Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
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हम चर्चा के लिए Hippenmeyer प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवाद, जैवएजिंग सुविधा, जीवन विज्ञान सुविधा, और पूर्व नैदानिक सुविधा IST ऑस्ट्रिया में तकनीकी सहायता के लिए । इस काम को आईएसटी ऑस्ट्रिया संस्थागत कोष द्वारा समर्थित किया गया था; आरबी को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) लिसे-मीननर कार्यक्रम (एम 2416) से समर्थन मिला; एन. ए को ऑस्ट्रियाई विज्ञान कोष (एफडब्ल्यूएफ) फिरनबर्ग-प्रोग्राम (टी 1031) से समर्थन मिला; जीसी को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम से मैरी स्क्लोडोवस्का-क्यूरी ग्रांट एग्रीमेंट नंबर 754411 के तहत आईएसटीप्लस पोस्टडॉक्टोरल फेलो के रूप में समर्थन मिला; A.H. एक ÖAW डॉक्टर (ऑस्ट्रिया के विज्ञान अकादमी के डॉक्टरेट फैलोशिप) से समर्थन प्राप्त किया । इस अध्ययन को यूरोपीय संघ के क्षितिज २०२० अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता संख्या ७२५७८० LinPro) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ईआरसी) द्वारा एसएच को भी समर्थन दिया गया ।

