي من خارج الطائرة التركيز. من المهم أيضا أن يتم تعديل كثافة الليزر ومكسب بحيث يمكن تحديد الخلايا الخضراء والأحمر والأصفر بشكل لا لبس فيه. بغض النظر عن الإعداد، فمن المستحسن استخدام هدف لا يقل عن 20x لضمان الفصل المكاني الكامل للخلايا في وضع وثيق. بالإضافة إلى تسجيل العمق القشري لجميع الخلايا (الخطوة 8.6)، يجب تحديد المناطق القشرية التي توجد فيها المستنسخات باستخدام أطلس الدماغ مثل أطلس العقل ألين أو خرائط تنسيقية مجسمة أخرى. وينبغي أيضا أن يتم اعتماد نموذج تسمية الملف للتأكد من صور استنساخ يمكن التعرف عليها بسهولة. ويمكن تضمين المعلومات التالية في تسمية الملف: معرف صورة فريدة من نوعها، تم التقاط صورة التاريخ، النمط الجيني للحيوان، عمر الحث، عمر التحليل، رقم الصورة بالنسبة لبقية الصور من نفس استنساخ.
إدخال من الطفرة لكسر واحد MADM يسمح بشكل مميز لتوليد الفسيفساء الوراثية71 ويسمح تشريح المنظمين الجزيئية من النسب وتنوع نوع الخلية في المستوى التخفي7,11,46,62. لتوليد فسيفساء وراثية مع MADM، يجب أن تكون مرتبطة meiotically الكاسيت إلى نفس الكروموسوم الجين من الفائدة (انظر الشكل 2 لنظام التربية). وهذا يحد من التحليل الدونالي الحالي مع MADM إلى الجينات الموجودة على Chr.7 51, Chr. 1146, Chr. 1251, وChr. 6 distals إلى 47 12. 47 وسوف تستخدم الدراسات المستقبلية أشرطة MADM التي تستهدف أي كروموسوم، مما يسمح بتحليل الفسيفساء لجميع جينات جينوم الماوس تقريبا على المستوى السفلي.
وأخيرا، لا يقتصر MADM على تحليل الخلايا السلف في القشرة الجديدة النامية. ويمكن أن تستفيد دراسة العديد من محاريب الخلايا الجذعية من القدرة على حل الترتيبات الزمانية للزشاء للخلايا ذات الصلة بالكلون. من خلال تطبيق MADM على مناطق أخرى من الدماغ، حالات المرض (على سبيل المثال، السرطان)، أو في الأنسجة الأخرى47،,50،,51،,52،,53،,,55،,56،,57،,58،59، كشفت الدراسات علاقات النسب في استنساخ مشتقة من فئات متنوعة من السلف والخلايا الجذعية (انظر الجدول 1 للحصول على القائمة الحالية للدراسات المُزخرِجة).55 آخر تطبيق مهم في المستقبل من MADM هو الجمع بين ذلك مع المراسلين وظيفية أو دون الخلوية إضافية، والتي من شأنها أن تزيد من درجة المعلومات التي يمكن الحصول عليها من المستنسخين.

