Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
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Nous remercions tous les membres du laboratoire Hippenmeyer pour leur discussion, le Centre de bioimagerie, le Centre des sciences de la vie et l’Installation préclinique de l’IST Autriche pour leur soutien technique. Ce travail a été soutenu par les fonds institutionnels de l’IST Autriche; R.B. a reçu le soutien du programme Lise-Meitner du Fonds autrichien pour la science (FWF) (M 2416); N.A a reçu le soutien du Fonds autrichien pour la science (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC a reçu le soutien du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de l’accord de subvention Marie Skłodowska-Curie no 754411 en tant que boursier postdoctoral ISTplus; A.H. a reçu le soutien d’un ÖAW DOC (Bourse doctorale de l’Académie autrichienne des sciences). Cette étude a également été soutenue par le Conseil européen de la recherche (CER) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention n° 725780 LinPro) à S.H.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Une méthode d’utilisation de MADM pour suivre la lignée cellulaire des RGPs individuels in vivo dans le néocortex en développement est décrite. Lorsqu’ils sont combinés avec TM-inductible CreERT2, les événements MADM peuvent être chronométrés avec précision, fournissant une lecture visuelle très qualitative et quantitative des modèles de division de cellules souches au niveau des cellules uniques. En titrant la dose de TM livrée, dans une situation idéale, on peut obtenir en moyenne moins d’un clone par hémisphère cortical, ce qui permet d’obtenir une séparation spatiale adéquate pour distinguer sans ambiguïté les clones individuels. En maintenant l’intégrité des tissus, cette méthode capture également des informations essentielles concernant la position, la morphologie et les nombres absolus de cellules. Cassettes MADM sur Chr. 117,11,12,46,56,57, sur Chr. 751, et le MADM original à Rosa2647,53,,59 ont été utilisés dans les études d’analyse clonale MADM. La haute résolution des cellules individuelles fournit un aperçu sans précédent de la morphologie et de la relation clonale des cellules filles et permet l’imagerie vivante des cellules souches proliférantes et des clones émergents46,52.
La césarienne et la promotion des chiots pour l’analyse des clones aux délais postnatals est une étape nécessaire et critique dans le protocole. Selon l’état de santé du barrage enceinte traité par TM, il peut ne pas être nécessaire d’effectuer une césarienne. Cependant, il est encore nécessaire d’élever les chiots avec une mère adoptive, car la mère traitée au TM peut avoir de la difficulté à allaiter. Aucune différence n’a été observée dans la nécessité de favoriser avec différents conducteurs CreERT2. Les lignes MADM et les mères adoptives sont maintenues sur un fond de CD-1 hors-de-race. Si la césarienne n’est pas nécessaire, le barrage enceinte traité par TM utilisé pour produire des chiots expérimentaux peut être réutilisé pour d’autres reproductions expérimentales conformément aux principes de la 3R (notez que cela ne peut être fait que si les licences expérimentales animales approuvent cette pratique). Les mères adoptives peuvent être utilisées pour favoriser les chiots dans les 2 jours suivant leur accouchement, mais des taux de réussite plus élevés ont été observés lorsque les mères adoptives accouchent le même jour que les souris expérimentales qui doivent être encouragées. Par conséquent, il est important de mettre en place des accouplements chronométrés pour les mères adoptives en parallèle aux accouplements expérimentaux à l’étape 1.1. Le maintien d’un numéro de litière semblable à celui de la litière de la mère adoptive peut améliorer le taux de survie des chiots placés en famille d’accueil, et il peut donc être nécessaire d’enlever certains de ceux-ci à toutes les portées d’origine. D’autres mesures qui peuvent améliorer l’accueil comprennent frotter les gants de l’expérimentateur avec de la litière et de la nourriture (pour enlever l’odeur des gants); frotter les chiots doucement après la césarienne avec des fragments de la litière et du nid souillés de la mère adoptive; et le placement des chiots en contact étroit avec les chiots de la mère adoptive avant leur placement dans la cage de la souris d’accueil.
