Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

אנו מודים לכל חברי המעבדה לדיון, מתקן Bioimaging, מדעי החיים ומתקן טרום-קליני באוסטריה IST לתמיכה טכנית. עבודה זו נתמכת על ידי קרנות מוסדיים של הIST האוסטרי; R.B. קיבל תמיכה מקרן המדע האוסטרי (FWF) ליזה מייטנר (M 2416); נ. א. התקבלה תמיכה מקרן המדע האוסטרית (FWF) פירברג-פרוגרמה (T 1031); GC קיבל תמיכה מאופק 2020 של האיחוד האירופי תוכנית מחקר וחדשנות תחת מארי Skłodowska-קירי מענק הסכם No. 754411 כעמית ISTplus פוסט דוקטורט; A.H. קיבל תמיכה מ-ÖAW DOC (מלגת הדוקטורט של האקדמיה האוסטרית למדעים). מחקר זה היה נתמך גם על ידי מועצת המחקר האירופי (ERC) תחת אופק האיחוד האירופי של 2020 תוכנית מחקר וחדשנות (הסכם הענקת No 725780 LinPro) כדי S.H.

. למחברים אין מה לגלות

שיטה להשתמש MADM לעקוב אחר השושלת הסלולרית של RGPs בודדים בvivo בקליפת המוח המתפתחת מתוארת. בשילוב עם TM-inducible CreerT2, אירועים madm יכול להיות בדיוק מתוזמן, מתן בדיקה חזותית איכותית מאוד כמותית של דפוסי החלוקה של תא גזע ברמת התא בודד. על ידי titrating המינון של TM מועברת, במצב אידיאלי ממוצע של פחות משיבוט אחד לחצי הכדור הקליפת המוח ניתן להשיג, מתן הפרדה מרחבית נאותה להבדיל חד משמעית שיבוטים בודדים. על ידי שמירה על שלמות רקמות, שיטה זו גם לוכדת מידע חיוני לגבי מיקום, מורפולוגיה, ומספרי תאים מוחלטים. קלטות madm על Chr. 11,11,12,46,56,57, על chr. 751, ואת madm המקורי ב Rosa2647,53,59 שימשו במחקרים madm שבטים. ברזולוציה גבוהה של תאים בודדים מספק תובנה חסרת תקדים לתוך המבנה והקשר שבטיים של תאים ביתי ומאפשרת הדמיה חיה של תאי גזע מתרבים ושיבוטים המתעוררים46,52.
ניתוח קיסרי וטיפוח הגורים לניתוח של שיבוטים בשעת לידה פוסט לידה הוא צעד הכרחי וקריטי בפרוטוקול. בהתאם למצב הבריאותי של הסכר בהריון TM שטופלו, ייתכן שלא יהיה צורך לבצע ניתוח קיסרי. עם זאת, העלאת גורים עם אמא אומנת עדיין נדרש, כי האם TM מטופלים יכול להיות בעייתי מנקה. הבדלים לא נצפו בצורך לטפח עם נהגים שונים של CreerT2 . שני קווי MADM ואמהות מאמצות נשמרים על רקע CD-1 החוצה. אם ניתוח קיסרי אינו הכרחי, הסכר TM שטופלו בהריון בשימוש כדי לייצר כלבלבים ניסיוני ניתן לעשות שימוש חוזר עבור ברים ניסיוניים נוספים בהתאם לעקרונות של 3R (לשים לב כי זה יכול להיעשות רק אם רישיונות בעלי חיים לאשר לאשר בפרקטיקה זו). אמהות מאמצות יכולות לשמש לטיפוח הגורים בתוך יומיים לאחר שילדו, אך שיעורי הצלחה גבוהים יותר נצפו כאשר אמהות מאמצות נותנות לידה באותו היום כמו העכברים הניסיוניים שחייבים להיות מאומצים. לכן, חשוב להגדיר מתגים מתוזמנים עבור אמהות מאמצות במקביל למטגים ניסיוניים בשלב 1.1. שמירה על מספר המלטה דומה המלטה של אמא אומנת המקורי יכול לשפר את שיעור ההישרדות של הגורים הטיפחו, ולכן הסרה של חלק כל המלטה המקורי עשוי להיות הכרחי. צעדים נוספים העשויים לשפר את הטיפוח כוללים לשפשף את כפפות הניסויים בפסולת ומזון (כדי להסיר את ניחוח הכפפות); לשפשף בעדינות את הגורים לאחר ניתוח קיסרי עם שברי המלטה המלוכלכת של אמא אומנה, לקנן; והצבת הגורים במגע הקרוב עם גורי האם המאמצת לפני מיקומם בכלוב העכבר המאומץ.