القشرة الدماغية هي بنية منظمة للغاية تتألف من ست طبقات متميزة. القشرة تحتوي على مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا بما في ذلك الخلايا العصبية وglia، والتي تتفاعل لتشكيل الدوائر العصبية الوظيفية. معظم, إن لم يكن كل, الخلايا العصبية الإسقاط القشرية excitatory وglia مشتقة من مجموعة مشتركة من الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) المعروفة باسم السلفايلي شعاعي (RGPs)1,2,3. يتم اشتقاق RGPs أنفسهم من الخلايا الجذعية العصبية (NESCs) التي تؤلف العصبية الجنينية المبكرة. قبل يوم الجنين 9 (E9) في الفئران، تبدأ NESCs للانتقال إلى RGPs4. RGP تطور النسب يتطلب تنظيما زمنيا ومكانيا دقيقا، وعندما يتم إعاقة هذه العملية، والاضطرابات العصبية الشديدة مثل megalencephaly، microcephaly، lissencephaly، أو العاهات مثل الفصام والتوحد يمكن أن يؤدي5،,6. في E10، تخضع معظم RGPs انقسامات تكاثرية متناظرة، مما يؤدي إلى توسع بركة السلف العصبي4،7. تبدأ RGPs في نهاية المطاف في الانقسام بشكل غير متماثل ، مما ينتج الخلايا العصبية الإسقاط القشرية بطريقة محددة زمنيًا. من خلال موجات متتالية من تولد الخلايا العصبية العصبية, الخلايا العصبية حديثي الولادة تهاجر في لوحة القشرية تشكيل اللعم القشرية مع الخلايا العصبية المولودة في وقت مبكر تحتل طبقات عميقة والخلايا العصبية المولودة في وقت متأخر المقيمين في طبقات سطحية8,,9,,10. لأن الخلايا العصبية الهرمية ذات الصلة كلونالي تهاجر شعاعي في القشرة مع تشتت عرضية قليلا جدا، خلايا ابنة تميل إلى تشكيل عمود أو هيكل مخروط على شكل المشار إليها باسم وحدة شعاعية الخلايا العصبية4,11,12,13. بواسطة E17، توسع عصبي الجنيني كامل في الفئران14. يمكن أيضا إنتاج RGPs الخلايا ependymal وبعض فئات من glia، بما في ذلك الفلكيات و oligodendrocytes1،15،16،17،18،19. إمكانات RGPs لتعطي على حد سواء الخلايا العصبية والخلايا الفلكية ويبدو أن تكون متسقة عبر جميع المناطق القشرية18, مع ما يقرب من 1/6 من RGPs العصبية أيضا إنتاج glia11.
وفي الوقت الراهن، فإن العوامل الوراثية والوراثية اللاجينية التي تنظم التطور الزمني للخلايا الجذعية على طول نسبها غير معروفة في معظمها. قد يكون للأنماط الزمنية للتعبير الجيني تأثير كبير على قرارات النسب في RGPs20،21،22،23،24. كيف لا تعرف هذه العلاقة المتماسكة بإحكام بين النقش الزماني والمكاني إلى التنوع الجزيئي لأنواع الخلايا العصبية البالغة عبر المناطق القشرية. وبالمثل، فإن كيفية تعديل إمكانات الخلايا الجذعية الفردية وإخراجها الخلوي على المستوى الخلوي والجزيئي هو سؤال مهم لم تتم الإجابة عليه. ومن المأمول أن تتناول الدراسات المستقبلية بعض هذه الأسئلة، مما يوسع فهمنا في نهاية المطاف لتشكيل الدائرة القشرية الوظيفية.
يسعى علم الأعصاب التنموي إلى فهم علاقة النسب التي تشترك فيها الخلايا في الدماغ مع بعضها البعض. في البداية، كانت أدوات البحث قليلة جدا المتاحة لهذا، والعديد من الدراسات المبكرة تعتمد على الملاحظات البصرية من أنماط الانقسام في الكائنات الحية الشفافة مثل Caenorhabditis elegans25. شهدت العقود الأخيرة زيادة كبيرة في عدد وتطور التقنيات المتاحة13،26،27،28،29. ظهور CRISPR-Cas9 نظام تحرير الجينوم يسمح لإعادة بناء الاصطناعية للعلاقات نسب الخلية من خلال إدخال الباركود DNA المتطورة27,30. مثالان حديثان على استراتيجيات الباركودينغ تشمل استخدام توجيه الجيش الملكي النيبالي الذي يوجه CRISPR-Cas9 إلى loci الباركود الحمض النووي محددة أو cytidine deaminase تنصهر مع نيكاز Cas9 لاستهداف المناطق تكرار تتخللها الذاتية31,32. توفر هذه التقنيات نهجًا متعددة للغاية من خلال إدخال الباركود الذي يتراكم بشكل تدريجي ومطرد طفرات فريدة مع مرور الوقت. ونُهج تحرير الجينوم ذات قيمة عالية لأنها تسمح بالتحليل بأثر رجعي للعلاقة بين أي خليتين استناداً إلى الميراث المشترك لهذه الباركود. ومع ذلك، من أجل قراءة الباركود في الخلايا الفردية، يجب عادة أن تتعطل الأنسجة، وبالتالي يتم فقدان المعلومات المتعلقة الموقف، مورفولوجيا، وأرقام الخلايا المطلقة من السلف الفردية.
النماذج الملصقات الجمعية الحفاظ على المعلومات المكانية، ومن حيث المبدأ تسمح أيضا للتمييز بين النسخ المترجمة بشكل وثيق أو حتى المتداخلة33,34. لطريقة تتبع النسب لتكون مفيدة يجب أن تسمية النسل الفردية وانسلهم بطريقة متفرقة ولا تمحى. وتجدر الإشارة إلى أن Brainbow35 وقصاصة36،37 نهج استخدام المراسلين متعدد الألوان القائم على Cre المؤتلف الذي يعبر عن مزيج من البروتينات الفلورية من موضع واحد. العدد الواسع من تركيبات الألوان المتزامنة التي يمكن تحقيقها في الجسم الحي تجعل هذه أداة قوية عند تتبع مستنسخات RGP القشرية و34. كما تم تطوير الأنظمة القائمة على Transposon توفير التكامل الجينومي المستقر من transgenes ترميز المراسلين الفلورسنت والسماح