Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
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Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Hippenmeyer per la discussione, lo strumento di bioimaging, la struttura di scienze biologiche e lo strumento pre-clinico di IST Austria per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi istituzionali IST Austria; R.B. ha ricevuto il sostegno del programma lise-Meitner del Fondo scientifico austriaco (FWF) (M 2416); N.A ha ricevuto il sostegno del Fondo scientifico austriaco (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); Il programma di ricerca e innovazione orizzonte 2020 dell'Unione europea ha ricevuto il sostegno del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea nell'ambito dell'accordo di sovvenzione Marie Skaodowska-Curie n. 754411 in qualità di borsista post-dottorato ISTplus; A.H. ha ricevuto il sostegno di un DOC (Dottorato dell'Accademia austriaca delle scienze). Questo studio è stato sostenuto anche dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito del programma di ricerca e innovazione Orizzonte 2020 dell'Unione europea (accordo di sovvenzione n. 725780 LinPro) a S.H.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Viene descritto un metodo per utilizzare MADM per monitorare il lignaggio cellulare dei singoli RG in vivo nella neocorteccia in via di sviluppo. In combinazione con CreERT2,gli eventi MADM possono essere cronometrati con precisione, fornendo una lettura visiva altamente qualitativa e quantitativa dei modelli di divisione delle cellule staminali a livello di singola cellula. Titando la dose di TM consegnata, in una situazione ideale si può ottenere una media di meno di un clone per emisfero corticale, fornendo un'adeguata separazione spaziale per distinguere inmodo i singoli cloni. Mantenendo l'integrità dei tessuti, questo metodo acquisisce anche le informazioni essenziali per quanto riguarda la posizione, la morfologia e i numeri di cellule assolute. Cassette MADM su Chr. 117,11,12,46,56,57,su Chr. 751, e il MADM originale a Rosa2647,53,59 sono stati utilizzati negli studi di analisi clonale MADM. L'alta risoluzione delle singole cellule fornisce una visione senza precedenti sia della morfologia che del rapporto clonale delle cellule figlie e permette l'imaging dal vivo delle cellule staminali proliferanti e dei cloni emergenti46,52.
La sezione cesarea e la promozione dei cuccioli per l'analisi dei cloni ai tempi postnatali è un passo necessario e critico nel protocollo. A seconda dello stato di salute della diga incinta trattata con TM, potrebbe non essere necessario eseguire un taglio cesareo. Tuttavia, è ancora necessario allevare i cuccioli con una madre affidataria, perché la madre trattata in TM può avere problemi ad allattare. Non sono state osservate differenze nella necessità di affidarsi a diversi conducenti CreERT2. Sia le linee MADM che le madri affidatarie sono mantenute su uno sfondo di CD-1. Se il taglio cesareo non è necessario, la diga incinta trattata con TM utilizzata per generare cuccioli sperimentali può essere riutilizzata per ulteriori allevamenti sperimentali secondo i principi del 3R (si noti che questo può essere fatto solo se le licenze sperimentali animali approvano questa pratica). Le madri affidatarie possono essere utilizzate per l'affidamento dei cuccioli entro 2 giorni dal parto, ma sono stati osservati tassi di successo più elevati quando le madri affidatarie partoriscono lo stesso giorno dei topi sperimentali che devono essere promossi. Pertanto, è importante impostare accoppiamenti a tempo per le madri affidatarie in parallelo agli accoppiamenti sperimentali nel passaggio 1.1. Mantenere un numero simile a quello della lettiera della madre affidataria originale può migliorare il tasso di sopravvivenza dei cuccioli affidati, e quindi potrebbe essere necessaria la rimozione di alcuni di tutti i rifiuti originali. Ulteriori passaggi che possono migliorare l'adottazione includono lo sfregamento dei guanti dello sperimentatore con lettiera e cibo (per rimuovere il profumo dei guanti); strofinando delicatamente i cuccioli dopo la sezione cesarea con frammenti della lettiera sporca e del nido della madre adottiva; e il posizionamento dei cuccioli a stretto contatto con i cuccioli della madre affidataria prima del loro posizionamento nella gabbia dei topi adottivi.
