Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Wij danken alle leden van het Hippenmeyer laboratorium voor discussie, de Bioimaging Facility, Life Science Facility en Pre-Clinical Facility van IST Austria voor technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door institutionele fondsen van IST Austria; R.B. kreeg steun van het Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner programma (M 2416); N.A kreeg steun van austrian science fund (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC kreeg steun van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie in het kader van de Marie Skłodowska-Curie-subsidieovereenkomst nr. A.H. kreeg steun van een ÖAW DOC (Doctoral Fellowship van de Oostenrijkse Academie van Wetenschappen). Deze studie werd ook ondersteund door de Europese Onderzoeksraad (ERC) in het kader van het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie (subsidieovereenkomst nr. 725780 LinPro) aan S.H.

De auteurs hebben niets te onthullen.

Een methode om MADM te gebruiken om cellijn van individuele RGPs in vivo in de zich ontwikkelende neocortex te volgen wordt beschreven. In combinatie met TM-inducible CreERT2kunnen MADM-gebeurtenissen nauwkeurig worden getimed, wat zorgt voor een zeer kwalitatieve en kwantitatieve visuele uitlezing van stamceldelingspatronen op het niveau van één cel. Door de geleverde dosis TM te titreren, kan in een ideale situatie gemiddeld minder dan één kloon per corticale hemisfeer worden verkregen, waardoor een adequate ruimtelijke scheiding ontstaat om individuele klonen ondubbelzinnig te onderscheiden. Door het handhaven van weefselintegriteit, deze methode vangt ook essentiële informatie met betrekking tot positie, morfologie, en absolute celnummers. MADM cassettes op Chr. 117,11,12,46,56,57, op Chr. 751, en de originele MADM bij Rosa2647,53,59 zijn gebruikt in MADM kloonanalysestudies. De hoge resolutie van individuele cellen biedt ongekend inzicht in zowel morfologie als de klonale relatie van dochtercellen en maakt de live beeldvorming van zich vermenigvuldigende stamcellen en opkomende klonen46,52mogelijk .
Keizersnede en het bevorderen van pups voor analyse van klonen op postnatale tijdpunten is een noodzakelijke en kritieke stap in het protocol. Afhankelijk van de gezondheidstoestand van de met TM behandelde zwangere moeder, kan het niet nodig zijn om een keizersnede uit te voeren. Het verhogen van de pups met een pleegmoeder is echter nog steeds vereist, omdat de met TM behandelde moeder problemen kan hebben met borstvoeding. Er zijn geen verschillen waargenomen in de noodzaak om te stimuleren met verschillende CreERT2-drivers. Zowel MADM lijnen en pleegmoeders worden onderhouden op een outbred CD-1 achtergrond. Als keizersnede niet nodig is, kan de met TM behandelde drachtige moeder die wordt gebruikt om experimentele pups te genereren, worden hergebruikt voor aanvullende experimentele fokken overeenkomstig de beginselen van 3R (houd er rekening mee dat dit alleen kan worden gedaan als experimentele diervergunningen deze praktijk goedkeuren). Pleegmoeders kunnen worden gebruikt voor het bevorderen van pups binnen 2 dagen nadat ze bevallen, maar hogere slagingspercentages zijn waargenomen wanneer pleegmoeders bevallen op dezelfde dag als de experimentele muizen die moeten worden bevorderd. Daarom is het belangrijk om getimede paringen voor pleegmoeders in te stellen parallel aan experimentele paringen in stap 1.1. Het handhaven van een vergelijkbaar nestnummer als het nest van de oorspronkelijke pleegmoeder kan de overlevingskans van pleegkinderen verbeteren, en daarom kan het verwijderen van sommige naar alle originele nesten nodig zijn. Extra stappen die het bevorderen kunnen verbeteren, zijn onder andere het wrijven van de handschoenen van de onderzoeker met strooisel en voedsel (om de geur van de handschoenen te verwijderen); wrijven de pups zachtjes na de keizersnede met fragmenten van de pleegmoeder vervuilde nest en nest; en plaatsing van de pups in nauw contact met de pups van de pleegmoeder voorafgaand aan hun plaatsing in de pleegmuiskooi.
