Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
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Wir danken allen Mitgliedern des Hippenmeyer-Labors für die Diskussion, der Bioimaging Facility, Life Science Facility und der Pre-Clinical Facility am IST Austria für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von den institutionellen Fonds des IST Austria unterstützt; R.B. erhielt Unterstützung vom Programm DesÖsterreichischen Wissenschaftsfonds (FWF) Lise-Meitner (M 2416); N.A erhielt Unterstützung vom Wissenschaftsfonds (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC erhielt Unterstützung aus dem Forschungs- und Innovationsprogramm Horizont 2020 der Europäischen Union im Rahmen der Marie-Skodowska-Curie-Zuschussvereinbarung Nr. 754411 als POSTdoktorandin von ISTplus; Unterstützung erhielt A.H. von einem ÖAW DOC (Doktorandenstipendium der Österreichischen Akademie der Wissenschaften). Diese Studie wurde auch vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizont 2020 der Europäischen Union (Grant Agreement No 725780 LinPro) an S.H. unterstützt.

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Eine Methode zur Verwendung von MADM zum Verfolgen der Zellabstammung einzelner RGPs in vivo im sich entwickelnden Neocortex wird beschrieben. In Kombination mit TM-induzierbarem CreERT2können MADM-Ereignisse präzise getaktet werden, was eine hochqualitative und quantitative visuelle Auslesung von Stammzellteilungsmustern auf Einzelzellebene ermöglicht. Durch die Titrate der gelieferten TM-Dosis kann in idealer Situation durchschnittlich weniger als ein Klon pro kortikaler Hemisphäre erreicht werden, was eine angemessene räumliche Trennung zur eindeutigen Unterscheidung einzelner Klone bietet. Durch die Aufrechterhaltung der Gewebeintegrität erfasst diese Methode auch wichtige Informationen über Position, Morphologie und absolute Zellzahlen. MADM Kassetten auf Chr. 117,11,12,46,56,57, auf Chr. 751, und das original MADM bei Rosa2647,53,59 wurden in MADM klonalen Analysestudien verwendet. Die hohe Auflösung einzelner Zellen bietet einen beispiellosen Einblick in die Morphologie und die klonale Beziehung von Tochterzellen und ermöglicht die livee Bildgebung von sich ausbreitenden Stammzellen und entstehenden Klonen46,52.
Kaiserschnitt und Förderung von Welpen für die Analyse von Klonen an postnatalen Zeitpunkten ist ein notwendiger und kritischer Schritt im Protokoll. Abhängig vom Gesundheitszustand der mit TM behandelten schwangeren Mutter kann es nicht notwendig sein, einen Kaiserschnitt durchzuführen. Die Aufzucht der Welpen bei einer Pflegemutter ist jedoch weiterhin erforderlich, da die mit tm behandelten Mütter Probleme beim Laktieren haben kann. Es wurden keine Unterschiede in der Notwendigkeit der Förderung mit verschiedenen CreERT2-Fahrern beobachtet. Sowohl MADM-Linien als auch Pflegemütter werden auf einem ausgezüchteten CD-1-Hintergrund gepflegt. Wenn ein Kaiserschnitt nicht erforderlich ist, kann der mit TM behandelten trächtigen Muttertier, der zur Erzeugung experimenteller Welpen verwendet wird, gemäß den Grundsätzen von 3R für zusätzliche Versuchszuchten wiederverwendet werden (beachten Sie, dass dies nur möglich ist, wenn Tierversuchslizenzen diese Praxis genehmigen). Pflegemütter können für die Pflege von Welpen innerhalb von 2 Tagen nach der Geburt verwendet werden, aber höhere Erfolgsraten wurden beobachtet, wenn Pflegemütter am selben Tag wie die experimentellen Mäuse gebären, die gefördert werden müssen. Daher ist es wichtig, in Schritt 1.1 zeitzeitliche Paarungen für Pflegemütter parallel zu experimentellen Paarungen einzurichten. Die Aufrechterhaltung einer ähnlichen Wurfzahl wie der Wurf der ursprünglichen Pflegemutter kann die Überlebensrate von pflegefördernden Welpen verbessern, und daher kann die Entfernung einiger der ursprünglichen Abfälle erforderlich sein. Weitere Schritte, die die Pflege verbessern können, umfassen das Reiben der Handschuhe des Experimentators mit Wurf und Nahrung (um den Duft der Handschuhe zu entfernen); Reiben der Welpen sanft nach dem Kaiserschnitt mit Fragmenten der Pflegemutter verschmutzten Wurf und Nest; und Platzierung der Welpen in engem Kontakt mit den Welpen der Pflegemutter vor ihrer Platzierung im Pflegemauskäfig.