כמו בשיטות אחרות המבוססות על כתב היוחסין, שיקול זהיר יש לנקוט בעת בחירת הנהג האופטימלי של CreerT2 עבור ניסויים שבטים madm. ראשית, היזם צריך להביע את הrecombinase הן זמנית באופן זמני באוכלוסייה הקדמון של העניין. מציאת מיזם זה יכול להיות מאתגר, משום שיזמים מסוימים עשויים לשנות דפוסי ביטוי או להיות מושתקים בשלבים שונים של התפתחות. כדי לשפר את סוג התא הספציפי recombinases ספציפיים לאתר, כל אחד מהם מונע על ידי היזמים נפרדים, נעשה שימוש. כאשר אחד או שניהם recombinases מבוטאים באותו תא, זה מתייג את התא ואת צאצאה עם כתבת פלורסנט74,75,76,77. לסיכום, חשוב לבחור את מנהל ההתקן של CreerT2 הספציפי לאוכלוסיה של ושלתי מנותח.
השלב הקריטי ביותר בשיטה זו הוא זיהוי של שיבוט, מכיוון שעל כל התאים להיות נגזרים באופן חד משמעי מאירוע שילוב מחדש יחיד (שלב 8.1). טיטור של ריכוז TM מבטיח פחות מאשכול אחד של תאים אדומים/ירוקים לחצי הכדור המוח ומגדיל את ההסתברות לנתח שיבוט יחיד (שלב 2.2)7,11. יש להיפטר ממשובטים אם אשכולות שכנים של תאים מתרחשים בתוך 500 יקרומטר של שיבוט של ריבית. לכן, חשוב לבחון מספר סעיפים לפני ואחרי הופעתו של שיבוט כדי להבטיח כי אין אירועים נוספים שילוב מחדש בקרבת מקום. בשל האות החלשה של fluorophores, יש צורך לבצע אימונוהיסטוכימיה עבור eGFP ו tdT ב שיבוטים עובריים (ראה סעיף 6). זה מומלץ רק בשיבוטים למבוגרים אם אנטיגנים נוספים יהיו מיופילים. כאשר הדמיה שיבוטים, חשוב ללכוד את הרוחב כולו של קליפת המוח שבו השיבוט ממוקם (כלומר, ממשטח pial כדי callosum קורפוס; ראה שלב 8.4) כדי לא להחמיץ תאים. פעולה זו מקלה גם על יישור תמונה במהלך עיבוד תמונה (סעיף 9). סעיף 8 של הפרוטוקול דורש מיקרוסקופ קונפוקלית וקד הפוך, אבל ניתן להתאים בהתאם לכיוונון המיקרוסקופ זמין. ניתן להשתמש במיקרוסקופיה אפיפלואורסצנטית, אך מיקרוסקופיה קונפוקלית מומלצת משום שזה מוביל לירידה בזיהום האור מחוץ למישור המיקוד. חשוב גם שעוצמת הלייזר והרווח מותאמים כך שניתן יהיה לזהות את התאים הירוקים, האדומים והצהובים. ללא קשר לכיוונון, מומלץ להשתמש במטרה של 20x לפחות כדי להבטיח הפרדה מרחבית מלאה של תאים ממוקמים היטב. בנוסף להקלטה של עומק קליפת המוח של כל התאים (שלב 8.6), אזורים קורטיקליים שבהם המשובטים ממוקמים חייב להיות מזוהה באמצעות אטלס המוח כגון אטלס המוח אלן או מפות קואורדינטות סטריאוטקאית אחרת. הפרדיגמה למתן שמות לקבצים צריכה להיות גם מאומצת כדי לוודא שתמונות שיבוט ניתנות לזיהוי בקלות. ניתן לכלול את המידע הבא בשמות הקבצים: מזהה תמונה ייחודי, תמונת תאריך צולמה, גנוטיפ של בעל חיים, גיל אינדוקציה, גיל ניתוח, מספר תמונה ביחס לשאר התמונות מאותו שיבוט.
הקדמה של מוטציה בתוך הקלטת madm אחד באופן מאפשר את הדור של פסיפסים גנטיים71 ומאפשר את הניתוח של הרגולטורים המולקולריים של השושלת ואת סוג התאים השונות ברמה שבטיים7,11,46,62. כדי ליצור פסיפס גנטי עם MADM, את הקלטות MADM חייב להיות מקושר באופן דומה לכרומוזום זהה כמו גן העניין (ראה איור 2 לצורך רבייה). זה מגביל את ניתוח המשובטים הנוכחי עם MADM לגנים הממוקמים Chr. 751, chr. 1146, chr. 1251, ו Chr. 6 הRosa26 לוקוס47. מחקרים עתידיים ישתמשו בקלטות MADM ממוקדות כל כרומוזום, המתיר ניתוח פסיפס של כמעט כל הגנים של הגנום העכבר ברמת המשובטים.
לבסוף, MADM אינו מוגבל לניתוח של תאים מחולל קדמון בקליפת המוח המתפתחת. המחקר של נישות רבות של תאי גזע יכול להפיק תועלת מהיכולת לפתור הסדרים זמן של תאים קשורים. על-ידי החלת madm לאזורים אחרים של המוח, תנאי מחלה (למשל, סרטן), או ברקמות אחרות47,50,51,52,53,54,55,56,57,58, 59,, מחקריםחשפו שושלת היוחסין קשרים במשובטים נגזר מכיתות מגוונות של מחולל שבטים ותאי גזע (ראה שולחן 1 לרשימה עוד יישום מעניין בעתיד של MADM היא לשלב אותו עם כתבים פונקציונליים או subcellular נוספים, אשר יגדיל את מידת המידע שניתן לרכוש מן המשובטים.