Net als bij andere reporter-gebaseerde lijn tracering methoden, moet zorgvuldig worden overwogen bij het kiezen van de optimale CreERT2 driver voor MADM kloon experimenten. Ten eerste moet de gebruikte promotor de recombinase zowel tijdelijk als ruimtelijk uitdrukken in de voorloperpopulatie van belang. Het vinden van deze promotor kan een uitdaging zijn, omdat sommige promotors expressiepatronen kunnen veranderen of in verschillende stadia van ontwikkeling het zwijgen kunnen worden opgelegd. Om de specificiteit van het celtype te verbeteren, zijn er meerdere sitespecifieke recombinases gebruikt, elk aangedreven door afzonderlijke promotors. Wanneer een of beide recombinases in dezelfde cel worden uitgedrukt, labelt dit de cel en het nageslacht met een tl-verslaggever74,75,76,77. Samengevat is het belangrijk om een CreERT2-driver te kiezen die specifiek is voor de populatie van voorouders die worden geanalyseerd.
De meest kritieke stap in deze methode is de identificatie van een kloon, omdat alle cellen ondubbelzinnig moeten worden afgeleid uit een enkele recombinatiegebeurtenis (stap 8.1). Titratie van TM-concentratie zorgt voor minder dan één cluster van rode/groene cellen per hersenrondisfeer en maximaliseert de kans op het analyseren van een enkele kloon (stap 2.2)7,11. Klonen moeten worden weggegooid als naburige clusters van cellen optreden binnen 500 μm van de kloon van belang. Daarom is het belangrijk om verschillende secties voor en na het verschijnen van een kloon te onderzoeken om ervoor te zorgen dat er geen extra recombinatiegebeurtenissen in de buurt zijn. Vanwege een zwakker signaal van de fluoroforen is het noodzakelijk om immunohistochemie uit te voeren voor eGFP en tdT in embryonale klonen (zie punt 6). Dit wordt alleen aanbevolen bij volwassen klonen als extra antigenen worden gecolabeld. Bij het beeldvorming van klonen is het belangrijk om de volledige breedte van de cortex vast te leggen waar de kloon zich bevindt (d.w.z. van pialoppervlakte tot het corpus callosum; zie stap 8.4) om geen cellen te missen. Dit vergemakkelijkt ook beelduitlijning tijdens beeldverwerking (sectie 9). Sectie 8 van het protocol vereist een omgekeerde confocale microscoop, maar kan worden aangepast afhankelijk van de microscoop setup beschikbaar. Epifluorescentie microscopie kan worden gebruikt, maar confocale microscopie wordt aanbevolen omdat dit leidt tot een afname van lichtverontreiniging van buiten het focusvlak. Het is ook belangrijk dat de laserintensiteit en gain wordt aangepast, zodat groene, rode en gele cellen ondubbelzinnig kunnen worden geïdentificeerd. Ongeacht de setup wordt aanbevolen om een doelstelling van ten minste 20x te gebruiken om volledige ruimtelijke scheiding van dicht gepositioneerde cellen te garanderen. Naast het registreren van de corticale diepte van alle cellen (stap 8.6), moeten corticale gebieden waar de klonen zich bevinden worden geïdentificeerd met behulp van een hersenatlas zoals de Allen Brain atlas of andere stereotaxic coördinaatkaarten. Een bestand naamgeving paradigma moet ook worden aangenomen om ervoor te zorgen kloon beelden zijn gemakkelijk te identificeren. De volgende informatie kan worden opgenomen in de bestandsnaamgeving: unieke afbeelding-ID, datumafbeelding is genomen, genotype van het dier, leeftijd van inductie, leeftijd van analyse, beeldnummer ten opzichte van de rest van de beelden van dezelfde kloon.
De introductie van een mutatie distaal tot een MADM cassette onderscheidend maakt het genereren van genetische mozaïeken71 en maakt de dissectie van moleculaire regelgevers van afstamming en celtype diversiteit op het kloonniveau7,11,46,62. Om een genetisch mozaïek met MADM te genereren, moeten de MADM-cassettes meiotisch worden gekoppeld aan hetzelfde chromosoom als het gen van belang (zie figuur 2 voor fokschema). Dit beperkt de huidige kloonanalyse met MADM tot genen op Chr.7 51, Chr. 1146, Chr. 1251en Chr. 6 distal aan de Rosa26 locus47. Toekomstige studies zullen gebruik maken van MADM cassettes gericht op elk chromosoom, waardoor de mozaïek analyse van vrijwel alle genen van de muis genoom op klonale niveau.