Wie bei anderen reporterbasierten Linienverfolgungsmethoden muss bei der Auswahl des optimalen CreERT2-Treibers für MADM-Klonexperimente sorgfältig berücksichtigt werden. Erstens muss der verwendete Promotor die Rekombinantase sowohl zeitlich als auch räumlich in der Vorläuferpopulation von Interesse ausdrücken. Diesen Promoter zu finden, kann eine Herausforderung sein, da einige Promoter Ausdrucksmuster ändern oder in verschiedenen Entwicklungsstadien zum Schweigen gebracht werden können. Zur Verbesserung der Zelltypspezifität wurden mehrere standortspezifische Rekombinatoasen verwendet, die jeweils von separaten Promotoren angetrieben werden. Wenn eine oder beide Rekombinanten in derselben Zelle exprimiert werden, wird die Zelle und ihre Nachkommen mit einem fluoreszierenden Reporter74,75,76,77. Zusammenfassend ist es wichtig, einen CreERT2-Treiber zu wählen, der spezifisch für die Population der untersuchten Vorfahren ist.
Der wichtigste Schritt bei dieser Methode ist die Identifizierung eines Klons, da alle Zellen eindeutig von einem einzelnen Rekombinationsereignis abgeleitet werden müssen (Schritt 8.1). Die Titration der TM-Konzentration gewährleistet weniger als einen Cluster rot/grüner Zellen pro Gehirnhälfte und maximiert die Wahrscheinlichkeit, einen einzelnen Klon zu analysieren (Schritt 2.2)7,11. Klone sollten verworfen werden, wenn benachbarte Zellcluster innerhalb von 500 m des Klons von Interesse auftreten. Daher ist es wichtig, mehrere Abschnitte vor und nach dem Auftreten eines Klons zu untersuchen, um sicherzustellen, dass sich keine zusätzlichen Rekombinationsereignisse in der Nähe befinden. Aufgrund des schwächeren Signals der Fluorophore ist es notwendig, die Immunhistochemie für eGFP und tdT in embryonalen Klonen durchzuführen (siehe Abschnitt 6). Dies wird nur bei erwachsenen Klonen empfohlen, wenn zusätzliche Antigene mitetikettiert werden. Bei der Abbildung von Klonen ist es wichtig, die gesamte Breite des Kortex zu erfassen, in dem sich der Klon befindet (d. h. von der Pialoberfläche bis zum Corpus callosum; siehe Schritt 8.4), um keine Zellen zu verpassen. Dies erleichtert auch die Bildausrichtung während der Bildverarbeitung (Abschnitt 9). Abschnitt 8 des Protokolls erfordert ein invertiertes konfokales Mikroskop, kann aber je nach verfügbarem Mikroskop angepasst werden. Epifluoreszenzmikroskopie kann verwendet werden, aber konfokale Mikroskopie wird empfohlen, da dies zu einer Abnahme der Lichtkontamination von außerhalb der Fokusebene führt. Es ist auch wichtig, dass die Laserintensität und -verstärkung so eingestellt wird, dass grüne, rote und gelbe Zellen eindeutig identifiziert werden können. Unabhängig vom Setup wird empfohlen, ein Ziel von mindestens 20x zu verwenden, um eine vollständige räumliche Trennung von eng positionierten Zellen zu gewährleisten. Zusätzlich zur Aufzeichnung der kortikalen Tiefe aller Zellen (Schritt 8.6) müssen kortikale Bereiche, in denen sich die Klone befinden, mit einem Hirnatlas wie dem Allen Brain Atlas oder anderen stereotaxic-Koordinatenkarten identifiziert werden. Außerdem sollte ein Dateibenennungsparadigma gewählt werden, um sicherzustellen, dass Klonbilder leicht identifizierbar sind. Die folgenden Informationen könnten in die Dateibenennung aufgenommen werden: eindeutige Bild-ID, Datumsbild wurde aufgenommen, Genotyp des Tieres, Alter der Induktion, Alter der Analyse, Bildnummer in Bezug auf den Rest der Bilder aus demselben Klon.