Comme dans d’autres méthodes de traçage de lignée basées sur le journaliste, il faut examiner attentivement lors du choix du pilote CreERT2 optimal pour les expériences clonales MADM. Tout d’abord, le promoteur utilisé doit exprimer la recombinase à la fois temporellement et spatialement dans la population progénitrice d’intérêt. Trouver ce promoteur peut être difficile, parce que certains promoteurs peuvent changer les modèles d’expression ou se réduire au silence à différents stades de développement. Pour améliorer la spécificité du type de cellule, plusieurs recombinas spécifiques au site, chacune pilotée par des promoteurs distincts, ont été utilisées. Lorsque l’une ou les deux recombinases sont exprimées dans la même cellule, cela étiquette la cellule et sa progéniture avec un journaliste fluorescent74,75,76,77. En résumé, il est important de choisir un pilote CreERT2 spécifique à la population d’ancêtres analysés.
L’étape la plus critique de cette méthode est l’identification d’un clone, car toutes les cellules doivent être dérivées sans ambiguïté d’un seul événement de recombinaison (étape 8.1). La titration de la concentration de TM assure moins d’un groupe de cellules rouges/vertes par hémisphère cérébral et maximise la probabilité d’analyser un seul clone (étape 2.2)7,11. Les clones doivent être jetés si les amas voisins de cellules se produisent à moins de 500 μm du clone d’intérêt. Par conséquent, il est important d’examiner plusieurs sections avant et après l’apparition d’un clone pour s’assurer qu’il n’y a pas d’événements de recombinaison supplémentaires à proximité. En raison du signal plus faible des fluorophores, il est nécessaire d’effectuer l’immunohistorique pour eGFP et tdT dans les clones embryonnaires (voir la section 6). Ceci n’est recommandé que chez les clones adultes que si des antigènes supplémentaires seront colabés. Lors de l’imagerie des clones, il est important de capturer toute la largeur du cortex où se trouve le clone (c.-à-d. de la surface piale au corpus callosum; voir l’étape 8.4) pour ne manquer aucune cellule. Cela facilite également l’alignement de l’image pendant le traitement de l’image (section 9). La section 8 du protocole nécessite un microscope confocal inversé, mais peut être adaptée en fonction de la configuration du microscope disponible. La microscopie d’épifluorescence peut être employée, mais la microscopie confocale est recommandée parce que ceci mène à une diminution de la contamination de lumière de l’extérieur du plan de mise au point. Il est également important que l’intensité et le gain du laser soient ajustés de façon à ce que les cellules vertes, rouges et jaunes puissent être identifiées sans ambiguïté. Indépendamment de la configuration, il est recommandé d’utiliser un objectif d’au moins 20x pour assurer une séparation spatiale complète des cellules étroitement positionnées. En plus d’enregistrer la profondeur corticale de toutes les cellules (étape 8.6), les régions corticales où se trouvent les clones doivent être identifiées à l’aide d’un atlas cérébral tel que l’atlas du cerveau Allen ou d’autres cartes de coordonnées stéréotaxiques. Un paradigme de nommage de fichier devrait également être adopté pour s’assurer que les images de clones sont facilement identifiables. Les informations suivantes pourraient être incluses dans le nom du fichier : ID d’image unique, image de date a été prise, génotype de l’animal, âge d’induction, âge d’analyse, numéro d’image par rapport au reste des images du même clone.
L’introduction d’une mutation distale à une cassette MADM permet distinctement la génération de mosaïques génétiques71 et permet la dissection des régulateurs moléculaires de la diversité de lignée et de type cellulaire au niveau clonal7,11,46,62. Pour générer une mosaïque génétique avec MADM, les cassettes MADM doivent être liées de façon meiotiquement au même chromosome que le gène d’intérêt (voir la figure 2 pour le schéma de reproduction). Cela limite l’analyse clonale actuelle avec MADM aux gènes situés sur Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251, et Chr. 6 distal au rosa26 locus47. Les études futures utiliseront des cassettes MADM ciblées sur n’importe quel chromosome, permettant l’analyse en mosaïque de pratiquement tous les gènes du génome de la souris au niveau clonal.