Ten slotte is MADM niet beperkt tot de analyse van voorlopercellen in de zich ontwikkelende neocortex. De studie van veel stamcelniches zou kunnen profiteren van de mogelijkheid om spatiotemporale regelingen van clonally gerelateerde cellen op te lossen. Door madm toe te passen op andere hersengebieden, aandoeningen van de ziekte (bijvoorbeeld kanker), of in andere weefsels47,50,51,52,53,,54,,55,56,57,58,59, studies onthulden afstammingrelaties in klonen afkomstig van diverse klassen van voorloper en stamcellen (zie tabel 1 voor de huidige lijst van MADM-kloonstudies). Een andere interessante toekomstige toepassing van MADM is om het te combineren met extra functionele of subcellulaire verslaggevers, die de mate van informatie die kan worden verkregen van klonen zou verhogen.

De hersenschors is een zeer georganiseerde structuur bestaande uit zes verschillende lagen. De cortex bevat een breed scala aan celtypen, waaronder neuronen en glia, die interageren tot functionele neurale circuits. De meeste, zo niet alle, corticale excitatory projectie neuronen en glia zijn afgeleid van een gemeenschappelijke pool van neurale stamcellen (NSC's) bekend als de radiale glia voorlopers (RGPs)1,2,3. RPP's zelf zijn afgeleid van neuro-pitheliale stamcellen (NESCs) die het vroege embryonale neuroepithelium vormen. Op embryonaal dag 9 (E9) bij muizen beginnen NESC's over te stappen naar RGPs4. RGP-lijnprogressie vereist nauwkeurige temporele en ruimtelijke regulatie, en wanneer dit proces wordt belemmerd, kunnen ernstige neurologische aandoeningen zoals megalencephalie, microcefalie, lissencephalie of stoornissen zoals schizofrenie en autisme5,6resulteren. Bij E10 ondergaan de meeste RSP's symmetrische proliferative divisies, wat resulteert in een uitbreiding van de neurale voorloperpool4,7. RPP's uiteindelijk beginnen te verdelen asymmetrisch, het produceren van corticale projectie neuronen in een tijdelijk gedefinieerde manier. Door opeenvolgende golven van neurogenese migreren pasgeboren neuronen naar de corticale plaat die corticale laminae vormt met vroeggeboren neuronen die diepe lagen bezetten en laatgeboren neuronen die zich in de oppervlakkige lagen8,,9,10bevinden. Omdat clonally verwante piramidale neuronen radiaal migreren naar de cortex met zeer weinig tangentiële dispersie, hebben dochtercellen de neiging om een kolom of kegelvormige structuur te vormen die wordt aangeduid als een neuronale radiale eenheid4,11,12,13. Door E17, embryonale neurogene expansie is voltooid bij muizen14. RPP's kunnen ook ependymale cellen en sommige klassen van glia produceren, waaronder astrocyten en oligodendrocyten1,15,16,17,18,19. Het potentieel van RPP's om zowel neuronen als astrocyten te geven lijkt consistent te zijn in alle corticale regio's18, met ongeveer 1/6 van de neurogene ROP's die ook glia11produceren .
Momenteel zijn de genetische en epigenetische factoren die de temporele progressie van een stamcel langs de afstamming reguleren meestal onbekend. Temporele patronen van genexpressie kunnen aanzienlijke gevolgen hebben voor de afstammingsbesluiten in RGPs20,21,22,23,24. Hoe deze hechte relatie tussen temporele en ruimtelijke patronen leidt tot de moleculaire diversiteit van volwassen neuronale types in corticale gebieden is niet bekend. Ook hoe de individuele stamcel potentieel en de cellulaire output wordt gemoduleerd op cellulair en moleculair niveau is een belangrijke onbeantwoorde vraag. Toekomstige studies zullen hopelijk een aantal van deze vragen aan te pakken, uiteindelijk het uitbreiden van ons begrip van functionele corticale circuit vorming.