Die Einführung einer Mutation distal in einer MADM-Kassette ermöglicht unverwechselbar die Erzeugung von genetischen Mosaiken71 und ermöglicht die Zerlegung molekularer Regulatoren von Abstammung und Zelltypvielfalt auf klonaler Ebene7,11,46,62. Um ein genetisches Mosaik mit MADM zu erzeugen, müssen die MADM-Kassetten meiotisch mit demselben Chromosom wie das Gen von Interesse verknüpft sein (siehe Abbildung 2 für Zuchtschema). Dies beschränkt die aktuelle klonale Analyse mit MADM auf Gene, die sich auf Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251und Chr. 6 distal auf den Rosa26 Lokus47befinden. Zukünftige Studien werden MADM-Kassetten verwenden, die auf jedes Chromosom ausgerichtet sind, was die Mosaikanalyse praktisch aller Gene des Mausgenoms auf klonaler Ebene ermöglicht.
Schließlich beschränkt sich MADM nicht auf die Analyse von Vorläuferzellen im sich entwickelnden Neocortex. Die Untersuchung vieler Stammzellnischen könnte von der Fähigkeit profitieren, räumlich zeitliche Anordnungen klonal verwandter Zellen zu lösen. Durch die Anwendung von MADM auf andere Regionen des Gehirns, Krankheitszustände (z. B. Krebs) oder in anderen Geweben47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, Studien ergaben Abstammungsbeziehungen in Klonen, die aus verschiedenen Klassen von Vorläufer- und Stammzellen stammen (siehe Tabelle 1 für aktuelle Liste der CLonalstudien madM). Eine weitere interessante zukünftige Anwendung von MADM ist es, es mit zusätzlichen funktionalen oder subzellulären Reportern zu kombinieren, die den Grad der Informationen erhöhen würden, die von Klonen erworben werden können.

Die Großhirnrinde ist eine hochorganisierte Struktur, die aus sechs unterschiedlichen Schichten besteht. Der Kortex enthält eine Vielzahl von Zelltypen, einschließlich Neuronen und Glia, die interagieren, um funktionelle neuronale Schaltkreise zu bilden. Die meisten, wenn nicht alle, kortikalen exzitatorischen Projektionsneuronen und Glia werden aus einem gemeinsamen Pool von neuronalen Stammzellen (NSCs) abgeleitet, die als radiale Gliavorläufer (RGPs)1,2,3bekannt sind. RGPs selbst werden aus neuroepithelialen Stammzellen (NESCs) abgeleitet, die das frühe embryonale Neuroepithel bilden. Am embryonalen Tag 9 (E9) bei Mäusen beginnen NESCs mit dem Übergang zu RGPs4. Die Progression der RGP-Linien erfordert eine genaue zeitliche und räumliche Regulation, und wenn dieser Prozess behindert wird, können schwere neurologische Störungen wie Megalenzephalie, Mikrozephalie, Lissenzephalie oder Beeinträchtigungen wie Schizophrenie und Autismus5,6führen. Bei E10 durchlaufen die meisten RGPs symmetrische proliferative Divisionen, was zu einer Erweiterung des neuronalen Vorläuferpools4,7führt. RGPs beginnen schließlich, sich asymmetrisch zu teilen, wodurch kortikale Projektionsneuronen in zeitlich definierter Weise produziert werden. Durch aufeinander folgende Wellen der Neurogenese wandern neugeborene Neuronen in die kortikale Platte bildende kortikale Laminae mit frühgeborenen Neuronen, die tiefe Schichten besetzen, und spätgeborenen Neuronen, die in den oberflächlichen Schichten8,9,10leben. Da klonal verwandte pyramidale Neuronen radial in den Kortex mit sehr geringer tangentialer Dispersion wandern, neigen Tochterzellen dazu, eine säulenförmige oder kegelförmige Struktur zu bilden, die als neuronale radiale Einheit4,11,12,13bezeichnet wird. Durch E17 ist die embryonale neurogene Expansion bei Mäusen abgeschlossen14. RGPs können auch ependymale Zellen und einige Klassen von Glia produzieren, einschließlich Astrozyten und Oligodendrozyten1,15,16,17,18,19. Das Potenzial von RGPs, sowohl Neuronen als auch Astrozyten hervorrufen zu können, scheint in allen kortikalen Regionen18konsistent zu sein, wobei etwa 1/6 der neurogenen RGPs ebenfalls Glia11produzieren.