קליפת המוח היא מבנה מאורגן מאוד המורכב משש שכבות נפרדות. קליפת המוח מכילה מערך מגוון של סוגי תאים כולל נוירונים ו גליה, אשר מקיימים אינטראקציה של מעגלים עצביים פונקציונליים. רוב, אם לא כולם, הקרנה בקליפת הגזע נוירונים ולגליה נגזר מתוך מאגר משותף של התאים העצביים העצבית (NSCs) המכונה גליה הרדיאלי ושלתי (rgps)1,2,3. RGPs עצמם נגזרות של תאי גזע נוירואפיתל (NESCs) ההלחנה נוירואפיתל מוקדם מתחלקים. ביום העובריים 9 (E9) בעכברים, NESCs מתחיל לעבור לתוך RGPs4. Rgp התקדמות השושלת דורש באופן מדויק ורגולציה מרחבית, וכאשר תהליך זה מפריע, הפרעות נוירולוגיות חמורות כגון מגלונצפלוס, microcephaly, lissencephaly, או ליקויים כגון סכיזופרניה ואוטיזם יכול לגרום5,6. בשנת E10, רוב rgps לעבור מחלקות מתרבים סימטרי, וכתוצאה מכך התרחבות של בריכת הקדמון העצבי4,7. RGPs בסופו של דבר להתחיל לחלק סימטרית, לייצר נוירונים הקרנה הקורטיקלית באופן זמני מוגדר. באמצעות גלים רצופים של נוירוגנזה, הנירמול היילוד להגר לתוך לוחית קליפת המוח ויוצרים למינציה הקליפת המוח עם הנוירונים הנולדים מוקדם הכובש שכבות עמוקות והנוירונים הנולדים מאוחר המתגוררים שכבות שטחיות8,9,10. בגלל clonally הנוירונים הקשורים הניריונים להעביר רדיוally לתוך קליפת המוח עם פיזור מאוד קטן, תאים בתים נוטים ליצור טור או מבנה חרוט בצורת המכונה יחידה הרדיאלי עצביים4,11,12,13. על ידי E17, הרחבה מתחלקים הנוירוגניים הושלמה עכברים14. Rgps יכול גם לייצר תאים ependymal וכמה מחלקות של גליה, כולל אסטרוציטים ו oligodendrocytes הפוך1,15,16,17,18,19. הפוטנציאל של rgps כדי להצמיח הן נוירונים ו אסטרוציטים נראה עקבי על פני כל האזורים קליפת המוח18, עם כ 1/6 של הנוירוגניים rgps גם להפקת glia11.
כיום, הגורמים הגנטיים והאפיגנטיים המסדיר את ההתקדמות הטמפורלית של תא גזע לאורך שושלת היוחסין שלה הם בעיקר לא ידועים. דפוסי הזמני של ביטוי גנים יכול להיות השפעה ניכרת על החלטות השושלת ב rgps20,21,22,23,24. כיצד זה מערכת יחסים הדוקה בין הזמני לבין מרחבית מוביל מגוון מולקולרי של סוגים נוירוונאליות מבוגרים באזורים הקורטיקליים לא ידוע. כמו כן, כיצד הפוטנציאל של תא גזע בודד התפוקה התאית שלו מאופנן ברמה התאית והמולקולרית היא שאלה חשובה ומלא מענה. מחקרים עתידיים בתקווה לטפל בכמה מהשאלות האלה, בסופו של דבר הרחבת ההבנה שלנו של היווצרות מעגלים קורטיקלית תפקודית.
בביולוגיה התפתחותית מבקשת להבין את מערכת היחסים של שושלת היוחסין שתאים במוח משתפים אחד עם השני. בתחילה, מעט מאוד כלי מחקר היו זמינים עבור זה, ומחקרים מוקדמים רבים הסתמך על תצפיות ויזואליות של דפוסי החלוקה באורגניזמים שקופים כגון האלגיה של Caenorditis25. העשורים האחרונים ראו עלייה דרמטית במספר ותחכום של טכניקות זמין13,26,27,28,29. הופעתה של מערכת עריכת הגנום crispr-Cas9 מאפשר שחזור סינתטי של