النسب تتبع السلف القشرية33,38,39,40,41. نظم transposon القائم على ميزة إضافية في أن المراسل يبني اندماج ثابت في الجينوم، وبالتالي تسمية موثوق بها بالخلايا ابنة ذات الصلة خط. لتتبع أنساب astrocyte على وجه التحديد، وقد تم تطوير عدد من الأساليب التي تنطوي على electroporation من نايغباك transposases بما في ذلك Star Track، والذي يجعل من استخدام مزيج من الانشاءات ترميز البروتينات الفلورية المختلفة40،42. نهج آخر، علامات MAGIC، يقدم ناقلات Brainbow كما transgenes القابلة للناقل. وقد تم استخدام هذا بنجاح لتتبع الجنينية العصبية وprogenitors استروسيت34,43. في الآونة الأخيرة، تم العثور على تحليل الفسيفساء عن طريق تبادل الكاسيت المزدوج بوساطة إعادة الكومبينز (MADR) لتسمية الخلايا المتحولة بشكل ثابت التعبير عن عناصر المعدلة وراثيا من loci الكروموسومات محددة بدقة44. وقد وفرت هذه قوية في تقنيات وضع العلامات الجمعية vivo العديد من الأفكار في ديناميات النسب من الخلايا السلف. ومع ذلك، يتم إجراء هذه التحليلات على أنسجة ثابتة، مما يوفر لقطة من المستنسخات الفردية في مرحلة نمو محددة. من أجل مراقبة التغيرات في ديناميات النسب من استنساخ واحد مع مرور الوقت، المزمنة في تقنيات التصوير الجسم الحي مماثلة لتلك التي أجريت في gyrus دنت الكبار تحتاج إلى تطبيق45.
تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة (MADM) هو قوي مزدوج اللون طريقة وضع العلامات التي تمكن في نسب الجسم الحي تتبع الخلايا السلف الفردية في الفئران46،47. هناك عنصران ضروريان لحدوث أحداث وضع العلامات على MADM: أولاً، يجب أن تكون أشرطة MADM موجهة إلى مكان متطابق على الكروموسومات المتماثلة. تتكون الكاسيتات من جينتين مراسلين من نوع chimeric fluorescent، eGFP (الأخضر، [G]) وطماطم الخافتة جنبا إلى جنب (أحمر، tdT[T]). يحتوي الكاسيت GT على N-terminus eGFP وC-terminus من tdT، مفصولة بـ intron يحتوي على موقع loxP. تم بناء كاسيت TG عكسياً، مع ن-هد من tdT وC-هدفينوس من eGFP. ثانياً، إن التعبير عن إعادة التضمين في الخلية نفسها التي تحتوي على أشرطة MADM المستهدفة أمر ضروري. في غياب Cre، لا تعبر أشرطة الأحرف الشيمية عن eGFP الوظيفية أو tdT لأن تسلسلات الترميز الخاصة بها معطلة. مواقع اللوكسب بمثابة الهدف لإعادة التركيب المشترك بوساطة الكري، مما يؤدي إلى إعادة تشكيل كل من شرائط التعبير في وقت واحد. إذا حدث إعادة التعبئة أثناء مرحلة G2 من دورة الخلية متبوعة بالعزل X (G2-X)، فإن الخلايا اللتين تُرتِب كل منهما عن أحد البروتينات الفلورية. التنظيم الزمني لنشاط CreERT2 باستخدام تاموكسيفين (TM) يوفر معلومات دقيقة عن تاريخ ميلاد مستنسخات MADM وأنماط تقسيم ذريتها (الشكل 1A)29،46،47.
يمكن MADM يحتمل أن التسمية بشكل منهجي استنساخ الفردية مع ارتفاع دقة خلية واحدة في الدماغ الماوس مماثلة لأساليب تقليدية ولكن غير محددة وشاقة مثل Golgi تلطيخ48 أو صبغ ملء49. لأن المروج فقط القيادة CreERT2 يحدد نوع الخلية خصوصية التسميات MADM clonal، يمكن من حيث المبدأ أن تطبق لMMAD تتبع النسب التخفي في جميع أنحاء أي عضو مورين والأنسجة47،50،51،52. في الواقع، وقد استخدمت الدراسات بالفعل MADM للكشف عن علاقات النسب في استنساخ المستمدة من الأنسجة المتنوعة47،50،51،52،53،54،55،56،57،58،59. وقد تم تطبيق ماد النماذج التجريبية لدراسة النسب في الخلايا العصبية الإسقاط القشرية, جليا, والخلايا الجذعية بعد الولادة في تطور القشرة الجديدة7,,11,,12,,46,,60, 61,,6162,,,63,,64,,65. كما تم استخدام MADM لدراسة نسب الخلايا في الجيروسكوبات البالغة ، والمهاد ، وخلايا حبيبات cerebellar ، و interneurons على مستوى التخفي (انظر الجدول 1 للحصول على قائمة كاملة)47،53،54،56،57،66.
ومن السمات الفريدة لماد هي القدرة على ربط وراثيا الطفرات فصاطفة إلى واحد MADM كاسيت، وبالتالي خلق الفسيفساء الوراثية(الشكل 1B والشكل 2). هذا يؤدي إلى نوع البرية خلايا الابنة المسمى مع علامة فلورية واحدة (tdT في الشكل 1B)والأشقاء متحولة homozygous مع الآخر (eGFP في الشكل 1B)في بيئة غير مسمى heterozygous. MADM هي فريدة من نوعها في أن التحليل المقارن للسيطرة وsclones متحولة يمكن أن يؤديها في نفس بيئة الأنسجة في الجسم الحي. في الأصل، تم استهداف أشرطة MADM في موضع Rosa26 47، ولكن تحليل MADM لوظيفة الجينات كان يقتصر على الجينات منفصة إلى موضع. للتغلب (على الأقل جزئيا) هذا القيد وتوسيع إمكانيات التحليلات الجينية التي تستند إلى MADM، تم طرق أشرطة مادم في ما يقرب من تينتروميرس من Chr. 751, Chr. 1146, وChr. 1251. إن استهداف جميع الماوس 19 autosomes مع أشرطة MADM قيد التنفيذ وسيتيح دراسة أي جين تقريبًا في المستقبل ، مما يوفر منصة لا مثيل لها لدراسة علاقات النسب التنموية بالاقتران مع التحليل الجيني الوظيفي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

