Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer af Hippenmeyer-laboratoriet for diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility hos IST Austria for teknisk support. Dette arbejde blev støttet af IST Austrias institutionelle fonde. R.B. modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A modtog støtte fra Den Østrigske Videnskabsfond (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC modtog støtte fra Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram horisont 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskudsaftalen nr. A.H. modtog støtte fra en ÖAW DOC (ph.d.-stipendiat ved det østrigske videnskabsakademi). Denne undersøgelse blev også støttet af Det Europæiske Forskningsråd (ERC) under Den Europæiske Unions forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 (tilskudsaftale nr. 725780 LinPro) til S.H.

Forfatterne har intet at afsløre.

En metode til at bruge MADM til at spore celle afstamning af de enkelte RGI'er in vivo i udviklingslandene neocortex er beskrevet. Når madm-hændelser kombineres med TM-inducerelige CreERT2,kan de være præcist timede, hvilket giver en meget kvalitativ og kvantitativ visuel udlæsning af stamcelledelingsmønstre på enkeltcelleniveau. Ved at titrere den leverede dosis TM kan der i en ideel situation opnås et gennemsnit på mindre end én klon pr. kortikale halvkugle, hvilket giver tilstrækkelig rumlig adskillelse til entydigt at skelne mellem individuelle kloner. Ved at opretholde vævsintegritet, denne metode også indfanger væsentlige oplysninger om position, morfologi, og absolutte cellenumre. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den oprindelige MADM på Rosa2647,53,59 er blevet anvendt i MADM klonale analyseundersøgelser.56 De enkelte cellers høje opløsning giver et hidtil uset indblik i både morfologi og dattercellernes klonale forhold og muliggør levende billeddannelse af prolifererende stamceller og nye kloner46,52.
Kejsersnit og fremme af hvalpe til analyse af kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendigt og kritisk skridt i protokollen. Afhængigt af sundhedstilstanden af DEN TM-behandlede drægtige dæmning, kan det ikke være nødvendigt at udføre en kejsersnit. Men, hæve hvalpene med en plejemor er stadig påkrævet, fordi TM-behandlede mor kan have problemer med at ammende. Der er ikke konstateret forskelle i behovet for at fremme med forskellige CreERT2-chauffører. Både MADM linjer og plejemødre opretholdes på en outbred CD-1 baggrund. Hvis kejsersnit ikke er nødvendigt, kan den TM-behandlede drægtige moderdyr, der anvendes til at generere forsøgshvaler, genbruges til yderligere forsøgsavler i overensstemmelse med principperne i 3R (bemærk, at dette kun kan ske, hvis dyreforsøgslicenser godkender denne praksis). Foster mødre kan bruges til at fremme hvalpe inden for 2 dage efter fødslen, men højere succesrater er blevet observeret, når plejemødre føder på samme dag som de eksperimentelle mus, der skal fremmes. Derfor er det vigtigt at oprette tidsfornemmte parringer for plejemødre parallelt med forsøgs parret i trin 1.1. Fastholdelse af en lignende kuld nummer som den oprindelige plejemors kuld kan forbedre overlevelsesraten for plejet unger, og derfor fjernelse af nogle til alle de oprindelige kuld kan være nødvendigt. Yderligere trin, der kan forbedre fremme omfatter gnide eksperimentatorens handsker med strøelse og mad (for at fjerne duften af handsker); gnide hvalpene forsigtigt efter kejsersnit med fragmenter af plejemoderens snavsede kuld og rede; og placering af ungerne i tæt kontakt med pleje moderens unger forud for deres placering i plejemus buret.
Som i andre reporter-baserede afstamning sporing metoder, skal nøje overvejes, når du vælger den optimale CreERT2 driver til MADM klonale eksperimenter. For det første skal den anvendte promotor udtrykke rekombinen både tidsmæssigt og rumligt i den interesse forkomspopulation. Det kan være en udfordring at finde denne initiativtager, fordi nogle initiativtagere kan ændre udtryksmønstre eller blive bragt til tavshed på forskellige udviklingsstades. For at forbedre celletypespecikiteten er der blevet anvendt flere stedspecifikke rekombiner, der hver især drives af separate initiativtagere. Når den ene eller begge rekombiner udtrykkes i samme celle , mærker denne cellen og dens afkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Sammenfattende er det vigtigt at vælge en CreERT2 driver, der er specifik for befolkningen af stamfødder bliver analyseret.