Derzeit sind die genetischen und epigenetischen Faktoren, die das zeitliche Fortschreiten einer Stammzelle entlang ihrer Abstammung regulieren, weitgehend unbekannt. Zeitliche Muster der Genexpression können erhebliche Auswirkungen auf Abstammungsentscheidungen in RGPs20,21,22,23,24haben. Wie diese eng maschinale Beziehung zwischen zeitlicher und räumlicher Musterung zur molekularen Vielfalt adulter neuronaler Typen über kortikale Bereiche hinweg führt, ist nicht bekannt. Ebenso ist die Frage, wie das individuelle Stammzellpotential und seine zelluläre Leistung auf zellulärer und molekularer Ebene moduliert wird, eine wichtige unbeantwortete Frage. Zukünftige Studien werden hoffentlich einige dieser Fragen angehen und letztendlich unser Verständnis der funktionellen kortikalen Schaltungsbildung erweitern.
Die Entwicklungsneurobiologie versucht, die Abstammungsbeziehung zu verstehen, die Zellen im Gehirn miteinander teilen. Anfangs standen nur sehr wenige Forschungsinstrumente dafür zur Verfügung, und viele frühe Studien stützten sich auf visuelle Beobachtungen von Teilungsmustern in transparenten Organismen wie Caenorhabditis elegans25. In den letzten Jahrzehnten hat eine dramatische Zunahme der Anzahl und Raffinesse der verfügbaren Techniken13,26,27,28,29gesehen. Die Entstehung des CRISPR-Cas9 Genom-Editing-Systems ermöglicht eine synthetische Rekonstruktion von Zelllinienbeziehungen durch die Einführung sich entwickelnder DNA-Barcodes27,30. Zwei aktuelle Beispiele für Barcoding-Strategien umfassen die Verwendung von Homing-Guide-RNA, die CRISPR-Cas9 auf bestimmte DNA-Barcode-Loci oder eine Cytidin-Deaminase lenkt, die mit Nickase Cas9 verschmolzen ist, um endogene interspersierte Wiederholungsbereiche31,32zu zielen. Diese Technologien bieten hochmultiplexierte Ansätze durch die Einführung von Barcodes, die im Laufe der Zeit schrittweise und stabil einzigartige Mutationen ansammeln. Genom-Editing-Ansätze sind sehr wertvoll, da sie eine rückwirkende Analyse der Beziehung zwischen zwei beliebigen Zellen basierend auf der gemeinsamen Vererbung dieser Barcodes ermöglichen. Um die Barcodes in einzelnen Zellen lesen zu können, muss jedoch in der Regel das Gewebe gestört werden, so dass Informationen über Position, Morphologie und absolute Zellzahlen eines einzelnen Vorläufers verloren gehen.
Kombinatorische Etikettierungsparadigmen bewahren räumliche Informationen und ermöglichen grundsätzlich auch die Unterscheidung zwischen eng lokalisierten oder sogar überlappenden Klonen33,34. Damit eine Linienverfolgungsmethode informativ ist, muss sie einzelne Vorläufer und ihre Nachkommen spärlich und unauslöschlich kennzeichnen. Bemerkenswert ist, dass die Brainbow35 und Konfetti36,37 Ansätze verwenden stochastische multicolor Cre Recombinase-basierte Reporter, die eine Kombination von fluoreszierenden Proteinen aus einem einzigen Ort auszudrücken. Die große Anzahl gleichzeitiger Farbkombinationen, die in vivo erreicht werden können, machen dies zu einem leistungsstarken Werkzeug bei der Verfolgung kortikaler RGP-Klone und Astrozyten34. Transposonbasierte Systeme, die eine stabile genomische Integration von Transgenen ermöglichen, die fluoreszierende Reporter kodieren und die Linienverfolgung von kortikalen Vorläufern ermöglichen, wurden ebenfalls33,38,39,40,41entwickelt. Transposonbasierte Systeme haben einen zusätzlichen Vorteil, da der Reporter stabil in das Genom integriert und damit linienbezogene Tochterzellen zuverlässig kennzeichnen kann. Um Astrozytenlinien speziell zu verfolgen, wurden eine Reihe von Methoden entwickelt, die die Elektroporation von PiggyBac-Transposasen einschließlich Star