Come in altri metodi di tracciamento del lignaggio basato su reporter, è necessario prestare attenzione quando si sceglie il driver CreERT2 ottimale per esperimenti clonali MADM. In primo luogo, il promotore utilizzato deve esprimere il ricombinarsi sia temporale che spaziale nella popolazione progenitrice di interesse. Trovare questo promotore può essere difficile, perché alcuni promotori possono cambiare i modelli di espressione o diventare silenziati in diverse fasi di sviluppo. Per migliorare la specificità del tipo di cellula sono stati utilizzati più ricombinasi specifici del sito, ciascuno guidato da promotori separati. Quando una o entrambe le ricombinazioni sono espresse nella stessa cella, questa etichetta la cella e la sua progenie con un reporter fluorescente74,75,76,77. In sintesi, è importante scegliere un driver CreERT2 specifico per la popolazione di progenitori analizzati.
Il passaggio più critico in questo metodo è l'identificazione di un clone, perché tutte le celle devono essere derivate senza ambiguità da un singolo evento di ricombinazione (passaggio 8.1). La titolazione della concentrazione di TM garantisce meno di un cluster di cellule rosse/verdi per emisfero cerebrale e massimizza la probabilità di analizzare un singolo clone (passaggio 2.2)7,11. I cloni devono essere scartati se i gruppi vicini di cellule si verificano entro 500 m dal clone di interesse. Pertanto, è importante esaminare diverse sezioni prima e dopo la comparsa di un clone per assicurarsi che non vi siano ulteriori eventi di ricombinazione nelle vicinanze. A causa del segnale più debole dei fluorofori, è necessario eseguire l'immunohistochimica per eGFP e tdT nei cloni embrionali (vedi sezione 6). Questo è raccomandato solo nei cloni adulti se gli antigeni aggiuntivi saranno coetichettati. Quando si immaginano i cloni, è importante catturare l'intera larghezza della corteccia in cui si trova il clone (cioè dalla superficie del pial al corpo calloso; vedi il punto 8.4) per non perdere alcuna cella. Ciò facilita anche l'allineamento dell'immagine durante l'elaborazione dell'immagine (sezione 9). La sezione 8 del protocollo richiede un microscopio confocale invertito, ma può essere adattata a seconda della configurazione del microscopio disponibile. La microscopia a epifluorescenza può essere utilizzata, ma la microscopia confocale è consigliata perché questo porta a una diminuzione della contaminazione della luce dall'esterno del piano di messa a fuoco. È inoltre importante che l'intensità e il guadagno del laser siano regolati in modo che le celle verdi, rosse e gialle possano essere identificate in modo inequivocabile. Indipendentemente dalla configurazione, si consiglia di utilizzare un obiettivo di almeno 20x per garantire la completa separazione spaziale delle celle strettamente posizionate. Oltre a registrare la profondità corticale di tutte le cellule (passaggio 8.6), le regioni corticali in cui si trovano i cloni devono essere identificate utilizzando un atlante cerebrale come l'atlante del cervello di Allen o altre mappe delle coordinate stereotassiche. Dovrebbe inoltre essere adottato un paradigma di denominazione dei file per assicurarsi che le immagini clonate siano facilmente identificabili. Le seguenti informazioni potrebbero essere incluse nella denominazione del file: ID immagine univoco, immagine data è stata scattata, genotipo di animale, età di induzione, età di analisi, numero di immagine in relazione al resto delle immagini dallo stesso clone.
L'introduzione di una mutazione distale a una cassetta MADM permette distintamente la generazione di mosaici genetici71 e permette la dissezione dei regolatori molecolari di lignaggio e diversità del tipo di cellula al livello clonale7,11,46,62. Per generare un mosaico genetico con MADM, le cassette MADM devono essere meioticamente collegate allo stesso cromosoma del gene di interesse (cfr. figura 2 per lo schema di allevamento). Questo limita l'attuale analisi clonale con MADM ai geni situati su Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251e Chr. 6 distale al locus Rosa26 47. Studi futuri utilizzeranno cassette MADM mirate a qualsiasi cromosoma, permettendo l'analisi del mosaico di praticamente tutti i geni del genoma del topo a livello clonale.