Enfin, MADM ne se limite pas à l’analyse des cellules progénitrices du néocortex en développement. L’étude de nombreuses niches de cellules souches pourrait bénéficier de la capacité de résoudre les arrangements spatiotemporal des cellules clonales. En appliquant MADM à d’autres régions du cerveau, les maladies (par exemple, le cancer), ou dans d’autres tissus47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,études ont révélé des relations de lignée dans des clones dérivés de diverses classes de progénitrice et de cellules souches (voir le tableau 1 pour la liste actuelle des études clonalales MADM). Une autre application intéressante future de MADM est de le combiner avec des journalistes fonctionnels ou subcellulaires supplémentaires, ce qui augmenterait le degré d’information qui peut être acquise à partir de clones.

Le cortex cérébral est une structure très organisée composée de six couches distinctes. Le cortex contient un large éventail de types de cellules, y compris les neurones et la glie, qui interagissent pour former des circuits neuronaux fonctionnels. La plupart, sinon la totalité, des neurones de projection excitateurs corticaux et des glia sont dérivés d’un pool commun de cellules souches neuronales (NSC) connues sous le nom de progéniteurs gliaux radicaux (RGPs)1,2,3. Les RGP eux-mêmes sont dérivés de cellules souches neuroépithéliales (NESC) composant le neuroépithélium embryonnaire précoce. Par le jour embryonnaire 9 (E9) chez les souris, les NESC commencent à passer en RGPs4. La progression de la lignée RGP nécessite une régulation temporelle et spatiale précise, et lorsque ce processus est entravé, des troubles neurologiques graves tels que la mégalencéphalie, la microcéphalie, la lissencéphalie ou des déficiences telles que la schizophrénie et l’autisme peuvent entraîner5,6. À E10, la plupart des RPP subissent des divisions prolifératives symétriques, ce qui entraîne une expansion de la piscine progénitrice neuronale4,7. Les RMP finissent par commencer à se diviser de façon asymétrique, produisant des neurones de projection corticale d’une manière définie temporellement. Grâce à des ondes consécutives de neurogenèse, les neurones nouveau-nés migrent dans la plaque corticale formant laminee corticale avec des neurones nés tôt occupant des couches profondes et des neurones nés tardivement résidant dans les couches superficielles8,9,10. Étant donné que les neurones pyramidaux liés à la clonally migrent radialement dans le cortex avec très peu de dispersion tangentielle, les cellules filles ont tendance à former une structure en forme de colonne ou de cône appelée unité radiale neuronale4,11,12,13. Par E17, l’expansion neurogénique embryonnaire est complète chez les souris14. Les RGP peuvent également produire des cellules épendymales et certaines classes de glia, y compris les astrocytes et les oligodendrocytes1,15,16,17,18,19. Le potentiel des RMP pour donner naissance à la fois aux neurones et aux astrocytes semble être cohérent dans toutes les régions corticales18, avec environ 1/6 de RMP neurogéniques produisant également glia11.
Actuellement, les facteurs génétiques et épigénétiques régulant la progression temporelle d’une cellule souche le long de sa lignée sont pour la plupart inconnus. Les modèles temporels d’expression génique peuvent avoir un impact substantiel sur les décisions de lignée dans les RPP20,21,22,23,24. Comment cette relation étroitement liée entre les modèles temporels et spatiaux conduit à la diversité moléculaire des types neuronaux adultes à travers les zones corticales n’est pas connue. De même, la façon dont le potentiel individuel de cellules souches et sa production cellulaire est modulé au niveau cellulaire et moléculaire est une question importante sans réponse. Nous espérons que les études futures aborderont certaines de ces questions, ce qui permettra d’élargir notre compréhension de la formation fonctionnelle de circuits corticaux.