Trackbeinhalten, die eine Kombination von Konstrukten verwendet, die verschiedene fluoreszierende Proteine40,42kodieren. Ein anderer Ansatz, MAGIC Marker, führt Brainbow-Vektoren als transponierbare Transgene ein. Dies wurde erfolgreich verwendet, um embryonale neuronale und Astrozyten-Vorläufer34,43zu verfolgen. Kürzlich wurde eine Mosaikanalyse durch dualen rekombinatoren Kassettenaustausch (MADR) gefunden, um mutierte Zellen stabil zu kennzeichnen, die transgene Elemente aus genau definierten chromosomalen Loci44exlastebar machen. Diese leistungsstarken in vivo kombinatorischen Etikettierungstechniken haben zahlreiche Einblicke in die Abstammungsdynamik von Vorläuferzellen gegeben. Diese Analysen werden jedoch auf festem Gewebe durchgeführt und liefern eine Momentaufnahme einzelner Klone in einem definierten Entwicklungsstadium. Um Veränderungen in der Abstammungsdynamik einzelner Klone im Laufe der Zeit zu beobachten, müssen chronische in vivo-Bildgebungsmethoden angewendet werden, die denen im adulten Dentate-Gyrus ähneln45.
Die Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM) ist eine leistungsstarke Dual-Color-Labeling-Methode, die die In-vivo-Linienverfolgung einzelner Vorläuferzellen in Mäusen46,47ermöglicht. Zwei Komponenten sind für MADM-Etikettierungsereignisse notwendig: Erstens müssen MADM-Kassetten auf identische Loci auf homologen Chromosomen ausgerichtet sein. Kassetten bestehen aus zwei chimären fluoreszierenden Reportergen, eGFP (grün, [G]) und Tandem-Dimer Tomato (rot, tdT[T]). Die GT-Kassette enthält den N-Terminus von eGFP und den C-Terminus von tdT, getrennt durch ein Intron, das eine loxP-Site enthält. Die TG-Kassette ist umgekehrt mit dem N-Terminus von tdT und dem C-Terminus von eGFP konstruiert. Zweitens ist die Cre Expression der Cre-Recombinase in derselben Zelle, die die zielgerichteten MADM-Kassetten enthält, von wesentlicher Bedeutung. In Ermangelung von Credrücken die chimerischen Kassetten keine funktionelle eGFP oder tdT aus, da ihre Codierungssequenzen gestört sind. Die loxP-Standorte dienen als Ziel für die cre-mediale interchromosomale Rekombination, was zur gleichzeitigen Rekonstitution beider Expressionskassetten führt. Wenn eine Rekombination während der G2-Phase des Zellzyklus gefolgt von X-Segregation (G2-X) auftritt, exprimieren die beiden Tochterzellen jeweils eines der beiden fluoreszierenden Proteine. Die zeitliche Regulierung der CreERT2-Aktivität mit Tamoxifen (TM) liefert genaue Informationen über das Geburtsdatum von MADM-Klonen und die Teilungsmuster ihrer Nachkommen (Abbildung 1A)29,46,47.
MADM kann potenziell systematisch einzelne Klone mit hoher Einzelzellauflösung im Maushirn ähnlich wie herkömmliche, aber unspezifische und mühsame Methoden wie Golgi Färbung48 oder Farbstofffüllung49kennzeichnen. Da nur der Promotor, der CreERT2 antreibt, die Zelltypspezifität der klonalen MADM-Etikettierung bestimmt, kann MADM grundsätzlich für die klonale Linienverfolgung in allen murinen Organen undGeweben 47,50,51,52angewendet werden. Tatsächlich haben Studien bereits MADM verwendet, um Abstammungsbeziehungen in Klonen zu offenbaren, die aus verschiedenen Geweben abgeleitet sind47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentelle Paradigmen wurden angewendet, um Linie in kortikalen Projektion neuronen, glia, und postnatalen Stammzellen in der sich entwickelnden Neocortex7,,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM wurde auch verwendet, um Zelllinien in den erwachsenen Dentate Gyrus, Thalamus, Kleinhirn-Granulat-Zellen und Interneuronen auf klonaler Ebene zu untersuchen (siehe Tabelle 1 für eine vollständige Liste)47,53,54,56,57,66.