Det mest kritiske trin i denne metode er identifikationen af en klon, fordi alle celler skal udledes utvetydigt af en enkelt rekombinationshændelse (trin 8.1). Titrering af TM-koncentration sikrer mindre end én klynge af røde/grønne celler pr7,. Kloner bør kasseres, hvis tilstødende klynger af celler forekommer inden for 500 μm fra klonen af interesse. Derfor er det vigtigt at undersøge flere afsnit før og efter fremkomsten af en klon for at sikre, at der ikke er yderligere rekombinationshændelser i nærheden. På grund af svagere signal fra fluorophorerne er det nødvendigt at udføre immunhistokemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se afsnit 6). Dette anbefales kun til voksne kloner, hvis yderligere antigener vil blive kolmærket. Når billedkreptiske kloner, er det vigtigt at fange hele bredden af cortex, hvor klonen er placeret (dvs. fra pial overflade til corpus callosum; se trin 8.4) for ikke at gå glip af nogen celler. Dette letter også billedjusteringen under billedbehandling (afsnit 9). Afsnit 8 i protokollen kræver et omvendt konforosset mikroskop, men kan tilpasses afhængigt af det tilgængelige mikroskopopsætning. Epifluorescensmikroskopi kan anvendes, men konfokal mikroskopi anbefales, fordi dette fører til et fald i lysforurening udefra fokusplanet. Det er også vigtigt, at laserintensiteten og forstærkningen justeres, så grønne, røde og gule celler entydigt kan identificeres. Uanset opsætningen anbefales det at bruge et mål på mindst 20x for at sikre fuld rumlig adskillelse af tæt placerede celler. Ud over at registrere den kortikale dybde af alle celler (trin 8.6) skal kortikale områder, hvor klonerne er placeret, identificeres ved hjælp af et hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxiske koordinatkort. En fil navngivning paradigme bør også vedtages for at sikre klon billeder er let identificerbare. Følgende oplysninger kunne indgå i navnet på filen: unikt billed-id, dato billede blev taget, genotype af dyr, alder induktion, alder af analyse, billednummer i forhold til resten af billederne fra samme klon.
Indførelse af en mutation distalt til en MADM kassette karakteristisk tillader generering af genetiske mosaikker71 og tillader dissektion af molekylære regulatorer af afstamning og celletype mangfoldighed på klonaleniveau 7,11,46,62. For at generere en genetisk mosaik med MADM skal MADM-kassetterne være meiotisk forbundet med det samme kromosom som det interessenske gen (se figur 2 for avlsordningen). Dette begrænser den nuværende klonale analyse med MADM til gener placeret på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige undersøgelser vil bruge MADM kassetter målrettet til ethvert kromosom, tillader mosaik analyse af stort set alle gener af musen genom på klonale niveau.
Endelig er MADM ikke begrænset til analyse af stamceller i den udviklende neocortex. Undersøgelsen af mange stamcellenicher kunne drage fordel af evnen til at løse spatiotemporal arrangementer af klonalt beslægtede celler. Ved at anvende MADM på andre områder af hjernen, sygdomssygdomme (f.eks. kræft) eller i andrevæv 47,,50, 51,51,52, 53,54,55,55,56,57,58,59, undersøgelser afslørede afstamningsrelationer hos kloner, der stammer fra forskellige klasser af stam- og stamceller (se tabel 1 for den aktuelle liste over madm-kloningsundersøgelser). En anden interessant fremtidig anvendelse af MADM er at kombinere det med yderligere funktionelle eller subcellulære journalister, hvilket ville øge graden af information, der kan erhverves fra kloner.

Hjernebarken er en meget organiseret struktur bestående af seks forskellige lag. Cortex indeholder en bred vifte af celletyper, herunder neuroner og glia, som interagerer til at danne funktionelle neurale kredsløb. De fleste, hvis ikke alle, kortikale excitatoriske projektion neuroner og glia er afledt af en fælles pulje af neurale stamceller (NSCs) kendt som radiale glia stamfædre (RGPs)1,2,3. RGPs selv er afledt af neuroepithelial stamceller (NESCs) komponere den tidlige embryonale neuroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) i mus begynder NESC'er at skifte til RGPs4. RGP afstamning progression kræver præcis tidsmæssig og rumlig regulering, og når denne proces er hindret, alvorlige neurologiske lidelser såsom megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funktionsnedsættelser såsom skizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10, de fleste RGPs gennemgå symmetriske proliferative divisioner, hvilket resulterer i en udvidelse af neurale stamfade pool4,7. RGPs i sidste ende begynder at opdele asymmetrisk, producerer kortikale projektion neuroner i en tidsmæssigt defineret måde. Gennem på hinanden følgende bølger af neurogenese, nyfødte neuroner migrere ind i kortikale plade danner kortikal laminae med tidlige født neuroner besætter dybe lag og senfødte neuroner bosat i de overfladiskelag 8,9,10. Fordi klonalt relaterede pyramideformede neuroner migrerer radialt ind i cortex med meget lidt tangential dispersion, datterceller tendens til at danne en kolonne eller kegle formet struktur benævnt en neuronal radial enhed4,11,12,13. Ved E17, embryonale neurogene ekspansion er komplet i mus14. RGPs kan også producere ependymale celler og nogle klasser af glia, herunder astrocytter og oligodendrocytes1,15,,16,17,18,19. RGI'ernes potentiale til at give anledning til både neuroner og astrocytter synes at være konsistent i alle kortikaleregioner 18, hvor ca. 1/6 af neurogene RGPs også producerer glia11.