קשרי השושלת של התא על ידי החדרת ברקודים DNA מתפתחת27,30. שתי דוגמאות האחרונות של אסטרטגיות barcoding כוללים את השימוש של מדריך ביות RNA המכוון crispr-Cas9 כדי ספציפי ברקוד ה-DNA הבית או cytidine deaminase התמזגו עם nickase Cas9 למקד את היעד באזורים חוזרים31,32. טכנולוגיות אלה מספקים גישות מובנות מאוד דרך המבוא של ברקודים כי בהדרגה לצבור מוטציות ייחודיות לאורך זמן. גישות לעריכת הגנום הן בעלות ערך רב משום שהן מאפשרות ניתוח רטרואקטיבי של היחסים בין שני תאים המבוססים על הירושה המשותפת של ברקודים אלה. עם זאת, כדי לקרוא את ברקודים בתאים בודדים, הרקמה בדרך כלל חייב להיות מופרת, ולכן מידע לגבי מיקום, מורפולוגיה, ומספרי התאים המוחלט של מחולל קדמון בודד הוא איבד.
קומבינטורית תיוג תבניות לשמר מידע מרחבי ועקרונית גם לאפשר את ההבחנה בין מקומי היטב או אפילו חופפים שיבוטים33,34. עבור שיטת העקיבה השושלת כדי להיות אינפורמטיבי זה חייב לתייג ושלתי בודדים שלהם צאצאים בצורה דלילה ומלא מחיק. בעיקר, המוח35 ו קונפטי36,37 גישות להשתמש סטוכסטי recombinase היצורים הצבעוניים מבוססי כתבים המבטאים שילוב של חלבונים פלורסנט מתוך לוקוס יחיד. המספר הנרחב של שילובים צבע סימולטני שניתן להשיג ב vivo להפוך את זה כלי רב עוצמה בעת מעקב שיבוטים rgp הקורטיקלית ו אסטרוציטים34. טרנספסון מערכות מבוססות מתן שילוב גנומי יציבה של כתבים פלורסנט קידוד המתיר מעקב השושלת של קליפת הושלתי יש גם פיתח33,38,39,40,41. טרנספסון מערכות מבוססות יש יתרון נוסף בכך מבנה העיתונאי להשתלב באופן מובן לתוך הגנום, ובכך באופן אמין התווית תאים ביתי הקשורות לבנות. כדי לעקוב אחר האסטרוציטים באופן ספציפי, מספר שיטות פותחו כי כרוך אלקטרופורציה של הטרנספט הספיצסים כולל מסלול כוכב, אשר עושה שימוש בשילוב של בנייה קידוד החלבונים פלורסנט שונים40,42. גישה נוספת, סמנים הקסם, מציג וקטורים בריינרד ברייסייבל כמו הטרנספנאין. זה כבר בשימוש בהצלחה להתחקות אחר עצבי מתחלקים אסטרוציט ושלתי34,43. לאחרונה, ניתוח פסיפס על ידי החלפת קלטת dual-recombinase-בתיווך (MADR) נמצא באופן בלתי נשכח תאים מוטנטים לבטא אלמנטים טרנסגניים מתוך המלון המוגדר בדיוק כרומוזום44. אלה חזקים בטכניקות תיוג vivo קומבינטורית סיפקו תובנות רבות לדינמיקה של שושלת היוחסין של תאים מחולל. עם זאת, ניתוחים אלה מבוצעים על רקמה קבועה, מתן תמונה של שיבוטים בודדים בשלב התפתחותי מוגדר. כדי לצפות בשינויים הדינמיקה השושלת של שיבוטים יחיד לאורך זמן, כרונית בשיטות הדמיה vivo דומה לאלה שבוצעו פיתול כישור למבוגרים בלבד צריך להיות מיושם45.