La neurobiologie du développement cherche à comprendre la relation de lignée que les cellules du cerveau partagent les unes avec les autres. Initialement, très peu d’outils de recherche étaient disponibles pour cela, et de nombreuses premières études se sont appuyées sur des observations visuelles des modèles de division dans des organismes transparents tels que Caenorhabditis elegans25. Au cours des dernières décennies ont vu une augmentation spectaculaire du nombre et de la sophistication des techniques disponibles13,26,27,28,29. L’émergence du système d’édition du génome CRISPR-Cas9 permet la reconstruction synthétique des relations de lignée cellulaire en introduisant l’évolution des codes à barres d’ADN27,30. Deux exemples récents de stratégies de codage à barres incluent l’utilisation de l’ARN guide homing qui dirige CRISPR-Cas9 à des loci de code-barres d’ADN spécifiques ou une cytidine deaminase fusionnée avec nickase Cas9 pour cibler endogène intercalée régions répétées31,32. Ces technologies fournissent des approches fortement multiplexées par l’introduction de codes à barres qui accumulent progressivement et de façon stable des mutations uniques au fil du temps. Les approches d’édition du génome sont très précieuses parce qu’elles permettent une analyse rétroactive de la relation entre deux cellules en fonction de l’héritage partagé de ces codes à barres. Cependant, afin de lire les codes à barres dans les cellules individuelles, le tissu doit généralement être perturbé, et donc l’information concernant la position, la morphologie, et les nombres absolus de cellules d’un ancêtre individuel est perdu.
Les paradigmes d’étiquetage combinatoire préservent l’information spatiale et permettent en principe également la distinction entre les clones étroitement localisés ou même qui se chevauchent33,34. Pour qu’une méthode de traçage de lignée soit instructive, elle doit étiqueter les ancêtres individuels et leur progéniture d’une manière clairsemée et indélébile. Notamment, les approches Brainbow35 et Confetti36,37 utilisent des journalistes stochastiques à base de recombinase multicolores Cre qui expriment une combinaison de protéines fluorescentes à partir d’un seul locus. Cre Le nombre étendu de combinaisons de couleurs simultanées qui peuvent être réalisées in vivo en font un outil puissant lors du traçage des clones corticals RGP et astrocytes34. Des systèmes basés sur transposon fournissant l’intégration génomique stable des transgenes encodant des reporters fluorescents et permettant le traçage de lignée des progéniteurs corticaux ont également été développés33,38,39,40,41. Les systèmes à base de transposon ont un avantage supplémentaire en ce que le journaliste construit stably intégrer dans le génome, et donc l’étiquette fiable cellules filles liées à la ligne. Pour retracer spécifiquement les lignées d’astrocytes, un certain nombre de méthodes ont été développées qui impliquent l’électroporation de transposases piggyBac, y compris Star Track, qui fait usage d’une combinaison de constructions encodage différentes protéines fluorescentes40,42. Une autre approche, magic markers, introduit les vecteurs Brainbow comme transgènes transposables. Ceci a été utilisé avec succès pour tracer les progéniteurs embryonnaires de neurones et d’astrocytes34,43. Récemment, l’analyse de mosaïque par double échange de cassettes recombinassées (MADR) a été trouvée pour étiqueter les cellules mutantes exprimant des éléments transgéniques à partir de loci chromosomiques précisément définis44. Ces puissantes techniques d’étiquetage combinatoire in vivo ont fourni de nombreux aperçus de la dynamique de lignée des cellules progénitrices. Cependant, ces analyses sont effectuées sur des tissus fixes, fournissant un instantané des clones individuels à un stade de développement défini. Afin d’observer les changements dans la dynamique de lignée des clones simples au fil du temps, des méthodes d’imagerie in vivo chroniques similaires à celles effectuées dans le gyrus denté adulte doivent être appliquées45.