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

विकासशील नियोकॉर्टेक्स में वीवो में व्यक्तिगत आरजीपी के सेल वंश को ट्रैक करने के लिए एमएडीएम का उपयोग करने की एक विधि का वर्णन किया गया है। जब टीएम-अक्षुण्ण क्रेयरटी 2के साथ संयुक्त किया जाता है, तो एमएडीएम घटनाओं को ठीक से समय पर किया जा सकता है, जो एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल डिवीजन पैटर्न का अत्यधिक गुणात्मक और मात्रात्मक दृश्य रीडआउट प्रदान करता है। टीएम डिलीवर की खुराक को तितर-लिखे करके, एक आदर्श स्थिति में प्रति कॉर्टिकल गोलार्द्ध में एक से कम क्लोन का औसत प्राप्त किया जा सकता है, जो स्पष्ट रूप से व्यक्तिगत क्लोनों को अलग करने के लिए पर्याप्त स्थानिक पृथक्करण प्रदान करता है। ऊतक अखंडता को बनाए रखने के द्वारा, इस विधि भी स्थिति, आकृति विज्ञान, और निरपेक्ष सेल संख्या के बारे में आवश्यक जानकारी कब्जा । सीआर 7 51 पर सीएचआर 117,,11, 12,,46,,12,56,,57पर एमएडीएम कैसेट और रोसा2647,53,,59 में मूल एमएडीएम का उपयोग एमएडीएम क्लोनल विश्लेषण अध्ययन में किया गया है।,53 व्यक्तिगत कोशिकाओं का उच्च संकल्प आकृति विज्ञान और बेटी कोशिकाओं के क्लोनल संबंध दोनों में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है और स्टेम कोशिकाओं और उभरते क्लोन46,,52के प्रसार की लाइव इमेजिंग की अनुमति देता है।
सीजेरियन सेक्शन और प्रसवोत्तर टाइमपॉइंट्स पर क्लोन के विश्लेषण के लिए पिल्ले को बढ़ावा देना प्रोटोकॉल में एक आवश्यक और महत्वपूर्ण कदम है। टीएम-इलाज गर्भवती बांध की स्वास्थ्य स्थिति के आधार पर, सीजेरियन सेक्शन करना आवश्यक नहीं हो सकता है। हालांकि, एक पालक मां के साथ पिल्ले स्थापना अभी भी आवश्यक है, क्योंकि टीएम इलाज मां मुसीबत स्तनपान हो सकता है । विभिन्न क्रेयरटी-2 ड्राइवरों के साथ बढ़ावा देने की आवश्यकता में कोई अंतर नहीं देखा गया है । दोनों MADM लाइनों और पालक माताओं एक outbred सीडी-1 पृष्ठभूमि पर बनाए रखा जाता है । यदि सीजेरियन सेक्शन आवश्यक नहीं है, तो प्रायोगिक पिल्ले उत्पन्न करने के लिए उपयोग किए जाने वाले टीएम-इलाज गर्भवती बांध को 3R के सिद्धांतों के अनुसार अतिरिक्त प्रायोगिक प्रजनन के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है (ध्यान दें कि यह केवल तभी किया जा सकता है जब पशु प्रायोगिक लाइसेंस इस अभ्यास को मंजूरी दें)। पालक माताओं को जन्म देने के बाद 2 दिनों के भीतर पिल्ले को बढ़ावा देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन उच्च सफलता दर देखा गया है जब पालक माताओं प्रयोगात्मक चूहों कि प्रोत्साहित किया जाना चाहिए के रूप में एक ही दिन पर जंम देते हैं । इसलिए, चरण 1.1 में प्रयोगात्मक संभोग के समानांतर पालक माताओं के लिए समय पर संभोग स्थापित करना महत्वपूर्ण है। मूल पालक मां के कूड़े के रूप में एक समान कूड़े की संख्या को बनाए रखने को बढ़ावा पिल्ले के जीवित रहने की दर में सुधार कर सकते हैं, और इसलिए मूल कूड़े के सभी के लिए कुछ को हटाने के लिए आवश्यक हो सकता है । अतिरिक्त कदम है कि बढ़ावा देने में सुधार हो सकता है कूड़े और भोजन के साथ प्रयोगकर्ता के दस्ताने रगड़ शामिल है (दस्ताने की खुशबू को दूर करने के लिए); पालक मां के गंदे कूड़े और घोंसले के टुकड़ों के साथ सीजेरियन सेक्शन के बाद पिल्ले को धीरे से रगड़ना; और पालक माउस पिंजरे में उनके प्लेसमेंट से पहले पालक मां के पिल्ले के साथ निकट संपर्क में पिल्ले की नियुक्ति ।
अन्य रिपोर्टर-आधारित वंश ट्रेसिंग विधियों की तरह, एमएडीएम क्लोनल प्रयोगों के लिए इष्टतम क्रेयरटी-2 ड्राइवर का चयन करते समय सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, इस्तेमाल किए गए प्रमोटर को ब्याज की जनक आबादी में अस्थायी और स्थानिक दोनों को फिर से जोड़ना चाहिए। इस प्रमोटर ढूंढना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, क्योंकि कुछ प्रमोटर अभिव्यक्ति पैटर्न बदल सकते हैं या विकास के विभिन्न चरणों में खामोश हो सकते हैं। सेल प्रकार विशिष्टता में सुधार करने के लिए कई साइट-विशिष्ट पुनर्संयोजन, प्रत्येक अलग प्रमोटरों द्वारा संचालित, का उपयोग किया गया है। जब एक या दोनों पुनर्संयोजन एक ही कोशिका में व्यक्त किए जाते हैं, तो यह कोशिका और उसकी संतान को फ्लोरोसेंट रिपोर्टर74,75, 76,,,77के साथ लेबल करता है।,76 संक्षेप में, एक क्रेयरटी 2 ड्राइवर चुनना महत्वपूर्ण है जो जनकों की आबादी के लिए विशिष्ट है।