Ein einzigartiges Merkmal von MADM ist die Fähigkeit, Mutationen genetisch mit einer MADM-Kassette zu verknüpfen und so ein genetisches Mosaik zu erzeugen (Abbildung 1B und Abbildung 2). Dies führt zu wildlebenden Tochterzellen, die mit einem fluoreszierenden Marker (tdT in Abbildung 1B)und homozygoten mutierten Geschwistern mit den anderen (eGFP in Abbildung 1B) in einer unbeschrifteten heterozygoten Umgebung beschriftet sind. MADM ist einzigartig, da eine vergleichende Analyse von Kontroll- und mutierten Subklonen in der gleichen Gewebeumgebung in vivo durchgeführt werden kann. Ursprünglich wurden MADM-Kassetten in den Rosa26-Lokus 47gezielt, aber die MADM-Analyse der Genfunktion beschränkte sich auf Gene, die auf den Ort distal distal waren. Um diese Einschränkung (zumindest teilweise) zu überwinden und die Möglichkeiten für MADM-basierte Genanalysen zu erweitern, wurden MADM-Kassetten in der Nähe der Zentromere von Chr. 751, Chr. 1146und Chr. 1251eingeschlagen. Die Ausrichtung auf alle 19 Maus-Autosomen mit MADM-Kassetten ist in Arbeit und ermöglicht es, praktisch jedes Gen in der Zukunft zu untersuchen, was eine unvergleichliche Plattform für die Untersuchung von Entwicklungslinienbeziehungen in Kombination mit funktioneller genetischer Analyse bietet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Ausgehend von einem begrenzten Pool von Vorläufern bildet die Säugetiergroßrinde hochorganisierte funktionelle neuronale Schaltkreise. Die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen, die Linienübergänge neuronaler Stammzellen (NSCs) und die letztendliche Produktion von Neuronen und Glia im sich entwickelnden Neuroepithel regulieren, bleiben jedoch unklar. Methoden zum Nachverfolgen von NSC-Divisionsmustern und zur Kartierung der Abstammung klonal verwandter Zellen haben sich dramatisch weiterentwickelt. Jedoch, viele zeitgenössische Linie Tracing-Techniken leiden unter dem Mangel an zellulärer Auflösung der Nachkommenzell Schicksal, die für die Entschlüsselung VorläuferzellTeilung Muster ist wesentlich. Präsentiert wird ein Protokoll, das Mosaikanalysen mit Doppelmarkern (MADM) verwendet, um in vivo clonale Analysen durchzuführen. MADM manipuliert gleichzeitig einzelne Vorläuferzellen und visualisiert präzise Teilungsmuster und Linienverlauf bei beispielloser Einzelzellauflösung. MADM-basierte interchromosomale Rekombinationsereignisse während der G2-X-Phase der Mitose, zusammen mit zeitlich induzierbarem CreERT2,liefern genaue Informationen über die Geburtsdaten von Klonen und deren Teilungsmuster. Somit bietet die MADM-Linienverfolgung beispiellose qualitative und quantitative optische Auslesungen des Proliferationsmodus von Stammzellvorläufern auf Einzelzellebene. MADM ermöglicht auch die Untersuchung der Mechanismen und funktionellen Anforderungen von Kandidatengenen in der NSC-Linienprogression. Diese Methode ist einzigartig, da eine vergleichende Analyse von Kontroll- und mutierten Subklonen in der gleichen Gewebeumgebung in vivo durchgeführt werden kann. Hier wird das Protokoll ausführlich beschrieben, und experimentelle Paradigmen zur Verwendung von MADM für die klonale Analyse und Linienverfolgung in der sich entwickelnden Großhirnrinde werden demonstriert. Wichtig ist, dass dieses Protokoll angepasst werden kann, um MADM Klonanalyse in jeder murinen Stammzellnische durchzuführen, solange der CreERT2 Treiber vorhanden ist.

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Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Es wird ein Protokoll zur Verfolgung und funktionellen genetischen Analyse von Kandidatengenen auf Einzelzellebene mithilfe von Mosaikanalysen mit Doppelmarkern (MADM) vorgestellt. Die CLonale MADM-Analyse bietet einen quantitativen Rahmen, um das proliferative Verhalten, die zelluläre Leistung und die Abstammungsbeziehung einzelner Vorfahren und ihrer Tochterzellen zu messen.