פסיפס ניתוח עם סמנים כפולים (madm) הוא בעל עוצמה כפול תיוג צבע שיטה המאפשרת מעקב vivo השושלת של תאים בודדים של מחולל שושלת בעכברים46,47. שני מרכיבים נחוצים עבור אירועים תיוג MADM להתרחש: ראשית, הקלטות MADM חייב להיות ממוקד זהה הרוח על הכרומוזומים הומוולוגיים. הקלטות מורכבות משני גנים של כתבת פלורסנט של צ'יאריק, eGFP (ירוק, [G]) ועגבניה דו-דימר (אדום, tdT [T]). הקלטת GT מכיל את ה-N-טרמינוס של egfp ואת C-הטרמינוס של tdt, מופרדים על ידי אינטרון המכיל אתר loxp. הקלטת TG בנויה בהיפוך, עם ה-N-טרמינוס של tdt ו-C הטרמינוס של egfp. שנית, הביטוי של היצור recombinase באותו תא המכיל את הקלטות madm ממוקד חיוני. בהעדר של היצור, הקלטות הצ לא מבטאותegfp פונקציונליים או tdt משום שרצפי הקידוד שלהם מובלים. אתרי ה-loxP משמשים כיעד לשילוב מחדש של מתווכת ביניהם, והתוצאה היא החוקה של שתי קלטות הביטוי בו זמנית. אם שילוב מחדש מתרחש במהלך השלב G2 של מחזור התא ואחריו הפרדה של X (G2-X), שתי התאים בתים לבטא אחד משני חלבונים פלורסנט. הוויסות הזמני של פעילות creerT2 באמצעות טממוקסיפן (TM) מספק מידע מדויק על תאריך הלידה של שיבוטים madm ואת דפוסי החלוקה של צאצאי שלהם (איור 1a)29,46,47.
MADM יכול פוטנציאל שיטתי תווית שיבוטים בודדים עם רזולוציה גבוהה תא יחיד במוח העכבר דומה מסורתי אך לא ספציפי שיטות מפרך כמו Golgi צביעת48 או מילוי צבע49. כי רק היזם המניע creerT2 קובע את סוג התא ספציפיות של תיוג madm שבטים, madm יכול בעיקרון להיות מיושם עבור השושלת היוחסין מעקב בכל איבר murine ורקמות47,50,51,52. אכן, מחקרים כבר השתמשו madm לחשוף את קשרי השושלת במשובטים שמקורם ברקמות שונות47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. תבניות ניסיוני madm הוחלו על שושלת היוחסין של הקרנה בקליפת המוח נוירונים, גליה, ותאי גזע לידה ב קליפת מוח מפתח7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. Madm שימש גם כדי ללמוד היוחסין של התאים בבית המשפחה gyrus מבוגרים, תלמוס, המוח בתאי גרגר עושה לבלר, ו interneurons ברמת המשובטים (ראה שולחן 1 עבור רשימה מלאה)47,53,54,56,57,66.
תכונה ייחודית של MADM היא היכולת לקשר גנטית מוטציות מאשר לקלטת MADM אחד, ובכך ליצור פסיפס גנטי (איור 1B ואיור 2). התוצאה היא בתאי בת מסוג פראי המסומנים עם סמן פלורסנט אחד (tdT באיור 1B) ו homozygous מוטציה אחים עם השני (egfp באיור 1b) בסביבה heterozygous ללא תווית. MADM הוא ייחודי בניתוח זה השוואתי של שליטה subclones מוטציה ניתן לבצע בסביבה רקמה זהה ב vivo. במקור, הקלטות MADM המיועדים לתוך Rosa26 לוקוס47, אבל ניתוח madm של הפונקציה גנטי היה מוגבל גנים המרוחק לוקוס. כדי להתגבר (לפחות חלקית) מגבלה זו ולהרחיב את האפשרויות של ניתוח מבוסס MADM הגנים, הקלטות MADM הפילו קרוב למרכז הריכוז של Chr. 751, Chr. 1146, ו Chr. 1251. מיקוד כל 19 העכבר האוטומטי עם הקלטות MADM הוא בעיצומו ויאפשר כמעט כל גן להיות למדו בעתיד, מתן פלטפורמה שאין כמוה למחקר של קשרי השושלת ההתפתחותית בשילוב עם ניתוח גנטי פונקציונלי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