इस विधि में सबसे महत्वपूर्ण कदम क्लोन की पहचान है, क्योंकि सभी कोशिकाओं को एक पुनर्संयोजन घटना (चरण 8.1) से स्पष्ट रूप से प्राप्त किया जाना चाहिए। टीएम एकाग्रता का टिटरेशन मस्तिष्क गोलार्द्ध प्रति लाल/हरे रंग की कोशिकाओं के एक समूह से कम सुनिश्चित करता है और एक क्लोन (चरण 2.2)7,,11का विश्लेषण करने की संभावना को अधिकतम करता है। क्लोन को छोड़ दिया जाना चाहिए यदि कोशिकाओं के पड़ोसी समूह ब्याज के क्लोन के 500 माइक्रोन के भीतर होते हैं। इसलिए, क्लोन की उपस्थिति से पहले और बाद में कई वर्गों की जांच करना महत्वपूर्ण है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि आसपास कोई अतिरिक्त पुनर्संयोजन घटनाएं नहीं हैं। फ्लोरोफोरस के कमजोर संकेत के कारण, भ्रूण क्लोन में ईजीएफपी और टीडीटी के लिए इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री करना आवश्यक है (धारा 6 देखें)। यह केवल वयस्क क्लोन में अनुशंसित है यदि अतिरिक्त एंटीजन को कोलेबल किया जाएगा। जब इमेजिंग क्लोन, यह प्रांतस्था की पूरी चौड़ाई पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है, जहां क्लोन स्थित है (यानी, पायल सतह से कॉर्पस callosum के लिए; कदम ८.४ देखें) किसी भी कोशिकाओं को याद नहीं करने के लिए । यह इमेज प्रोसेसिंग (सेक्शन 9) के दौरान इमेज अलाइनमेंट की सुविधा भी देता है। प्रोटोकॉल की धारा 8 में एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है लेकिन उपलब्ध माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर अनुकूलित किया जा सकता है। एपिफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी की सिफारिश की जाती है क्योंकि इससे फोकस प्लेन के बाहर से प्रकाश संदूषण में कमी आती है। यह भी महत्वपूर्ण है कि लेजर तीव्रता और लाभ को समायोजित किया जाए ताकि हरे, लाल और पीले रंग की कोशिकाओं की स्पष्ट रूप से पहचान की जा सके। सेटअप के बावजूद, बारीकी से तैनात कोशिकाओं का पूर्ण स्थानिक पृथक्करण सुनिश्चित करने के लिए कम से कम 20x के उद्देश्य का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। सभी कोशिकाओं (चरण 8.6) की कॉर्टिकल गहराई को रिकॉर्ड करने के अलावा, कॉर्टिकल क्षेत्र जहां क्लोन स्थित हैं, उन्हें मस्तिष्क एटलस जैसे एलन ब्रेन एटलस या अन्य टकसाली समन्वय मानचित्रों का उपयोग करके पहचाना जाना चाहिए। क्लोन छवियों को आसानी से पहचानने योग्य हैं, यह सुनिश्चित करने के लिए एक फ़ाइल नामकरण प्रतिमान भी अपनाया जाना चाहिए। निम्नलिखित जानकारी फ़ाइल नामकरण में शामिल किया जा सकता है: अद्वितीय छवि आईडी, तिथि छवि लिया गया था, पशु का जीनोटाइप, प्रेरण की आयु, विश्लेषण की आयु, एक ही क्लोन से छवियों के बाकी के संबंध में छवि संख्या ।
एक एमएडीएम कैसेट में उत्परिवर्तन डिटल का परिचय विशिष्ट रूप से आनुवंशिक मोज़ेक71 के उत्पादन की अनुमति देता है और क्लोनल स्तर 7 ,11,46,,62,पर वंश और कोशिका प्रकार की विविधता के आणविक नियामकों के विच्छेदन की अनुमतिदेताहै। MADM के साथ एक आनुवंशिक पच्चीकारी उत्पन्न करने के लिए, MADM कैसेट को रुचि के जीन के रूप में एक ही गुणसूत्र से जुड़ा होना चाहिए (प्रजनन योजना के लिए चित्रा 2 देखें)। यह एमएडीएम के साथ वर्तमान क्लोनल विश्लेषण को सीएचआर 751,सीएचआर 1146,सीएचआर 1251और सीएचआर 6 डिस्टल से रोजा26 लोकस47पर स्थित जीन तक सीमित करता है। भविष्य के अध्ययनों से किसी भी गुणसूत्र के लिए लक्षित MADM कैसेट का उपयोग करेंगे, क्लोनल स्तर पर माउस जीनोम के लगभग सभी जीन के पच्चीकारी विश्लेषण की अनुमति ।
अंत में, एमएडीएम विकासशील नियोकॉर्टेक्स में जनक कोशिकाओं के विश्लेषण तक सीमित नहीं है। कई स्टेम सेल निकस के अध्ययन से क्लोनली संबंधित कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्थाओं को हल करने की क्षमता से लाभ हो सकता है। मस्तिष्क के अन्य क्षेत्रों में एमएडीएम लागू करके, रोग की स्थिति (जैसे, कैंसर), या अन्य ऊतकों में47,50,,51,,52,,,53,,54,,55,56,,57,58,,59,अध्ययनों से पता चला कि जनक और स्टेम कोशिकाओं के विविध वर्गों से प्राप्त क्लोन में वंश संबंध (एमएडीएम क्लोनल अध्ययन की वर्तमान सूची के लिए तालिका 1 देखें)।,, एमएडीएम का एक और दिलचस्प भविष्य का अनुप्रयोग इसे अतिरिक्त कार्यात्मक या उपकोशिकीय संवाददाताओं के साथ जोड़ना है, जो क्लोन से प्राप्त की जा सकने वाली जानकारी की डिग्री को बढ़ाएगा।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