Infine, il MADM non si limita all'analisi delle cellule progenitrici nella neocorteccia in via di sviluppo. Lo studio di molte nicchie di cellule staminali potrebbe beneficiare della capacità di risolvere le disposizioni spatiotemporali di cellule clonate correlate. Applicando MADM ad altre regioni del cervello, le condizioni di malattia (ad esempio, il cancro), o in altri tessuti47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, gli studi hanno rivelato relazioni di lignaggio in cloni derivati da diverse classi di progenie e cellule staminali (vedere la tabella 1 per l'elenco corrente degli studi cloni MADM).50 Un'altra interessante applicazione futura di MADM è quella di combinarlo con ulteriori reporter funzionali o subcellulari, che aumenterebbero il grado di informazioni che possono essere acquisite dai cloni.

La corteccia cerebrale è una struttura altamente organizzata composta da sei strati distinti. La corteccia contiene una vasta gamma di tipi di cellule tra cui neuroni e glia, che interagiscono per formare circuiti neurali funzionali. La maggior parte, se non tutti, i neuroni di proiezione eccitatoria corticale e glia sono derivati da un pool comune di cellule staminali neurali (NSC) noto come i progenitori gliali radiali (RGP)1,2,3. Gli XML stessi sono derivati da cellule staminali neuroepiteliali (NESC) che compongono il neuroetag embrionale precoce. Entro il giorno embrionale 9 (E9) nei topi, i NESC iniziano a passare in RGP4. La progressione del lignaggio RGP richiede una precisa regolazione temporale e spaziale, e quando questo processo è ostacolato, gravi disturbi neurologici come megalenfalia, microcefalia, lissencephaly, o menomazioni come la schizofrenia e l'autismo possono risultare5,6. All'E10, la maggior parte degli RGP subiscono divisioni proliferanti simmetriche, con conseguente espansione del pool di progenitrici neurali4,7. Gli RGP alla fine iniziano a dividersi asimmetricamente, producendo neuroni di proiezione corticale in modo definito temporalmente. Attraverso ondate consecutive di neurogenesi, i neuroni neonati migrano nella piastra corticale formando laminari corticali con neuroni nati precoci che occupano strati profondi e neuroni nati tardi che risiedono negli strati superficiali8,9,10. Poiché i neuroni piramidali correlati clonalmente migrano radialmente nella corteccia con una piccola dispersione tangenziale, le cellule figlie tendono a formare una struttura a forma di colonna o cono, indicata come unità radiale neuronale4,11,1212,13. Entro e17, l'espansione neurogenica embrionale è completa nei topi14. Gli RGP possono anche produrre cellule ependymal e alcune classi di glia, tra cui astrociti e oligodendrociti1,15,16,17,18,19. Il potenziale degli RGP di dare origine sia ai neuroni che agli astrociti sembra essere coerente in tutte le regioni corticali18, con circa 1/6 di RGP neurogenici che producono anche glia11.
Attualmente, i fattori genetici ed epigenetici che regolano la progressione temporale di una cellula staminale lungo il suo lignaggio sono per lo più sconosciuti. I modelli temporali di espressione genica possono avere un impatto sostanziale sulle decisioni di lignaggio nei RGP20,21,22,23,24. Non è noto come questa relazione strettamente lavorata tra modelli temporali e spaziali porti alla diversità molecolare dei tipi neuronali adulti nelle aree corticali. Allo stesso modo, il modo in cui il potenziale delle singole cellule staminali e la sua produzione cellulare sono modulati a livello cellulare e molecolare è un'importante domanda senza risposta. Si spera che studi futuri affrontino alcune di queste domande, ampliando in ultima analisi la nostra comprensione della formazione funzionale dei circuiti corticali.