קליפת המוח של היונקים יוצרת. מעגלים עצביים פונקציונליים מאוד מושלתי עם זאת, המנגנון הסלולר והמולקולרי הבסיסי המסדיר את מעברי השושלת של תאי גזע עצביים (NSCs) ובסופו של דבר הפקה של נוירונים ו glia בהתפתחות נוירואפיתל נשאר ברור. שיטות למעקב אחר דפוסי החטיבה לבטחון לאומי ולמפות את השושלת של התאים הקשורים clonally מתקדמים באופן דרמטי. עם זאת, הרבה טכניקות מעקב של השושלת העכשווית סובלים מחוסר הרזולוציה התאית של הגורל תאים הצאצא, אשר חיוני לפענוח דפוסי החלוקה תא מחולל קדמון. הציג הוא פרוטוקול באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM) לבצע בניתוח vivo שבטים. ב-MADM במקביל מניפולציה בתאי קדמון בודדים ומדמיין דפוסי חלוקה מדויקים והתקדמות השושלת ברזולוציית תא בודדת חסרת תקדים. מבוסס MADM מבוססי אירועים שילוב מחדש במהלך השלב G2-X של mitosis, יחד עם זמניות inducible CreerT2, לספק מידע מדויק על תאריכי הלידה של שיבוטים דפוסי החלוקה שלהם. לפיכך, מעקב MADM השושלת מספק הקריאות אופטי כמותי איכותניות וכמותית של מצב התפשטות של תא גזע ושלתי ברמת התא בודד. MADM מאפשרת גם לבדיקת המנגנונים והדרישות הפונקציונליות של הגנים המועמדים בהתקדמות השושלת ההמועצה לבטחון לאומי. שיטה זו היא ייחודית בניתוח השוואתי של בקרה ושיבוטים מוטציה ניתן לבצע באותה סביבה רקמה ב vivo. כאן, הפרוטוקול מתואר בפרוטרוט, והתפיסות הנסיוניות להעסיק את MADM עבור ניתוח שבטים ומעקב השושלת בקליפת המוח המתפתח מומחש. חשוב מכך, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לבצע ניתוח שבטים MADM בנישה כל מורטין תא גזע, כל עוד מנהל ההתקן של CreerT2 קיים.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