Ontwikkelingsneurobiologie probeert de afstammingsrelatie te begrijpen die cellen in de hersenen met elkaar delen. Aanvankelijk waren er zeer weinig onderzoeksinstrumenten beschikbaar voor dit, en veel vroege studies gebaseerd op visuele waarnemingen van divisie patronen in transparante organismen zoals Caenorhabditis elegans25. De afgelopen decennia is het aantal en de verfijning van de beschikbare techniekenmet 13,26,27,28,29drastisch toegenomen . De opkomst van het CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem maakt synthetische reconstructie van cellijnrelaties mogelijk door de invoering van evoluerende DNA-barcodes27,30. Twee recente voorbeelden van barcoding strategieën zijn het gebruik van homing gids RNA dat CRISPR-Cas9 richt op specifieke DNA barcode loci of een cytidine deaminase gefuseerd met nickase Cas9 om endogene gestrooide herhaling regio's31,32richten . Deze technologieën bieden zeer multiplexed benaderingen door de introductie van barcodes die geleidelijk en stabiel unieke mutaties in de tijd accumuleren. Genoombewerkingsbenaderingen zijn zeer waardevol omdat ze een retroactieve analyse mogelijk maken van de relatie tussen twee cellen op basis van de gedeelde overerving van deze barcodes. Echter, om de barcodes in individuele cellen te lezen, moet het weefsel meestal worden verstoord, en daarom gaat informatie over positie, morfologie en absolute celnummers van een individuele voorloper verloren.
Combinatorische etiketteringsparadigma's behouden ruimtelijke informatie en maken in principe ook het onderscheid mogelijk tussen nauw gelokaliseerde of zelfs overlappende klonen33,34. Om een lijntraceringsmethode informatief te laten zijn, moet het individuele voorouders en hun nakomelingen op een schaarse en onuitwisbare manier etiketteren. Met name de Brainbow35 en Confetti36,37 benaderingen gebruiken stochastische veelkleurige Cre recombinase-gebaseerde verslaggevers die een combinatie van fluorescerende eiwitten uit een enkele locus uitdrukken. Het uitgebreide aantal gelijktijdige kleurencombinaties dat in vivo kan worden bereikt, maakt dit een krachtig hulpmiddel bij het traceren van corticale RGP-klonen en astrocyten34. Transposon-gebaseerde systemen die een stabiele genomische integratie van transgenes coderen fluorescerende verslaggevers en het toestaan van afstamming tracering van corticale voorouders zijn ook ontwikkeld33,38,39,40,41. Transposon-gebaseerde systemen hebben een bijkomend voordeel in die zin dat de verslaggever constructies stabiel integreren in het genoom, en daardoor betrouwbaar label lineally gerelateerde dochter cellen. Om astrocyten afstammingen specifiek te traceren, zijn een aantal methoden ontwikkeld die betrekking hebben op elektroporatie van piggyBac-transposases, waaronder Star Track, die gebruik maakt van een combinatie van constructies die verschillende fluorescerende eiwittencoderen 40,42. Een andere benadering, MAGIC markers,introduceert Brainbow vectoren als transposable transgenes. Dit is met succes gebruikt om embryonale neurale en astrocyten voorlopers34,43te traceren. Onlangs bleek mozaïekanalyse door dubbele recombinase-gemedieerde cassetteuitwisseling (MADR) om gemuteerde cellen die transgene elementen uitdrukken van precies gedefinieerde chromosomale loci44stabiel te etiketteren. Deze krachtige in vivo combinatorische etiketteringstechnieken hebben tal van inzichten opgeleverd in de afstammingsdynamiek van voorlopercellen. Deze analyses worden echter uitgevoerd op vast weefsel, waardoor een momentopname wordt gemaakt van individuele klonen in een bepaalde ontwikkelingsfase. Om veranderingen in de afstammingsdynamiek van enkele klonen in de loop van de tijd waar te nemen, moeten chronische in vivo beeldvormingsmethoden worden toegepast die vergelijkbaar zijn met die welke worden uitgevoerd in de volwassen dentate gyrus45.
Mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) is een krachtige dual color labeling methode die het mogelijk maakt in vivo lijn tracering van individuele voorloper cellen in muizen46,47. Er zijn twee componenten nodig om MADM-etiketteringsgebeurtenissen te laten plaatsvinden: Ten eerste moeten MADM-cassettes gericht zijn op identieke loci op homologe chromosomen. Cassettes bestaan uit twee chimerische tlfluorescerende reportergenen, eGFP (groen, [G]) en tandem dimer Tomato (rood, tdT[T]). De GT cassette bevat het N-eindpunt van eGFP en het C-eindpunt van tdT, gescheiden door een intron met een loxP site. De TG cassette is omgekeerd gebouwd, met het N-eindpunt van tdT en het C-eindpunt van eGFP. Ten tweede is de expressie van Cre recombinase in dezelfde cel met de beoogde MADM-cassettes essentieel. Bij afwezigheid van Credrukken de chimerische cassettes geen functionele eGFP of tdT uit omdat hun coderingssequenties worden verstoord. De loxP-sites dienen als doelwit voor cre-gemedieerde interchromosomale recombinatie, wat resulteert in de reconstructie van beide expressiecassettes tegelijk. Als recombinatie optreedt tijdens de G2-fase van de celcyclus gevolgd door X-segregatie (G2-X), zullen de twee dochtercellen elk een van de twee fluorescerende eiwitten uitdrukken. Temporele regulering van de CreERT2-activiteit met behulp van tamoxifen (TM) geeft nauwkeurige informatie over de geboortedatum van MADM-klonen en de verdelingspatronen van hun nageslacht (figuur 1A)29,46,47.