I øjeblikket er de genetiske og epigenetiske faktorer, der regulerer tidsmæssig progression af en stamcelle langs dens afstamning, for det meste ukendte. Tidsmæssige mønstre for genekspression kan have betydelig indvirkning på lineage beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tæt sammentømrede forhold mellem tidsmæssige og rumlige mønstre fører til den molekylære mangfoldighed af voksne neuronale typer på tværs af kortikale områder vides ikke. Ligeledes er, hvordan det individuelle stamcellepotentiale og dets cellulære output moduleres på celle- og molekylært niveau, et vigtigt ubesvaret spørgsmål. Fremtidige undersøgelser vil forhåbentlig behandle nogle af disse spørgsmål, i sidste ende at udvide vores forståelse af funktionelle kortikale kredsløb dannelse.
Udviklingsmæssige neurobiologi søger at forstå afstamning forholdet, at celler i hjernen deler med hinanden. I første omgang var der meget få forskningsværktøjer til rådighed til dette, og mange tidlige undersøgelser var baseret på visuelle observationer af division mønstre i gennemsigtige organismer såsom Caenorhabditis elegans25. I de seneste årtier er der i de seneste årtier været en dramatisk stigning i antallet og raffinementet af de tilgængeligeteknikker 13,26,27,28,29. Fremkomsten af CRISPR-Cas9-genomredigeringssystemet giver mulighed for syntetisk rekonstruktion af cellelinjerelationer ved at indføre dna-stregkoder, der udviklersig 27,30. To nylige eksempler på stregkodestrategier omfatter brugen af homing guide RNA, der dirigerer CRISPR-Cas9 til specifikke DNA-stregkode loci eller en cytidin deaminase fusioneret med nickase Cas9 at målrette endogene afbrudt gentage regioner31,32. Disse teknologier giver meget multiplekserede tilgange gennem indførelse af stregkoder, der gradvist og stabilt akkumulerer unikke mutationer over tid. Genom redigering tilgange er meget værdifulde, fordi de tillader tilbagevirkende analyse af forholdet mellem to celler baseret på den fælles arv af disse stregkoder. Men for at læse stregkoderne i de enkelte celler, væv normalt skal afbrydes, og derfor oplysninger om position, morfologi, og absolutte celletal fra en individuel stamfader er tabt.
Kombinationsmærkningsparadigme bevarer geografisk information og gør det i princippet også muligt at skelne mellem tæt lokaliserede eller endog overlappendekloner 33,34. For at en afstamningssporingsmetode kan være informativ, skal den mærke de enkelte stamfædre og deres afkom på en sparsom og uudslettelig måde. Især Brainbow35 og Confetti36,37 tilgange bruger stokastiske flerfarvede Cre rekombinering-baserede journalister, der udtrykker en kombination af fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antal samtidige farvekombinationer, der kan opnås in vivo, gør dette til et kraftfuldt værktøj, når du sporer kortikale RGP-kloner ogastrocytter 34. Der er også udviklet transpersoner , der giver stabil genomisk integration af transgenes, derkodner fluorescerende reportere40,og som gør det muligt at spore kortikale forfædre med afstamningaf38,39,kortikale forfædre.33 Transposon-baserede systemer har en ekstra fordel i, at journalisten konstruerer stabilt integrere i genomet, og dermed pålideligt mærke linjeligt relaterede datterceller. For at spore astrocyt slægter specifikt, en række metoder er blevet udviklet, der involverer elektroporation af piggyBac transposases herunder Star Track, som gør brug af en kombination af konstruktioner kodning forskellige fluorescerende proteiner40,42. En anden tilgang, MAGIC markører, introducerer Brainbow vektorer som transposable transgener. Dette er med succes blevet brugt til at spore embryonale neurale og astrocyt stamfader34,43. For nylig, mosaik analyse af dobbelt rekombineret-medieret kassette udveksling (MADR) blev fundet at stabilt mærke mutantceller udtrykker transgene elementer fra præcist definerede kromosomale loci44. Disse kraftfulde in vivo combinatorial mærkning teknikker har givet mange indsigter i afstamning dynamik af stamceller. Disse analyser udføres dog på fast væv, hvilket giver et øjebliksbillede af individuelle kloner på et defineret udviklingsstadiet. For at observere ændringer i enkelte kloners afstamningsdynamik over tid skal der anvendes kroniske in vivo-billeddannelsesmetoder svarende til dem, der udføres i den voksne dentategyrus.