بدءا من مجموعة محدودة من السلف، والقشرة الدماغية الثدييات تشكل دوائر عصبية وظيفية منظمة للغاية. ومع ذلك، فإن الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية التي تنظم انتقالات النسب للخلايا الجذعية العصبية (NSCs) وإنتاج الخلايا العصبية والجليا في الخلايا العصبية النامية لا تزال غير واضحة. وقد تقدمت أساليب تتبع أنماط تقسيم NSC وخريطة نسب الخلايا المرتبطة بالكلونالي بشكل كبير. ومع ذلك ، العديد من تقنيات تتبع النسب المعاصرة تعاني من عدم وجود القرار الخلوية من الخلية السلف مصير ، وهو أمر ضروري لفك أنماط تقسيم الخلية السلف. قدم هو بروتوكول باستخدام تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة (MADM) لأداء في تحليل clonal الجسم الحي. MADM يتلاعب في الوقت ذاته الخلايا السلف الفردية وتصورات أنماط التقسيم الدقيقة وتطور النسب في قرار خلية واحدة لم يسبق لها مثيل. MADM القائم على أحداث إعادة التركيب بين الكومبوسومات خلال مرحلة G2-X من الانقسام، جنبا إلى جنب مع غير قابل للتكرير زمنيا T2،وتوفير معلومات دقيقة عن تواريخ ميلاد المستنسخين وأنماط تقسيمها. وهكذا، فإن تتبع نسب MADM يوفر قراءات بصرية نوعية وكمية غير مسبوقة لأسلوب انتشار ذريات الخلايا الجذعية على مستوى الخلية الواحدة. كما يسمح MADM بفحص الآليات والمتطلبات الوظيفية للجينات المرشحة في تقدم نسب NSC. هذه الطريقة هي فريدة من نوعها في أن التحليل المقارن للسيطرة و subclones متحولة يمكن أن يؤديها في نفس بيئة الأنسجة في الجسم الحي. هنا ، يتم وصف البروتوكول بالتفصيل ، ويتم عرض نماذج تجريبية لتوظيف MADM للتحليل التخفي وتتبع النسب في قشرة الدماغ النامية. الأهم من ذلك، يمكن تكييف هذا البروتوكول لأداء تحليل MADM clonal في أي المتخصصة الخلية الجذعية مورين، طالما أن سائق T2 CreER موجود.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