La neurobiologia dello sviluppo cerca di capire il rapporto di lignaggio che le cellule nel cervello condividono tra loro. Inizialmente, pochissimi strumenti di ricerca erano disponibili per questo, e molti primi studi si basavano su osservazioni visive di modelli di divisione in organismi trasparenti come Caenorhabditis elegans25. Gli ultimi decenni hanno visto un drammatico aumento del numero e della raffinatezza delle tecniche disponibili13,26,27,28,29. L'emergere del sistema di editing genomico CRISPR-Cas9 consente la ricostruzione sintetica delle relazioni di lignaggio cellulare introducendo codici a barre in evoluzione del DNA27,30. Due esempi recenti di strategie di codifica a barre includono l'uso di RNA guida homing che dirige CRISPR-Cas9 a specifici loci codice a barre DNA o un deaminasi civogliao fuso con nickase Cas9 per indirizzare regioni di ripetizione interspersed endogene31,32. Queste tecnologie forniscono approcci altamente multiplexed attraverso l'introduzione di codici a barre che accumulano progressivamente e stabilmente mutazioni uniche nel tempo. Gli approcci di editing genomico sono molto preziosi perché consentono un'analisi retroattiva della relazione tra due celle qualsiasi in base all'ereditarietà condivisa di questi codici a barre. Tuttavia, al fine di leggere i codici a barre in singole cellule, il tessuto di solito deve essere interrotto, e quindi le informazioni riguardanti la posizione, morfologia, e numeri di cella assoluti da un singolo progenitore viene perso.
I paradigmi di etichettatura combinatori contengono informazioni spaziali e, in linea di principio, consentono anche la distinzione tra cloni strettamente localizzati o addirittura sovrapposti33,34. Affinché un metodo di tracciamento del lignaggio sia informativo, deve etichettare i singoli progenitori e la loro progenie in modo scarso e indelebile. In particolare, il Brainbow35 e Confetti36,37 approcci utilizzano stocaststici multicolore Cre ricombinante a base di reporter che esprimono una combinazione di proteine fluorescenti da un unico locus. L'ampio numero di combinazioni di colori simultanei che possono essere raggiunte in vivo lo rendono uno strumento potente per tracciare cloni corticali RGP e astrociti34. Sono stati sviluppati anche sistemi basati su trasposoni che forniscono un'integrazione genomica stabile dei transgeni che codificano reporter fluorescenti e permettendo traccia lignaggio dei progenitori corticali sono stati sviluppati33,38,39,40,41. I sistemi basati su trasposoni hanno un ulteriore vantaggio in quanto il reporter costruisce un'integrazione stabilmente nel genoma, e quindi etichettare in modo affidabile cellule figlie correlate. Per tracciare specificamente le linee di astrociti, sono stati sviluppati una serie di metodi che coinvolgono l'elettroporazione delle trasposta piggyBac tra cui Star Track, che fa uso di una combinazione di costrutti che codificano diverse proteine fluorescenti40,42. Un altro approccio, MAGIC markers, introduce i vettori Brainbow come transgeni trasponibili. Questo è stato utilizzato con successo per tracciare progenitori neurali e astrociti embrionali34,43. Recentemente, è stata trovata un'analisi a mosaico da parte di un doppio scambio di cassette mediato ricombinante (MADR) per etichettare stabilmente le cellule mutanti che esprimono elementi transgenici da loci cromosomici precisamente definiti44. Queste potenti tecniche di etichettatura combinatoria in vivo hanno fornito numerose informazioni sulla dinamica del lignaggio delle cellule progenitrici. Tuttavia, queste analisi vengono eseguite su tessuto fisso, fornendo un'istantanea di singoli cloni in una fase di sviluppo definita. Per osservare i cambiamenti nella dinamica del lignaggio dei singoli cloni nel tempo, è necessario applicare metodi di imaging in vivo cronici simili a quelli eseguiti nel giro dentato adulto45.
L'analisi mosaica con doppio marcatore (MADM) è un potente metodo di etichettatura a doppio colore che consente la tracciatura del lignaggio in vivo delle singole cellule progenitrici nei topi46,47. Due componenti sono necessari per gli eventi di etichettatura MADM: in primo luogo, le cassette MADM devono essere mirate a loci identici sui cromosomi omologhi. Le cassette sono costituite da due geni di reporter fluorescenti chimerici, eGFP (verde, [G]) e dimero tandem Pomodoro (rosso, tdT[T]). La cassetta GT contiene il capoN di eGFP e il capo-C del tdT, separati da un intron contenente un sito loxP. La cassetta TG è costruita inversamente, con il capoN del tdT e il capo-C di eGFP. In secondo luogo, l'espressione di Cre ricombinarsi nella stessa cella contenente le cassette MADM mirate è essenziale. In assenza di Cre, le cassette chimesiche non esprimono eGFP funzionale o tdT perché le loro sequenze di codifica sono interrotte. I siti loxP fungono da bersaglio per la ricombinazione intercromosomica mediata da Cre, con conseguente ricostituzione simultanea di entrambe le cassette di espressione. Se la ricombinazione avviene durante la fase G2 del ciclo cellulare seguita dalla segregazione X (G2-X), le due cellule figlie esprimeranno ciascuna una delle due proteine fluorescenti. La regolazione temporale dell'attività CreERT2 mediante tamoxifene (TM) fornisce informazioni precise sulla data di nascita dei cloni MADM e sui modelli di divisione della loro progenie (Figura 1A)29,46,47.