MADM kan potentieel systematisch label individuele klonen met een hoge eencellige resolutie in de muis hersenen vergelijkbaar met traditionele, maar niet-specifieke en moeizame methoden zoals Golgi kleuring48 of kleurstof vullen49. Omdat alleen de promotor die CreERT2 bestuurt de specificiteit van het celtype van kloon-MADM-etikettering bepaalt, kan MADM in principe worden toegepast voor kloonlijntracering in alle murineorgel en weefsel47,50,51,52. In studies is madm reeds gebruikt om afstammingsrelaties aan het licht te brengen in klonen47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentele paradigma's zijn toegepast om afstamming te bestuderen in corticale projectie neuronen, glia, en postnatale stamcellen in de zich ontwikkelende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM is ook gebruikt om celstamen te bestuderen in de volwassen dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulaatcellen en interneurons op kloonniveau (zie tabel 1 voor een volledige lijst)47,53,54,56,57,66.
Een uniek kenmerk van MADM is het vermogen om mutaties distaal te koppelen aan één MADM cassette, waardoor een genetisch mozaïek ontstaat(figuur 1B en figuur 2). Dit resulteert in wilde dochtercellen van het type met een fluorescerende marker (tdT in figuur 1B)en homozygootmuts broers en zussen met de andere (eGFP in figuur 1B) in een niet-gelabelde heterozygoot omgeving. MADM is uniek in die vergelijkende analyse van controle en mutant subclonen kunnen worden uitgevoerd in dezelfde weefselomgeving in vivo. Oorspronkelijk waren MADM cassettes gericht op de Rosa26 locus47,maar MADM-analyse van de genfunctie was beperkt tot genen die distaal waren voor de locus. Om deze beperking (ten minste gedeeltelijk) te overwinnen en de mogelijkheden voor MADM-gebaseerde genanalyses uit te breiden, werden MADM-cassettes dicht bij de centromeres van Chr. 751, Chr. 1146en Chr. 1251ingeklopt . Gericht op alle 19 muis autosomen met MADM cassettes is in volle gang en zal het mogelijk maken voor vrijwel elk gen te bestuderen in de toekomst, het verstrekken van een ongeëvenaard platform voor de studie van ontwikkelingslijn relaties in combinatie met functionele genetische analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Beginnend bij een beperkte pool van voorouders, vormt de hersenschors van zoogdieren zeer georganiseerde functionele neurale circuits. Echter, de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanismen reguleren van de overgang van de afstamming van neurale stamcellen (NSC's) en de uiteindelijke productie van neuronen en glia in de zich ontwikkelende neuroepithelium blijft onduidelijk. Methoden om NSC-divisiepatronen te traceren en de afstamming van clonally gerelateerde cellen in kaart te brengen, zijn dramatisch gevorderd. Echter, veel hedendaagse lineage tracing technieken lijden aan het gebrek aan cellulaire resolutie van nakomelingen cel lot, dat essentieel is voor het ontcijferen van voorloper celdeling patronen. Gepresenteerd is een protocol met behulp van mozaïek analyse met dubbele markers (MADM) uit te voeren in vivo kloon analyse. MADM manipuleert gelijktijdig individuele voorlopercellen en visualiseert nauwkeurige delingpatronen en lijnprogressie bij ongekende single cell resolutie. MADM-gebaseerde interchromosomale recombinatie gebeurtenissen tijdens de G2-X fase van mitose, samen met tijdelijk inducible CreERT2, bieden exacte informatie over de geboortedata van klonen en hun verdeling patronen. Zo biedt MADM lineage tracing ongekende kwalitatieve en kwantitatieve optische uitlezingen van de proliferatiemodus van stamcelverervertellers op het niveau van één cel. MADM maakt het ook mogelijk voor onderzoek van de mechanismen en functionele eisen van kandidaat-genen in NSC-afstammingprogressie. Deze methode is uniek in die vergelijkende analyse van controle en mutant subclonen kunnen worden uitgevoerd in dezelfde weefselomgeving in vivo. Hier wordt het protocol in detail beschreven en worden experimentele paradigma's om MADM in dienst te nemen voor kloonanalyse en afstammingstracering in de zich ontwikkelende hersenschors aangetoond. Belangrijk is dat dit protocol kan worden aangepast om MADM kloonanalyse uit te voeren in elke murine stamcelniche, zolang de CreERT2-driver aanwezig is.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Een protocol voor het uitvoeren van lijntracering en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op een celniveau met behulp van mozaïekanalyse met dubbele markers (MADM) wordt gepresenteerd. MADM kloonanalyse biedt een kwantitatief kader om het proliferative gedrag, cellulaire output en afstammingsrelatie van individuele voorlopers en hun dochtercellen te meten.