Mosaikanalyse med dobbelte markører (MADM) er en kraftfuld metode til dobbelt farvemærkning , der muliggør in vivo-afstamningssporing af individuelle stamceller imus 46,47. To komponenter er nødvendige for, at MADM-mærkningshændelser kan forekomme: For det første skal MADM-kassetter målrettes mod identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består af to kimære fluorescerende reporter gener, eGFP (grøn, [G]) og tandem dimer Tomat (rød, tdT [T]). GT kassetten indeholder N-endestationen for eGFP og C-endestationen for tdT, adskilt af en intron, der indeholder et loxP-sted. TG kassetten er konstrueret omvendt, med N-endestation af tdT og C-endestation af eGFP. For det andet er det vigtigt at udtrykke Recombinase i den samme celle, der indeholder de målrettede MADM-kassetter. I mangel af Creudtrykker de kimære kassetter ikke funktionelle eGFP eller tdT, fordi deres kodningssekvenser afbrydes. LoxP-stederne tjener som mål for Cre-medieret interkromosom rekombination, hvilket resulterer i rekonstituering af begge udtrykskassetter samtidigt. Hvis der opstår rekombination i G2-fasen af cellecyklussen efterfulgt af X segregation (G2-X), vil de to datterceller hver udtrykke et af de to fluorescerende proteiner. Tidsmæssig regulering af CreERT2-aktiviteten ved hjælp af tamoxifen (TM) giver præcise oplysninger om fødselsdatoen for MADM-kloner og opdelingsmønstrene for deres afkom (figur 1A)29,46,47.
MADM kan potentielt systematisk mærke individuelle kloner med høj enkeltcelleopløsning i musehjernen svarende til traditionelle, men uspecifikke og besværlige metoder som Golgi farvning48 ellerfarvestoffyldning 49. Da det kun er promotoren, der driver CreERT2 , der bestemmer celletypes specificiteten af klonal MADM-mærkning , kan MADM i princippet anvendes til sporing af klonlinjen i alle murineorganer ogvæv 47,50,51,52. Undersøgelser har faktisk allerede anvendt MADM til at afsløre slægtsrelationer hos kloner, der stammer fraforskellige væv 47,50,51,52,53,54,5555,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer er blevet anvendt til at studere afstamning i kortikale projektionsneurner, glia og postnatale stamceller i de udviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM er også blevet anvendt til at studere celleslægte i den voksne dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulatceller og interneurner på klonniveau (se tabel 1 for en komplet liste)47,53,54,56,57,66.
Et unikt træk ved MADM er evnen til at genetisk link mutationer distale til en MADM kassette, og dermed skabe en genetisk mosaik (Figur 1B og Figur 2). Dette resulterer i vilde type datter celler mærket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B) og homozygot mutant søskende med den anden (eGFP i figur 1B) i en ikke-mærket heterozygot miljø. MADM er unik i den sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Oprindeligt, MADM kassetter blev målrettet ind i Rosa26 locus47, men MADM analyse af genfunktion var begrænset til gener distalt for locus. For at overvinde (i hvert fald delvis) denne begrænsning og udvide mulighederne for MADM-baserede genanalyser blev MADM-kassetter slået ind tæt på centromere af Chr. 751, Chr. 1146og Chr. 1251. Målretning alle 19 mus autosomes med MADM kassetter er i gang, og vil give mulighed for stort set ethvert gen, der skal undersøges i fremtiden, hvilket giver en enestående platform for studiet af udviklingsmæssige afstamning relationer i kombination med funktionel genetisk analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Begyndende fra en begrænset pulje af stamfader, pattedyr hjernebarken danner meget organiseret funktionelle neurale kredsløb. Men, de underliggende cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer afstamning overgange af neurale stamceller (NSCs) og eventuel produktion af neuroner og glia i udviklingslandene neuroepithelium er fortsat uklart. Metoder til at spore NSC division mønstre og kortlægge afstamning af klonalt relaterede celler har avancerede dramatisk. Men mange moderne afstamning sporing teknikker lider af manglen på cellulære opløsning af afkom celle skæbne, som er afgørende for dechifrering stamfader celledeling mønstre. Præsenteret er en protokol ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) til at udføre in vivo klonal analyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer præcise divisionsmønstre og afstamningsprogression ved hidtil uset enkeltcelleopløsning. MADM-baserede interkromonomiske rekombinationshændelser under G2-X-fasen af mitose giver sammen med tidsmæssigt inducerende CreERT2nøjagtige oplysninger om klonernes fødselsdatoer og deres divisionsmønstre. Madm lineage sporing giver således hidtil usete kvalitative og kvantitative optiske udlæsninger af spredningsmåden for stamcellesvindere på enkeltcelleniveau. MADM giver også mulighed for undersøgelse af mekanismer og funktionelle krav til kandidatgener i NSC lineage progression. Denne metode er unik i, at sammenlignende analyse af kontrol og mutante subkloner kan udføres i samme vævsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detaljer, og eksperimentelle paradigmer til at ansætte MADM til klonal analyse og afstamning sporing i udviklingslandene hjernebarken er påvist. Vigtigere er det, kan denne protokol tilpasses til at udføre MADM klonal analyse i enhver murine stamcelle niche, så længe CreERT2 driveren er til stede.