MADM può potenzialmente etichettare sistematicamente singoli cloni con alta risoluzione cellulare singola nel cervello del topo simile ai metodi tradizionali ma non specifici e laboriosi come golgi colorazione48 o colorante riempimento49. Poiché solo il promotore di guida CreERT2 determina la specificità del tipo di cella dell'etichettatura CLONale MADM, MADM può in linea di principio essere applicato per la tracciatura del lignaggio clonale in qualsiasi organo murino e tessuto47,50,51,52. Infatti, gli studi hanno già utilizzato MADM per rivelare le relazioni di lignaggio in cloni derivati da tessuti diversi47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. I paradigmi sperimentali MADM sono stati applicati per studiare il lignaggio nei neuroni di proiezione corticale, glia e cellule staminali postnatali nella neocortecciainvia di sviluppo 7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM è stato utilizzato anche per studiare il lignaggio cellulare nel giro dentato adulto, talamo, cellule granule cerebellari, e interneuroni a livello clonale (vedi tabella 1 per un elenco completo)47,53,54,56,5757,66.
Una caratteristica unica di MADM è la capacità di collegare geneticamente le mutazioni distale a una cassetta MADM, creando così un mosaico genetico (Figura 1B e Figura 2). Questo si traduce in cellule figlie di tipo selvaggio etichettate con un marcatore fluorescente (tdT nella Figura 1B) e fratelli mutanti omoygous con l'altro (eGFP in Figura 1B) in un ambiente eterozigoso senza etichetta. IL MADM è unico in quanto l'analisi comparativa del controllo e dei subcloni mutanti può essere eseguita nello stesso ambiente tissutale in vivo. Originariamente, le cassette MADM erano mirate al locus Rosa26 47, ma l'analisi MADM della funzione genica era limitata ai geni disslocanti al locus. Per superare (almeno in parte) questa limitazione ed espandere le possibilità di analisi genica basata su MADM, le cassette MADM sono state bussate vicino ai centrimeri di Chr. 751, Chr. 1146e Chr. 1251. È in corso di mira tutti i 19 autosomes per topi con cassette MADM che consentirà di studiare praticamente qualsiasi gene in futuro, fornendo una piattaforma senza precedenti per lo studio delle relazioni di lignaggio dello sviluppo in combinazione con l'analisi genetica funzionale.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Partendo da un pool limitato di progenitori, la corteccia cerebrale dei mammiferi forma circuiti neurali funzionali altamente organizzati. Tuttavia, i meccanismi cellulari e molecolari sottostanti che regolano le transizioni di lignaggio delle cellule staminali neurali (NSC) e l'eventuale produzione di neuroni e glia nello sviluppo di neuroepitelio rimane poco chiaro. I metodi per tracciare i modelli di divisione NSC e mappare il lignaggio delle celle correlate clonalmente sono avanzati notevolmente. Tuttavia, molte tecniche di tracciamento del lignaggio contemporaneo soffrono della mancanza di risoluzione cellulare del destino delle cellule progenie, che è essenziale per decifrare i modelli di divisione delle cellule progenitori. Presentato è un protocollo che utilizza l'analisi a mosaico con doppi marcatori (MADM) per eseguire l'analisi clonale in vivo. MADM manipola concomitante singole cellule progenitrici e visualizza precisi modelli di divisione e progressione del lignaggio a una risoluzione cellulare singola senza precedenti. Gli eventi di ricombinazione intercromosomica basati su MADM durante la fase G2-X della mitosi, insieme a CreERT2,temporaneamente inducibili, forniscono informazioni esatte sulle date di nascita dei cloni e sui loro modelli di divisione. Pertanto, il tracciamento del lignaggio MADM fornisce letture ottiche qualitative e quantitative senza precedenti della modalità di proliferazione dei progenitori di cellule staminali a livello di singola cellula. MADM consente anche di esaminare i meccanismi e i requisiti funzionali dei geni candidati nella progressione del lignaggio NSC. Questo metodo è unico in quanto l'analisi comparativa del controllo e dei subcloni mutanti può essere eseguita nello stesso ambiente tissutale in vivo. Qui, il protocollo è descritto in dettaglio, e paradigmi sperimentali per impiegare MADM per l'analisi clonale e traccia di lignaggio nella corteccia cerebrale in via di sviluppo sono dimostrati. È importante sottolineare che questo protocollo può essere adattato per eseguire l'analisi clonale MADM in qualsiasi nicchia di cellule staminali murine, purché sia presente il driver CreERT2.