L’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) est une méthode puissante d’étiquetage à deux couleurs qui permet le traçage in vivo de lignées individuelles de cellules progénitrices individuelles chez les souris46,47. Deux composants sont nécessaires pour que les événements d’étiquetage MADM se produisent : premièrement, les cassettes MADM doivent être ciblées sur des loci identiques sur les chromosomes homologues. Les cassettes se composent de deux gènes de reporter fluorescent chimérique, eGFP (vert, [G]) et de la tomate de dimère tandem (rouge, tdT[T]). La cassette GT contient le n-terminus d’eGFP et le C-terminus de tdT, séparés par un intron contenant un site loxP. La cassette TG est construite inversement, avec le N-terminus de tdT et le C-terminus d’eGFP. Deuxièmement, l’expression de cre recombinase dans la même cellule contenant les cassettes MADM ciblées est essentielle. En l’absence de Cre, les cassettes chimériques n’expriment pas eGFP fonctionnelle ou tdT parce que leurs séquences de codage sont perturbées. Les sites loxP servent de cible à la recombinaison interchromosomique pédiée par Cre, ce qui entraîne la reconstitution simultanée des deux cassettes d’expression. Si la recombinaison se produit pendant la phase G2 du cycle cellulaire suivie de la ségrégation X (G2-X), les deux cellules filles exprimeront chacune l’une des deux protéines fluorescentes. La régulation temporelle de l’activité creert2 à l’aide du tamoxifène (TM) fournit des informations précises sur la date de naissance des clones MADM et les schémas de division de leur progéniture (Figure 1A)29,46,47.
MADM peut potentiellement systématiquement étiqueter les clones individuels avec une haute résolution unicellulaire dans le cerveau de la souris semblable à des méthodes traditionnelles mais non spécifiques et laborieuses comme Golgi tache48 ou colorant remplissage49. Étant donné que seul le promoteur qui conduit CreERT2 détermine la spécificité du type cellulaire de l’étiquetage clonal MADM, MADM peut en principe être appliqué pour le traçage de lignée clonale dans n’importe quel organe et tissu murin47,50,51,52. En effet, des études ont déjà utilisé MADM pour révéler des relations de lignée dans des clones dérivés de tissus divers47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Madm paradigmes expérimentaux ont été appliqués à la lignée d’étude dans les neurones de projection corticale, glia, et les cellules souches postnatales dans le développement néocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM a également été utilisé pour étudier la lignée cellulaire dans le gyrus denté adulte, thalamus, cellules granuleuses cérébellaires, et les interneurones au niveau clonal (voir le tableau 1 pour une liste complète)47,53,54,56,57,66.
Une caractéristique unique de MADM est la capacité de lier génétiquement les mutations distales à une cassette MADM, créant ainsi une mosaïque génétique (figure 1B et figure 2). Il en résulte des cellules filles de type sauvage étiquetées avec un marqueur fluorescent (tdT dans la figure 1B)et des frères et sœurs mutants homozygotes avec l’autre (eGFP dans la figure 1B)dans un environnement hétérozygote non étiqueté. MADM est unique en ce que l’analyse comparative des sous-clones de contrôle et mutants peut être effectuée dans le même environnement tissulaire in vivo. À l’origine, les cassettes MADM ont été ciblées dans le locus47 rosa26 , mais l’analyse MADM de la fonction génique a été limitée aux gènes distal au locus. Pour surmonter (au moins en partie) cette limitation et élargir les possibilités d’analyses génétiques basées sur MADM, les cassettes MADM ont été frappées à proximité des centromères de Chr. 751, Chr. 1146, et Chr. 1251. Cibler les 19 autosomes de souris avec des cassettes MADM est en cours et permettra à pratiquement n’importe quel gène d’être étudié à l’avenir, fournissant une plate-forme inégalée pour l’étude des relations de lignée développementale en combinaison avec l’analyse génétique fonctionnelle.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

À partir d’un bassin limité d’ancêtres, le cortex cérébral des mammifères forme des circuits neuronaux fonctionnels très organisés. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents régulant les transitions de lignée des cellules souches neuronales (NSC) et la production éventuelle de neurones et de glie dans le neuroépithélium en développement restent flous. Les méthodes permettant de retracer les schémas de division du CSN et de cartographier la lignée des cellules liées au clonally ont progressé de façon spectaculaire. Cependant, de nombreuses techniques contemporaines de traçage de lignée souffrent de l’absence de résolution cellulaire du destin des cellules de descendance, ce qui est essentiel pour déchiffrer les modèles de division cellulaire progénitrice. Présenté est un protocole utilisant l’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) pour effectuer l’analyse clonale in vivo. MADM manipule de façon concomitante les cellules progénitrices individuelles et visualise des schémas de division précis et la progression de la lignée à une résolution unique sans précédent. Les événements de recombinaison interchromosomiques basés à MADM pendant la phase G2-X de la mitose, ainsi que le CreERT2,inductible temporellement, fournissent des informations exactes sur les dates de naissance des clones et leurs modèles de division. Ainsi, le traçage de lignée MADM fournit des lectures optiques qualitatives et quantitatives sans précédent du mode de prolifération des progéniteurs de cellules souches au niveau des cellules uniques. MADM permet également d’examiner les mécanismes et les exigences fonctionnelles des gènes candidats dans la progression de la lignée NSC. Cette méthode est unique en ce que l’analyse comparative des sous-clones de contrôle et mutants peut être effectuée dans le même environnement tissulaire in vivo. Ici, le protocole est décrit en détail, et les paradigmes expérimentaux pour employer MADM pour l’analyse clonale et le traçage de lignée dans le cortex cérébral en développement sont démontrés. Fait important, ce protocole peut être adapté pour effectuer l’analyse clonale MADM dans n’importe quelle niche de cellules souches murines, tant que le pilote CreERT2 est présent.