MADM resulterer i rekonstitution af funktionelle grønne og røde fluorescerende proteiner med to datterceller, der hver udtrykker et af de to fluorescerende proteiner ved G2-X-kromosomadskillelseshændelser (figur 1A). Da MADM-hændelser resulterer i permanent og tydelig mærkning af de to efterkommere, kan der foretages en kvantificerbar vurdering af grønne og røde dattercelleslæder (subklonner). Variabler, herunder divisionsmønster (f.eks. symmetrisk versus asymmetrisk) og potentiale (f.eks. antallet af afkom) i den oprindelige stamfader, kan bestemmes.  Kvantificering af hvert fluorescerende mærket subklon er informativt, når det med tilbagevirkende kraft afgøres, om den oprindelige stamcelle gennemgår symmetriske proliferative inddelinger eller asymmetriske, neurogene inddelinger på tidspunktet for TM-induktionen. Tidligere undersøgelser grupperede Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 afledte excitatoriske projektionskloner i cortex i to bredeklasser 7,11,46. Den første, kaldet "symmetriske proliferative kloner", er sammensat i gennemsnit af et betydeligt antal neuroner, med både grønne og røde subkloner, der indeholder fire eller flere neuroner hver. Den anden gruppe, "asymmetriske kloner" definerer en klasse af kloner, hvor "mindretal" subklon indeholder færre end tre neuroner og "flertal" subklon, fire eller flere11. Disse definitioner er specifikke for kortikale RGPs og kan være nødvendigt at revidere for andre hjerneregioner og væv. For begge klasser af kortikale kloner, vil afkommet blive fordelt over de overfladiske og dybe lag.
Ved udformningen af MADM-klonale undersøgelser er der en række aspekter, der skal tages i betragtning. Det tidspunkt, hvor MADM-hændelser fremkaldes ved administration af TM, er en vigtig overvejelse (figur 3). For kortikale excitatoriske projektion neuron MADM kloner (dvs. ved hjælp af Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, var næsten alle RGI'er stadig under symmetrisk division11. Derfor, induktion på E10 med TM fanget flere runder af proliferative RGP forstærkning og resulterede i kloner med høje neuron numre. Antallet af RGI'er på E10 var dog generelt lille, og dermed genererede TM-administrationen meget få MADM-hændelser (nogle gange mindre end én pr. hjerne). Størstedelen af RGI'erne skiftede fra symmetriske til asymmetriske neurogene divisioner omkring E12. At målrette strengt asymmetriske neurogene kloner, var det bedst at fremkalde på E12 eller senere (Figur 3). Tiden mellem TM induktion og observation AF MADM-rekombinationshændelser i cortex havde en tendens til at være mindre end 24 h. IP-injektioner var den foretrukne metode til administration af TM på embryonale stadier for denne metode, fordi det førte til større reproducerbarhed ved klonal induktion. Det er også vigtigt at holde TM dosis til et minimum af to grunde. For det første, hvis MADM rekombination sats stiger, sandsynligheden for at fremkalde flere, måske overlappende, kloner er højere. For det andet, hvis for meget TM er leveret, en øget sats af abort, embryo reabsorption, og mindre kuld størrelser kan observeres. Aborter i ca. halvdelen af alle drægtige moderdyr blev observeret, når TM injektioner blev leveret på E10. Denne frekvens faldt fra E11 og fremefter og faldt til ca. 1/3 af drægtige dæmninger, der aborterede. For en oversigt over TM doser, induktion gange, og CreERT2 drivere, der anvendes i tidligere MADM undersøgelser, henvises til tabel 1. Reporter aktivitet i mangel af TM blev observeret med nogle TM-inducerende CreERT2 drivere69. Ektopisk udtryk eller MADM rekombination begivenheder i mangel af TM blev ikke observeret med Emx1-CreERT2 af Nestin-CreERT2 drivere. Dette kan delvis skyldes, at TM-medieret kromosomale trans-rekombinationer forekommer på ca 1:1,000 til 1:10,000 lavere frekvens end cis-rekombinationer, hvilket reducerer sandsynligheden for ektopisk MADM mærkning.
En anden faktor, der skal overvejes, når der planlægges et MADM-analyseanalyseeksperiment, er undersøgelsens varighed. Hvis længden af tiden mellem TM-induktionen og det tidspunkt, hvor forsøget blev analyseret (A ( tidsvindue), varieres, viser stamcelledynamikken overtid 64. Korte embryonale tidsvinduer (dvs. TM/E11-A/E13; TM/E11−A/E16) fangede dynamikken i embryonal neurogenese (Figur 4). Sammenligning af kloner fra to eller flere tidsvinduer giver et kvantitativt indblik i antallet af producerede celler, og hvordan neuronfordelingen varierer på forskellige stadier af afstamningsprogression64. For at fange hele potentialet i de enkelte kloner er det nødvendigt at forlænge tidsvinduet, der analyseres til tidspunkter7,11,12. Eksempler på neokorte kloner, der fremkaldes i embryonet og analyseres hos voksne, er vist i figur 5. Bemærk, kortikal neurogenese er for det meste afsluttet og gliogenese stiger med E17. Ca. 1/6 neurogen RGP fortsætter også med at generere astrocytter og/eller oligodendrocytes11.