يتم تقديم بروتوكول لتنفيذ تتبع النسب والتحليل الجيني الوظيفي للجينات المرشحة على مستوى خلية واحدة باستخدام تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة (MADM). يوفر تحليل MADM التخفي إطارًا كميًا لقياس السلوك التكاثري ، والإخراج الخلوي ، وعلاقة النسب بين السلف الفردية وخلايا ابنتهم.

تتبع النسب وتحليل التخفي في تطوير قشرة الدماغ باستخدام تحليل الفسيفساء مع علامات مزدوجة (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

تحليل الفسيفساء مع التكنولوجيا علامات مزدوجة هو وسيلة قوية التي يمكن أن توفر معلومات كمية للغاية حول سلوك الانتشار والمخرجات قبو من الخلايا الجذعية الأفراد. وهناك سمة فريدة من هذه التقنية، هو أنه يسمح تتبع النسب والتحليل الوراثي الوظيفي للجينات المرشحة في الخلية الموحدة level.demontrating إلى الإجراء سيكون، كارمن Streicher، فني الخاص بك، نيكول Amberge، ما بعد doc، Gisselle تشيونغ، ما بعد وثيقة وأندي هانسن، وهو طالب دكتوراه من مختبري. للحث على أحداث إعادة الدمج MADM في الفئران التجريبية، استخدم حقنة 1 مل مجهزة بإبرة قياس 25 لتقديم حقنة واحدة من تاموكسيفين Intraperitoneal في سد موقوت إلى سد الحوامل. من تحليل MADM التخفي إلى نقاط وقت ما بعد الولادة. في الأيام الجنينية 18 إلى 19، ضع فأرة حامل في موضع الوبين وطهر الفراء بنسبة 70٪ الإيثانول. إجراء شق صغير في الجلد في أسفل البطن فوق الرحم وإجراء شق ثان من خلال العضلات وجدار العضلات البطن للكشف عن الصفاق. استخدم المقص لفصل الرحم عن الأنسجة المحيطة ووضع الرحم السليم في قفاز مع الماء الدافئ. ثم استخدم مقص التلميح والأصابع الجميلة لفتح جدران الرحم بعناية لإطلاق الأجنة. تنظيف الجراء بلطف الضغط على الصدور من وقت لآخر لبدء التنفس قبل نقل الحيوانات قبل الولادة إلى الأم بالتبني. لجمع الأنسجة المستنسخة العصبية MADM مكان تخدير في موقف supine على علبة جراحة الضخ وتطهير الفراء مع 70٪ الإيثانول. استخدم المقص والملقط لإجراء شق واحد من خلال الجلد وشق واحد من خلال طبقة العضلات. عندما يكون تجويف الصدر مرئيًا ، شم ورفع الحجاب الحاجز للكشف عن القلب وتقليم القفص الصدري بعناية ودبابيسه إلى tray.insert الجراحية إبرة متصلة بمواسير مضخة مُطَدَّقة بـ PBS في البطين الأيسر السفلي من القلب واستخدام مقص قزحية صغيرة لإجراء شق في الطرف الخلفي من الأذين الأيمن. Perfuse نظام القلب والأوعية الدموية مع برنامج تلفزيوني تليها مباشرة من قبل perfusion مع الجليد الباردة الطازجة أعدت 4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني. عندما يكون الضخ كاملًا ، قم بإزالة الدماغ من خلال تشريح دقيق ووضع العضو المقطوع في ما لا يقل عن خمسة أضعاف حجم الدماغ من 4٪ paraformaldehyde الطازجة بين عشية وضحاها في 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

والخلايا العصبية ونجمية المشارك الثقافة الفحص لتحليل محتوى عال من العصبية

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

تحليل مزدوج الجديلة إصلاح الحمض النووي (DSB) فاصل في خلايا الثدييات

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

تحليل الفاكهة المتطايرة باستخدام الأنف الالكتروني

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

التصور والتحليل من جزيئات الرنا المرسال عن طريق الإسفار<em&gt; في الموضع</em&gt; التهجين في<em&gt; خميرة الخباز</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

سريعة وفعالة الزرد التنميط الجيني باستخدام PCR عالية الدقة مع تحليل نذوب

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

تحليل الالتهام الذاتي في<em&gt; البنسليوم العسجدية</em&gt; باستخدام التجويع وسادات في تركيبة مع المجهر مضان

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

مقايسة الامتصاص الكولسترول استخدام الخلايا الحية التصوير التحليل مع خلية المراقبة الصحية

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...