Lineage Tracing en klonnale analyse in het ontwikkelen van cerebrale cortex met behulp van Mozaïek Analyse met dubbele markers (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaic Analysis met Double Markers technologie is een krachtige methode die zeer kwantitatieve informatie kan bieden over het proliferatiegedrag en kelderoutput van individuen stamcellen. Een uniek kenmerk van deze techniek, is dat het mogelijk maakt afstamming tracing en functionele genetische analyse van kandidaat-genen op het niveau van de single cell.demontrating aan de procedure zal zijn, Carmen Streicher, uw technicus, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc en Andy Hansen, een promovendus uit mijn laboratorium. Om MADM recombinatie gebeurtenissen in experimentele muizen te induceren, gebruik dan een 1ml spuit uitgerust met een 25-meter naald om een enkele injectie van Tamoxifen Intraperitoneal te leveren in een getimede tot zwangere moeder. Van MADM klonale analyse tot postnatale tijdstippen. Plaats op embryonale dagen 18 tot 19 een zwangere muis in de supinepositie en desinfecteer de vacht met 70%ethanol. Maak een kleine incisie in de huid in de onderbuik boven de baarmoeder en maak een tweede incisie door de spieren en de buikspierwand om het buikvlies te onthullen. Gebruik een schaar om de baarmoeder te scheiden van de omliggende weefsels en plaats de intacte baarmoeder in een handschoen met warm water. Gebruik vervolgens fijne tipschaar en vingers om de baarmoederwanden zorgvuldig te openen om de embryo's vrij te geven. Reinig de pups zachtjes drukken op de borst van tijd tot tijd om de ademhaling te starten voordat de overdracht van de prenatale dieren aan een pleegmoeder. Om neurale MADM Clone Tissue te verzamelen plaats een verdoofd dier in de supine positie op een perfusie operatie lade en desinfecteren de vacht met 70%ethanol. Gebruik schaar en tang om een incisie te maken door de huid en een incisie door de spierlaag. Wanneer de borstholte zichtbaar is, snuiven en til het middenrif om het hart te onthullen en zorgvuldig trim en pin de ribbenkast aan de chirurgische lade.insert een naald aangesloten op een peristaltische pomp buizen gevuld met PBS in de linker linker hartkamer en gebruik kleine Iris schaar om een incisie te maken in het achterste uiteinde van het rechter atrium. Doorsnede het cardiovasculaire systeem met de PBS onmiddellijk gevolgd door perfusie met vers bereide ijskoude 4%paraformaldehyde in PBS. Wanneer de perfusie is voltooid, verwijder de hersenen door zorgvuldige dissectie en plaats het geoogste orgaan in ten minste vijf keer het hersenvolume van verse 4% paraformaldehyde 's nachts op 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Een Neuronale en astrocyte co-cultuur assay voor High Content Analysis van neurotoxiciteit

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analyse van DNA dubbelstrengs breuken (DSB) Reparatie in zoogdiercellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Fruit Vluchtige analyse met behulp van een elektronische neus

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisatie en analyse van mRNA moleculen met behulp van fluorescentie<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisatie in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snelle en efficiënte zebravis Genotyping Met behulp van PCR met een hoge resolutie Melt Analyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse van autofagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Door gebruikmaken van uithongering pads in combinatie met fluorescentiemicroscopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-deeltje Analyse voor Super-resolutie microscopie met VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL Cholesterol opname Assay met behulp van levende cellen Imaging analyse met mobiele gezondheidsmonitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...