Symmetriske kloner opstår , når RSP'er gennemgår en eller flere runder af proliferativ division11. RGP-kloner fremkaldt mellem E10−E12 var i gennemsnit større og gav mere rumlige træk ved den endelige neuronfordeling (figur 4A-C). Kloner med neuroner relativt ligeligt fordelt i dybe og overfladiske lag tog på en "cylinder" form, mens kloner med neuroner mere spredt i overfladiske lag end dybere lag udviklet en "kegle" form11. For fuldt ud at fange de rumlige og morfologiske oplysninger om en klon, var det nødvendigt at beregningsmæssigt rekonstruere hver klon ved hjælp af sekventielle billeder. For at måle klonlig dispersion blev den maksimale laterale dispersion (målt i alle dimensioner) i overfladiske lag (LII−VI) af en klon sammenlignet med neuron dispersion i dybe lag (LV/LIV). Dette forhold (fordeling øvre:fordeling lavere) gav en kvantificerbar udlæsning af den samlede klon form.
Asymmetriske kloner, hvor mindretallets underklude var tre eller mindre, gav indsigt i den neuronale produktion af en enkelt RGP (Figur 4D-F og Figur 5A-F)7,11,12. Størstedelen af populationen (store subklon) kunne mærkes enten i rødt eller grønt med et gennemsnit på ca. syv excitatoriske projektionsneurner pr. klon , når de fremkaldes ved hjælp af en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(figur 5G)7,11,12. Det samlede antal celler i en MADM-klon kan dissekeres yderligere ved at analysere fordelingen af neuroner i den store underklon på tværs af overfladiske og dybe lag. Minoritetspopulationen (lille underklon) var mærket med den gensidige farve og var i gennemsnit 1-2 celler pr. klon (figur 5H). Den samlede "enhedsstørrelse", som i gennemsnit var 8−9 neuroner, kunne beregnes ved at lægge de små og store subkloner sammen (figur 5I)7,11,12. Det er vigtigt at bemærke, at mens den neuronale produktion af RGI'er var meget forudsigelig, var der en grad af klonal heterogenitet12,70.
Indførelse af en mutation distalt til MADM kassetten gør det muligt at generation af genetiske mosaikker, hvilket giver en unik metode til at dissekere de molekylære regulatorer af stamcellelinage progression. Som sådan, MADM giver en enestående eksperimentel platform til at studere celle-autonome funktion af et gen (f.eks dens tilknytning til microcephaly eller macrocephaly). Ved at sammenligne kloner induceret i en MADM genetisk mosaik til kloner induceret i en kontrol MADM, en yderst kvantitativ udlæsning af ændringer i neuron numre og fordeling kan genereres. Tidligere MADM-baserede undersøgelser kvantificerede otx1's celle autonome funktion ved mikrocephalydannelse på klonniveau (se figur 6A-E for et repræsentativt eksempel)11. I en anden undersøgelse, MADM klonale analyse viste, at NDEl1 ikke celle-autonomt regulere projektion neuron numre, men i stedet evne til nyfødte neuroner til at komme ind eller migrere inden for kortikale plade, som senere danner den voksne cortex46. Disse undersøgelser viste den meget kvantitative karakter af MADM klonale analyse i at studere de celle-autonome funktioner af gener, der regulerer kortikal udvikling. Der er i øjeblikket ingen eksempler i litteraturen ved hjælp af MADM til at studere gener impliceret i makrocephaly på klonale niveau. Men i fremtidige undersøgelser kan analyse af gener, der er relevante for kontrollen af kortikal størrelse i almindelighed, give meget ønskværdig indsigt på molekylært og cellulært niveau.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig1.jpg"> Figur 1: MADM-princippet for afstamningssporing og klonanalyse på enkeltstamcelleniveau. (A) For at udføre afstamningssporing og klonal analyse med MADM, skal der være to komponenter til stede. For det første skal MADM kassetter målrettes til identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består af to kimære fluorescerende reporter gener, eGFP (grøn, [G]) og tandem dimer Tomat (rød, tdT [T]). GT kassetten indeholder N-endestationen for eGFP og C-endestationen for tdT, adskilt af en intron, der indeholder et loxP-sted. TG kassetten er konstrueret omvendt, med N-endestation af tdT og C-endestation af eGFP. For det andet skal udtrykket cre rekombiner forekomme i den celle, der indeholder de målrettede MADM-kassetter. LoxP-stederne fungerer som et mål for Cre-medieret interkromotermisk rekombination, hvilket resulterer i rekonstituering af begge udtrykskassetter samtidigt. Hvis der forekommer rekombination i G2-fasen efterfulgt af X segregation (G2-X), vil de to datterceller udtrykke et af de to fluorescerende proteiner. B)MADM-princippet for genetisk mosaikanalyse på et enkelt klonniveau. Mutant alleler (punktmutationer, sletninger, indsættelser, loxP-flankerede betingede alleler som vist i figur 1Bosv.) kan indføres distale for TG-MADM