जनकों के एक सीमित पूल से शुरू, स्तनधारी सेरेब्रल कॉर्टेक्स अत्यधिक संगठित कार्यात्मक तंत्रिका सर्किट बनाता है। हालांकि, अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं (एनएससी) के वंश संक्रमण और विकासशील न्यूरोएपिथेलियम में न्यूरॉन्स और ग्लिया के अंतिम उत्पादन को विनियमित करने वाले अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र अस्पष्ट बने हुए हैं। एनएससी डिवीजन पैटर्न का पता लगाने और क्लोनली से संबंधित कोशिकाओं के वंश को मैप करने के तरीके नाटकीय रूप से उन्नत हुए हैं। हालांकि, कई समकालीन वंश अनुरेखण तकनीकों जनक कोशिका भाग्य है, जो जनक सेल विभाजन पैटर्न समझने के लिए आवश्यक है के सेलुलर संकल्प की कमी से पीड़ित हैं । प्रस्तुत एक प्रोटोकॉल डबल मार्कर (MADM) के साथ पच्चीकारी विश्लेषण का उपयोग करने के लिए वीवो क्लोनल विश्लेषण में प्रदर्शन है । MADM सहवर्ती व्यक्तिगत जनक कोशिकाओं में हेरफेर और अभूतपूर्व एकल सेल संकल्प पर सटीक विभाजन पैटर्न और वंश प्रगति कल्पना । माइटोसिस के जी-एक्स चरण के दौरान एमएडीएम-आधारित इंटरक्रोमोमोमोमल पुनर्संयोजन घटनाओं, अस्थायी रूप से अपरिवर्तनीय क्रेयरटी 2के साथ, क्लोन की जन्म तिथि और उनके विभाजन पैटर्न के बारे में सटीक जानकारी प्रदान करते हैं। इस प्रकार, एमएडीएम वंश ट्रेसिंग एकल सेल स्तर पर स्टेम सेल जनकों के प्रसार मोड के अभूतपूर्व गुणात्मक और मात्रात्मक ऑप्टिकल रीडआउट प्रदान करता है। एमएडीएम एनएससी वंश प्रगति में उम्मीदवार जीन के तंत्र और कार्यात्मक आवश्यकताओं की जांच के लिए भी अनुमति देता है। यह विधि नियंत्रण के तुलनात्मक विश्लेषण में अद्वितीय है और उत्परिवर्ती उपकमान वीवो में एक ही ऊतक वातावरण में किया जा सकता है। यहां, प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन किया गया है, और विकासशील सेरेब्रल कॉर्टेक्स में क्लोनल विश्लेषण और वंश अनुरेखण के लिए एमएडीएम को नियोजित करने के लिए प्रयोगात्मक प्रतिमान का प्रदर्शन किया जाता है। महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल को किसी भी मुरीन स्टेम सेल आला में MADM क्लोनल विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जब तक कि क्रेयरटी 2 ड्राइवर मौजूद है।