Lineage Tracing und Clonal Analysis bei der Entwicklung von Zerebralparese mit Mosaikanalyse mit Doppelmarkern (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaikanalyse mit Double Markers Technologie ist eine leistungsstarke Methode, die hochquantitative Informationen über das Proliferationsverhalten und Kellerausgänge von Individuen Stammzellen liefern kann. Ein einzigartiges Merkmal dieser Technik ist, dass sie die Linienverfolgung und funktionelle genetische Analyse von Kandidatengenen auf der Single Cell level.demontrating to procedure ermöglicht, Carmen Streicher, Ihre Technikerin, Nicole Amberge, Post-Doc, Gisselle Cheung, Post-Doc und Andy Hansen, ein Doktorand aus meinem Labor. Um MADM-Rekombinationsereignisse bei experimentellen Mäusen zu induzieren, verwenden Sie eine 1ml Spritze, die mit einer 25-Messgerät-Nadel ausgestattet ist, um eine einzige Injektion von Tamoxifen Intraperitoneal in eine zeitversetzte, schwangere Mutter zu liefern. Von der KLonalanalyse madM bis hin zu postnatalen Zeitpunkten. Legen Sie an den embryonalen Tagen 18 bis 19 eine trächtige Maus in die Supine-Position und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut im Unterbauch über der Gebärmutter und machen Sie einen zweiten Schnitt durch die Muskeln und die bauchige Muskelwand, um das Peritoneum zu offenbaren. Verwenden Sie eine Schere, um die Gebärmutter von den umgebenden Geweben zu trennen und legen Sie die intakte Gebärmutter in einen Handschuh mit warmem Wasser. Dann verwenden Sie feine Spitze Schere und Finger, um sorgfältig die Gebärmutterwände zu öffnen, um die Embryonen zu befreien. Reinigen Sie die Welpen, die von Zeit zu Zeit sanft die Truhen drücken, um die Atmung zu initiieren, bevor sie die pränatalen Tiere zu einer Pflegemutter überführen. Um neuronales MADM-Klongewebe zu sammeln, legen Sie ein anästhesiertes Tier in die Supine-Position auf einem Perfusions-Operationstablett und desinfizieren Sie das Fell mit 70% Ethanol. Verwenden Sie Schere und Zange, um einen Schnitt durch die Haut und einen Schnitt durch die Muskelschicht zu machen. Wenn die Brusthöhle sichtbar ist, schnüffeln und heben Sie das Zwerchfell, um das Herz zu offenbaren und vorsichtig zu trimmen und stecken Sie den Rippenkäfig an die chirurgische Schale. Legen Sie eine Nadel mit einer peristaltischen Pumpe Schlauch mit PBS gefüllt in die untere linke Herzkammer und verwenden Sie kleine Iris Schere, um einen Schnitt in der hinteren Ende des rechten Atriums zu machen. Durchdringen Sie das Herz-Kreislauf-System mit dem PBS, gefolgt von einer Perfusion mit frisch zubereitetem eiskaltem 4%Paraformaldehyd in PBS. Wenn die Perfusion abgeschlossen ist, entfernen Sie das Gehirn durch sorgfältige Zerlegung und legen Sie das geerntete Organ mindestens das Fünffache des Gehirnvolumens von frischem 4%Paraformaldehyd über Nacht bei 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Eine Neuronale und Astrocyte Co-Kultur-Assay für High Content Analyse der Neurotoxizität

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Forschung

Biologie

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Die Analyse der DNA-Doppelstrang Break (DSB) Reparatur in Säugerzellen

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Obst-Volatile-Analyse mit einem elektronische Nase

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisierung und Analyse von mRNA Moleküle mittels Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisierung in<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Schnelle und effiziente Verwendung von Zebrafisch-Genotypisierung PCR mit Hochauflösende Schmelzanalyse

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Die Analyse der Autophagie in<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Mithilfe von Starvation Pads in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-Source-Einzelpartikelanalyse für Super Resolution Mikroskopie mit VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL-Cholesterin-Aufnahme-Assay mit Live Cell Imaging-Analyse mit Zelle Systemüberwachung

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...