kassetten via meiotisk rekombination (se figur 2 og Hippenmeyer et al.46 for nærmere oplysninger om, hvordan alle mutanter indføres i MADM-systemet). Hvis der forekommer en G2-X Cre recombinase-medieret interkromomal trans-rekombination mellem MADM kassetter, resulterer det i en GFP+ homozygot mutantcelle (GeneX-/-) for det pågældende gen og en tdT+ homozygous wild type celle (GeneX+/+) i et ikke-mærket heterozygotmiljø46,47,71. Alternative mærkningsresultater , der ikke er anvendt i klonanalysen (dvs. gule celler), er tidligere beskrevet i detaljer11,46,47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig2.jpg"> Figur 2: Avlsordninger for generering af eksperimentelle MADM-mus til opsporing af afstamning. Avlsplan for generering af kontrol MADM (A) og Gene X MADM (B) eksperimentelle MADM-mus til klonal analyse. Yderligere oplysninger om MADM-avlsparadigme se Beattie et al.7 og Hippenmeyer et al.7,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig3.jpg"> Figur 3: Tidsforløbsparadiger til MADM-baseret klonal afstamningsanalyse. Skematisk af de eksperimentelle design tidsvinduer. For langsgående prøvetagning paradigmer, timepoint af klon induktion forblev konstant og længden af tid før analysen varierede. Ved progressiv intervalprøvetagning forblev analysetidspunktet konstant, men induktionstiden varierede. En kombination af en eller begge tilgange kan anvendes afhængigt af de stillede spørgsmål. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig4.jpg"> Figur 4: MADM klonal analyse i udviklingslandene og voksne neocortex. TM-medieret MADM klon induktion i symmetrisk proliferative (TM ved E10) (A-C) og asymmetrisk neurogen (TM på E12) (D-F) dividere RGPs. Afbildet er individuelle MADM kloner in vivo i udviklingslandene (TM/E10−A/E16 og TM/E12−A/E16) (B,E) og voksne (TM/E10−A/P21 og TM/E12−A/P21) (C,F) i MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) og MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuronproduktionen var uafhængig af subklonfarver , og subkloner med grønt flertal/mindretal kunne sammenlignes med subkloner med rødt flertal/mindretal underkontrolbetingelserne 7,11. Ca. 1/6 af voksne kloner indeholdt også astrocytter og/eller oligodendrocytter, angivet med hvide stjerner. Paneler B og F er gengivet med tilladelse fra Hippenmeyer et al.46 og Rulands og Simons72, hhv. CP = Kortikal plade. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig5a.jpg"> Figur 5: MADM klonal analyse for at kvantificere RGP-medieret neuron output. Analyse af excitatorisk neuron (enhed) produktion af individuelle neurogene RGPs på klonniveau ved hjælp af MADM7,11. (A) Eksperimentel paradigme for at fremkalde det meste asymmetriske MADM kloner i udviklingslandene cortex. ( B) Mulige asymmetriske klonresultater med størstedelen af underkluden mærket i enten grønne eller røde (C) Repræsentative fortløbende sektioner, der spænder over en enkelt neurogen asymmetrisk klon (D,E) 3D-rekonstruktionsbilleder af repræsentative asymmetriske G2-X MADM-kloner med en majoritetspopulation i rødt (D) eller grønt (E) i MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- med TM induktion ved E12 og analyse på P21. Bemærk både grønne og røde mærkede celler er vilde type. (F) Skematisk angivelse af de to mulige eksperimentelle MADM klon resultater. (G) Kvantificering af størrelsen af størstedelens befolkning som følge af fornyelse af 1GPs i MADM-11-kloner. H)Kvantificering af mindretallets størrelse som følge af fornyelse af RGPs i MADM-11-kloner. (I) Kvantificering af den asymmetriske neurogene MADM-11-kloners enhedsstørrelse. Hypotetiske værdier kan repræsentere middel ± SEM. Skalabar = 100 μm (D og E). TM = Tamoxifen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig6.jpg"> Figur 6: MADM klonal analyse for at studere gener, der fører til microcephaly og macrocephaly. Hypotetiske MADM klonale analyse resultater, når de udfører funktionel genetisk dissektion af kandidat gener, der fører til microcephaly eller macrocephaly. For at dissekere de celle autonome funktioner i et gen af interesse (Gene X) på neuron output, MADM kræver mutant alleler, der skal indføres distale til MADM kassetter via meiotisk rekombination (for detaljer hvordan man kan indføre mutant alleler i MADM systemet se også Figur 2, Hippenmeyer et al.46, og Laukoter et al.46,73). (A,B) Skematisk indikerer eksperimentelle MADM paradigme for funktionel analyse af klonale RGP enheder. Den mutante subclone kan enten danne minoritetspopulationen (A) eller majoritet (B). (C-E) Hypotetiske MADM klonale analyse resultater ved kvantificering kontrol MADM (hvide bjælker), Gene-X MADM microcephaly (grå bjælker) og Gene-X MADM makrocephaly sorte bjælker) asymmetriske