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Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके एकल सेल स्तर पर उम्मीदवार जीन के वंश ट्रेसिंग और कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। MADM क्लोनल विश्लेषण उत्पादक व्यवहार, सेलुलर उत्पादन, और व्यक्तिगत जनक और उनकी बेटी कोशिकाओं के वंश संबंध को मापने के लिए एक मात्रात्मक ढांचा प्रदान करता है।

डबल मार्कर (एमएडीएम) के साथ मोज़ेक विश्लेषण का उपयोग करके सेरेब्रल कॉर्टेक्स विकसित करने में वंश ट्रेसिंग और क्लोनल विश्लेषण

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

डबल मार्कर प्रौद्योगिकी के साथ मोज़ेक विश्लेषण एक शक्तिशाली तरीका है जो व्यक्तियों स्टेम सेल के प्रसार व्यवहार और तहखाने आउटपुट के बारे में अत्यधिक मात्रात्मक जानकारी प्रदान कर सकता है। इस तकनीक की एक अनूठी विशेषता यह है कि यह एकल सेल स्तर पर उम्मीदवार जीन के वंश अनुरेखण और कार्यात्मक आनुवंशिक विश्लेषण की अनुमति देता है । प्रक्रिया के लिए राक्षसी हो जाएगा, कारमेन Streicher, अपने तकनीशियन, निकोल Amberge, पोस्ट डॉक्टर, Gisselle Cheung, पोस्ट डॉक्टर और एंडी हैनसेन, मेरी प्रयोगशाला से एक पीएचडी छात्र । प्रायोगिक चूहों में एमएडीएम पुनर्संयोजन घटनाओं को प्रेरित करने के लिए, गर्भवती बांध के समय में टैमोक्सिफेन इंट्रापेरिटोनियल का एक इंजेक्शन देने के लिए 25 गेज सुई से लैस 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें। MADM क्लोनल विश्लेषण से प्रसवोत्तर समय अंक के लिए । 18 से 19 के भ्रूणीय दिनों में, एक गर्भवती माउस को रीढ़ की स्थिति में रखें और 70% इथेनॉल के साथ फर को कीटाणुरहित करें। गर्भाशय के ऊपर पेट के निचले हिस्से में त्वचा में एक छोटा सा चीरा बनाएं और पेरिटोनम को प्रकट करने के लिए मांसपेशियों और पेट की मांसपेशियों की दीवार के माध्यम से एक दूसरा चीरा बनाएं। गर्भाशय को आसपास के ऊतकों से अलग करने के लिए कैंची का प्रयोग करें और बरकरार गर्भाशय को गर्म पानी के साथ दस्ताने में रखें। फिर भ्रूण को छोड़ने के लिए गर्भाशय की दीवारों को ध्यान से खोलने के लिए ठीक टिप कैंची और उंगलियों का उपयोग करें। पिल्ले धीरे एक पालक मां को जन्म के पूर्व जानवरों को स्थानांतरित करने से पहले सांस लेने शुरू करने के लिए समय-समय पर चेस्ट दबाने साफ । तंत्रिका MADM क्लोन ऊतक इकट्ठा करने के लिए एक पर्फ्यूजन सर्जरी ट्रे पर रीढ़ की स्थिति में एक एनेस्थेटाइज्ड जानवर जगह है और 70% इथेनॉल के साथ फर कीटाणुरहित। त्वचा के माध्यम से एक चीरा बनाने के लिए कैंची और संदंश का उपयोग करें और मांसपेशियों की परत के माध्यम से एक चीरा। जब वक्ष गुहा दिखाई देता है, तो दिल को प्रकट करने के लिए डायाफ्राम को सूंघें और उठाएं और ध्यान से शल्य चिकित्सा ट्रे में रिब पिंजरे को ट्रिम करें। पीबीएस से भरे एक पेरिस्टाल्टिक पंप ट्यूबिंग से जुड़ी सुई को दिल के निचले बाएं वेंट्रिकल में डालें और सही एरिट्रिम के पीछे के अंत में चीरा लगाने के लिए छोटे आइरिस कैंची का उपयोग करें। पीबीएस के साथ हृदय प्रणाली को पीबीएस में ताजा तैयार बर्फ ठंड 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तुरंत पीछा किया। जब परफ्यूजन पूरा हो जाता है, तो सावधानीपूर्वक विच्छेदन के माध्यम से मस्तिष्क को हटा दें और काटे गए अंग को कम से कम पांच बार ताजा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के मस्तिष्क की मात्रा को 4 पर रात भर रखें

Research

JoVE Journal

Biology

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LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

एलडीएल कोलेस्ट्रॉल सेल स्वास्थ्य की निगरानी के साथ लाइव सेल इमेजिंग विश्लेषण का उपयोग परख

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...