פרוטוקול לבצע מעקב שושלת היוחסין ניתוח גנטי פונקציונלי של גנים המועמדים ברמת תא בודד באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM) מוצג. ניתוח שבטים MADM מספק מסגרת כמותית כדי למדוד את ההתנהגות ההתרבות, הפלט הסלולר, ואת הקשר השושלת של ושלתי בודדים ותאי הבת שלהם.

איתור השושלת וניתוח שבטים בפיתוח קליפת המוח באמצעות ניתוח פסיפס עם סמנים כפולים (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

ניתוח פסיפס עם טכנולוגיית סמנים כפולים היא שיטה רבת עוצמה שיכולה לספק מידע כמותי מאוד על התנהגות התפשטות ותפוקות מרתף של תאי גזע בודדים. תכונה ייחודית של טכניקה זו, היא שהיא מאפשרת מעקב שושלת וניתוח גנטי תפקודי של גנים מועמדים ברמה תא יחיד.demontrating לפרוצדורה יהיה, כרמן שטרייכר, הטכנאי שלך, ניקול אמברג', פוסט דוק, ג'יזל Cheung, פוסט דוק ואנדי הנסן, דוקטורנט מהמעבדה שלי. כדי לגרום לאירועי קומבינציה של MADM בעכברים ניסיוניים, השתמש במזרק 1 מ"ל המצויד במחט 25 מד כדי לספק זריקה אחת של טמוקסיפן אינטרפריטונאלי לסכר מתוזמן להריון. מניתוח שיבוט MADM לנקודות זמן לאחר הלידה. בימים עובריים 18 עד 19, מניחים עכבר בהריון בתנור supine ולחטא את הפרווה עם 70% אתנול. בצע חתך קטן בעור בבטן התחתונה מעל הרחם ולעשות חתך שני דרך השרירים ואת דופן שרירי הבטן כדי לחשוף את peritoneum. השתמש במספריים כדי להפריד את הרחם מן הרקמות שמסביב ולמקום את הרחם שלם לתוך כפפה עם מים חמים. לאחר מכן השתמש מספריים קצה עדין ואצבעות כדי לפתוח בזהירות את קירות הרחם כדי לשחרר את העוברים. נקה את הגורים בעדינות לחיצה על החזה מעת לעת כדי ליזום נשימה לפני העברת בעלי החיים טרום לידתי לאם מאמצת. כדי לאסוף רקמת שיבוט MADM עצבית למקם חיה הרדמה בתמורת סופין על מגש ניתוח קיפוב ולחטא את הפרווה עם 70% אתנול. השתמש מספריים ומדפים כדי להפוך חתך אחד דרך העור חתך אחד דרך שכבת השריר. כאשר חלל בית החזה נראה לעין, לרחרח ולהרים את הסרעפת כדי לחשוף את הלב בזהירות לקצץ ולהצמיד את כלוב הצלעות למגש כירורגי.הכנס מחט המחוברת צינור משאבה פריסטלטית מלא PBS לתוך החדר השמאלי התחתון של הלב ולהשתמש מספריים איריס קטנה לעשות חתך בקצה האחורי של ההתנפחות הימנית. התבגר במערכת הלב וכלי הדם עם PBS ואחריו מיד על ידי זלוף עם קר קרח מוכן טרי 4% paraformaldehyde ב PBS. כאשר הזליבה הושלמה, להסיר את המוח באמצעות ניתוח זהיר ולמקום את האיבר שנקטף לפחות חמש פעמים את נפח המוח של טרי 4% paraformaldehyde לילה ב 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

ניתוח תיקון DNA פעמיים גדיל Break (DSB) בתאי יונקים

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

ניתוח בידוד פנוטיפי של Murine בתאי גזע hematopoietic ו-Lineage מחויבים אבות

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

פרי ניתוח נדיפים באמצעות האף האלקטרוני

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

הדמיה וניתוח של מולקולות ה-mRNA באמצעות הקרינה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה ב<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

מהירה ויעילה דג הזברה Genotyping באמצעות PCR עם רזולוציה גבוהה ממיסים ניתוח

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

ניתוח של Autophagy ב<em&gt; Chrysogenum Penicillium</em&gt; על ידי שימוש ברפידות רעב בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

ניתוח קוד פתוח Single-חלקיק למיקרוסקופיה סופר-רזולוציה עם VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

פרוטוקול המעבדה הגנטית ניתוחים תוכן הבטן של הימית Macroinvertebrates באמצעות קבוצה ספציפית rDNA תחל

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

ספיגת כולסטרול LDL Assay באמצעות תא חי הדמיה ניתוח עם התא לניטור תקינות

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...