kloner. CC) Kvantificering af flertallets størrelse. DD) Kvantificering af mindretallets størrelse. (E) Kvantificering af den fælles størrelse af asymmetriske neurogene kloner. Hypotetiske værdier kan repræsentere middel ± SEM. S = Hypotetisk scenario, hvor forskel i underkloncellenummer kan opnå betydning i forhold til kontrol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Tabel 1: MADM-klonale undersøgelser i litteraturen. Sammenfatning af undersøgelser i litteraturen, der indeholder MADM-klonale afstamningsforsøg, herunder CreERT2-driver, der blev anvendt, TM-dosis og injektionstid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147_table1.xlsx" target="_blank">Klik her for at se denne tabel (Højreklik for at downloade).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

En protokol til at udføre afstamning sporing og funktionel genetisk analyse af kandidat gener på et enkelt celleniveau ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM) præsenteres. MADM klonale analyse giver en kvantitativ ramme til at måle proliferativ adfærd, cellulære output, og afstamning forholdet mellem de enkelte stamceller og deres datter celler.

Lineage Sporing og klonale analyse i udviklingen af hjernebark ved hjælp af mosaik analyse med dobbelt markører (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaic Analyse med Dobbelt Markører teknologi er en kraftfuld metode, der kan give meget kvantitative oplysninger om spredning adfærd og kælder output af enkeltpersoner stamceller. Et unikt træk ved denne teknik, er, at det tillader afstamning opsporing og funktionel genetisk analyse af kandidat gener på Single Cell level.demontrating til procedure vil være, Carmen Streicher, din tekniker, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc og Andy Hansen, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium. For at fremkalde MADM rekombinationshændelser i eksperimentelle mus skal du bruge en 1 ml sprøjte udstyret med en 25 gauge nål til at levere en enkelt injektion af Tamoxifen Intraperitoneal i en timet til gravid dæmning. Fra MADM klonal analyse til postnatal tidspunkter. På embryonale dage 18 til 19, placere en gravid mus i liggende stilling og desinficere pelsen med 70% ethanol. Lav et lille snit i huden i underlivet over livmoderen og gøre et andet snit gennem musklerne og bugmuskulære væg til at afsløre bughinden. Brug en saks til at adskille livmoderen fra det omgivende væv og placere den intakte livmoder i en handske med varmt vand. Brug derefter fine spids saks og fingre til omhyggeligt at åbne livmodervægge til at frigive embryoner. Rengør ungerne forsigtigt at trykke på kisterne fra tid til anden for at indlede vejrtrækning, før du overfører de prænatale dyr til en plejemor. At indsamle neurale MADM Clone Tissue placere en bedøvet dyr i liggende position på en perfusion kirurgi bakke og desinficere pelsen med 70% ethanol. Brug saks og kraftforrævner til at gøre et snit gennem huden og et snit gennem muskellaget. Når brysthulen er synlig, sniffe og løft mellemgulvet for at afsløre hjertet og omhyggeligt trimme og pin brystkassen til den kirurgiske bakke.indsæt en nål forbundet til en peristaltisk pumpe slange fyldt med PBS i nederste venstre hjertekammer af hjertet og bruge små Iris saks til at foretage et snit i den bageste ende af højre atrium. Se det kardiovaskulære system med PBS efterfulgt straks af perfusion med frisklavet iskold 4% paraformaldehyd i PBS. Når perfusionen er færdig, fjernes hjernen ved omhyggelig dissektion, og det høstede organ i mindst fem gange hjernevolumenet af frisk 4% paraformaldehyd natten over ved 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fænotypisk analyse og isolering af murine hæmatopoietiske stamceller og Lineage-progenitorer

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Frugt flygtige Analyse Brug af en elektronisk næse

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse af mRNA molekyler under anvendelse Fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Hurtig og effektiv zebrafisk Genotypebestemmelse Brug PCR med høj opløsning Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse af Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjælp Sult Pads i kombination med Fluorescence Microscopy

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open source Single-partikel Analyse for Super-resolution Microscopy med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokol for genetiske Gut indhold analyser af akvatiske Macroinvertebrates brug af gruppe-specifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL-kolesterol optagelse Assay ved hjælp af levende celle Imaging analyse med celle sundhedsovervågning

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...