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Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Viene presentato un protocollo per eseguire il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di singola cellula utilizzando l'analisi del mosaico con doppi marcatori (MADM). L'analisi clonale MADM fornisce un quadro quantitativo per misurare il comportamento proliferativo, l'output cellulare e la relazione di lignaggio dei singoli progenitori e delle loro cellule figlie.

Tracciamento del lignaggio e analisi clonale nello sviluppo della Corteccia cerebrale utilizzando l'analisi mosaica con doppi marcatori (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

L'analisi del mosaico con tecnologia Double Markers è un metodo potente in grado di fornire informazioni altamente quantitative sul comportamento di proliferazione e sui risultati delle cantine delle cellule staminali degli individui. Una caratteristica unica di questa tecnica, è che consente il tracciamento del lignaggio e l'analisi genetica funzionale dei geni candidati a livello di cellula singola.demontrating alla procedura sarà, Carmen Streicher, la tua tecnica, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc e Andy Hansen, una dottoranda del mio laboratorio. Per indurre eventi di ricombinazione MADM in topi sperimentali, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 25 per fornire una singola iniezione di Tamoxifen Intraperitoneal in una diga a tempo in gravidanza. Dall'analisi clonale MADM ai punti di tempo postnatali. Nei giorni embrionali da 18 a 19, mettere un topo incinta in posizione supina e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Fai una piccola incisione nella pelle nell'addome inferiore sopra l'utero e fai una seconda incisione attraverso i muscoli e la parete muscolare addominale per rivelare il peritoneo. Utilizzare le forbici per separare l'utero dai tessuti circostanti e posizionare l'utero intatto in un guanto con acqua tiepida. Quindi utilizzare forbici e dita a punta fine per aprire attentamente le pareti uterine per rilasciare gli embrioni. Pulire i cuccioli premendo delicatamente i forzieri di tanto in tanto per iniziare a respirare prima di trasferire gli animali prenatali a una madre adottiva. Per raccogliere il tessuto clone MADM neurale posizionare un animale anestetizzato in posizione supina su un vassoio di chirurgia perfusione e disinfettare la pelliccia con il 70% di etanolo. Usa forbici e forcep per fare un'incisione attraverso la pelle e un'incisione attraverso lo strato muscolare. Quando la cavità toracica è visibile, annusare e sollevare il diaframma per rivelare il cuore e tagliare e fissare con cura la gabbia toracica al vassoio chirurgico.inserire un ago collegato a un tubo di pompazione peristaltico riempito con PBS nel ventricolo in basso a sinistra del cuore e utilizzare piccole forbici Iris per fare un'incisione nell'estremità posteriore dell'atrio destro. Perfondere il sistema cardiovascolare con il PBS seguito immediatamente da perfusione con ghiaccio freddo appena preparato 4% paraformaldeide in PBS. Quando la perfusione è completa, rimuovere il cervello attraverso un'attenta dissezione e posizionare l'organo raccolto in almeno cinque volte il volume cerebrale di paraformaldeide fresca al 4% durante la notte alle 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

Un neuronale e astrociti Co-Cultura Assay per l&#39;analisi dei contenuti elevati di neurotossicità

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Ricerca

Biologia

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