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Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Un protocole pour effectuer le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau d’une seule cellule à l’aide de l’analyse de mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM) est présenté. L’analyse clonale de MADM fournit un cadre quantitatif pour mesurer le comportement prolifératif, la sortie cellulaire, et la relation de lignée des ancêtres individuels et de leurs cellules de fille.

Traçage de lignée et analyse clonale dans le développement du cortex cérébral à l’aide de l’analyse mosaïque avec des marqueurs doubles (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaic Analysis avec double marqueurs technologie est une méthode puissante qui peut fournir des informations hautement quantitatives sur le comportement de prolifération et les sorties de cave des cellules souches individus. Une caractéristique unique de cette technique, c’est qu’elle permet le traçage de lignée et l’analyse génétique fonctionnelle des gènes candidats au niveau de la cellule unique. Pour induire des événements de recombinaison MADM chez des souris expérimentales, utilisez une seringue de 1 ml équipée d’une aiguille de calibre 25 pour livrer une seule injection de Tamoxifène Intraperitoneal dans une période jusqu’à la mère enceinte. De l’analyse clonale MADM aux points de temps postnatals. Les jours embryonnaires 18 à 19, placer une souris enceinte dans la position supine et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Faire une petite incision dans la peau dans le bas-ventre au-dessus de l’utérus et faire une deuxième incision à travers les muscles et la paroi musculaire abdominale pour révéler le péritoine. Utilisez des ciseaux pour séparer l’utérus des tissus environnants et placez l’utérus intact dans un gant avec de l’eau chaude. Ensuite, utilisez des ciseaux à pointe fine et les doigts pour ouvrir soigneusement les parois utérine pour libérer les embryons. Nettoyez les chiots en appuyant doucement sur la poitrine de temps en temps pour commencer à respirer avant de transférer les animaux prénatals à une mère adoptive. Pour recueillir le tissu clone MADM neural placer un animal anesthésié dans la position supine sur un plateau de chirurgie de perfusion et désinfecter la fourrure avec 70% d’éthanol. Utilisez des ciseaux et des forceps pour faire une incision à travers la peau et une incision à travers la couche musculaire. Lorsque la cavité thoracique est visible, renifler et soulever le diaphragme pour révéler le cœur et soigneusement couper et épingler la cage thoracique au tray.insert chirurgical une aiguille reliée à un tube pompe périssaliste rempli de PBS dans le ventricule inférieur gauche du cœur et utiliser de petits ciseaux Iris pour faire une incision dans l’extrémité postérieure de l’oreillette droite. Perfuser le système cardiovasculaire avec le PBS suivi immédiatement par perfusion avec de la glace fraîchement préparée froid 4%paraformaldéhyde dans PBS. Lorsque la perfusion est terminée, enlever le cerveau par dissection soigneuse et placer l’organe récolté dans au moins cinq fois le volume cérébral de 4% de paraformaldéhyde frais pendant la nuit à 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

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Recherche

Biologie

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