Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Vi takker alle medlemmer av Hippenmeyer-laboratoriet for diskusjon, Bioimaging Facility, Life Science Facility og Pre-Clinical Facility i IST Austria for teknisk støtte. Dette arbeidet ble støttet av IST Austria institusjonelle midler; R.B. fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner program (M 2416); N.A fikk støtte fra Austrian Science Fund (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fikk støtte fra EUs forsknings- og innovasjonsprogram for Horizon 2020 under Marie Skłodowska-Curie-tilskuddsavtalen nr. A.H. fikk støtte fra en ÖAW DOC (Doktorgradsstipendiat ved det østerrikske vitenskapsakademiet). Denne studien ble også støttet av European Research Council (ERC) under EUs Forsknings- og innovasjonsprogram Horizon 2020 (tilskuddsavtale No 725780 LinPro) til S.H.

Forfatterne har ingenting å avsløre.

En metode for å bruke MADM til å spore celleavledning av individuelle RGPs in vivo i den utviklende neocortex er beskrevet. Når madm-hendelser kombineres med TM-inducible CreERT2,kan madm-hendelser bli nøyaktig tidsforstilt, noe som gir en svært kvalitativ og kvantitativ visuell avlesning av stamcelledelingsmønstre på enkeltcellenivå. Ved å titrere dosen av TM levert, i en ideell situasjon kan et gjennomsnitt på mindre enn en klone per kortikale halvkule oppnås, noe som gir tilstrekkelig romlig separasjon for å skille individuelle kloner. Ved å opprettholde vevintegritet fanger denne metoden også viktig informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, og den opprinnelige MADM på Rosa2647,53,59 har blitt brukt i MADM klonal analyse studier. Den høye oppløsningen av individuelle celler gir enestående innsikt i både morfologi og klonal forholdet mellom datterceller og tillater levende avbildning av prolifererende stamceller og nye kloner46,52.
Keisersnitt og fostering av valper for analyse av kloner på postnatale tidspunkter er et nødvendig og kritisk skritt i protokollen. Avhengig av helsetilstanden til den TM-behandlede gravide demningen, kan det ikke være nødvendig å utføre en keisersnitt. Det er imidlertid fortsatt nødvendig å oppdra valpene med en fostermor, fordi den TM-behandlede moren kan ha problemer med å ammende. Det er ikke observert forskjeller i behovet for å fostre med forskjellige CreERT2-drivere. Både MADM linjer og fostermødre opprettholdes på en outbred CD-1 bakgrunn. Hvis keisersnitt ikke er nødvendig, kan den TM-behandlede gravide demningen som brukes til å generere eksperimentelle valper gjenbrukes for ytterligere eksperimentelle avl i samsvar med prinsipper i 3R (merk at dette bare kan gjøres hvis dyreeksperielle lisenser godkjenner denne praksisen). Fostermødre kan brukes til å fostre unger innen 2 dager etter at de føder, men høyere suksessrater har blitt observert når fostermødre føder samme dag som de eksperimentelle musene som må fostres. Derfor er det viktig å sette opp tidsdede parringer for fostermødre parallelt med eksperimentelle parring i trinn 1.1. Opprettholde et lignende kull nummer som den opprinnelige fostermors søppel kan forbedre overlevelsesraten av fostrede valper, og derfor fjerning av noen til alle de opprinnelige kull kan være nødvendig. Ytterligere tiltak som kan forbedre fosteringen inkluderer å gni eksperimentererens hansker med søppel og mat (for å fjerne duften av hanskene); gni valpene forsiktig etter keisersnittet med fragmenter av fostermorens skitne søppel og rede; og plassering av valpene i nær kontakt med fostermorens valper før de ble plassert i fostermuseburet.
Som i andre reporterbaserte linjesporingsmetoder, må det tas nøye hensyn når du velger den optimale CreERT2-driveren for MADM kloniske eksperimenter. For det første må arrangøren som brukes uttrykke recombinase både timelig og romlig i stamfarpopulasjonen av interesse. Å finne denne arrangøren kan være utfordrende, fordi noen arrangører kan endre uttrykksmønstre eller bli dempet på ulike utviklingsstadier. For å forbedre celletypespesifisitet flere stedsspesifikke rekombiner, hver drevet av separate arrangører, har blitt brukt. Når en eller begge rekombiner uttrykkes i samme celle, merker dette cellen og avkom med en fluorescerende reporter74,75,76,77. Oppsummert er det viktig å velge en CreERT2-sjåfør som er spesifikk for populasjonen av forfedre som analyseres.
Det mest kritiske trinnet i denne metoden er identifisering av en klone, fordi alle celler må avledes utvetydig fra en enkelt rekombinasjonshendelse (trinn 8.1). Titrering av TM-konsentrasjon sikrer mindre enn én klynge av røde/grønne celler per hjernehalvhalv og maksimerer sannsynligheten for å analysere en enkelt klone (trinn 2.2)7,11. Kloner bør kastes hvis nærliggende klynger av celler forekommer innen 500 μm av klone av interesse. Derfor er det viktig å undersøke flere seksjoner før og etter utseendet på en klone for å sikre at det ikke er noen flere rekombinasjonshendelser i nærheten. På grunn av svakere signal fra fluoroforeene er det nødvendig å utføre immunohistokjemi for eGFP og tdT i embryonale kloner (se avsnitt 6). Dette anbefales kun i voksne kloner hvis flere antigener vil bli colabeled. Når bilde kloner, er det viktig å fange hele bredden av cortex der klone ligger (dvs. fra pial overflate til corpus callosum; se trinn 8.4) for å ikke gå glipp av noen celler. Dette forenkler også bildejustering under bildebehandling (avsnitt 9). Del 8 i protokollen krever et invertert konfusisk mikroskop, men kan tilpasses avhengig av mikroskopoppsettet som er tilgjengelig. Epifluorescensmikroskopi kan brukes, men konfisk mikroskopi anbefales fordi dette fører til en reduksjon i lysforurensning fra utsiden av fokusplanet. Det er også viktig at laserintensiteten og gevinsten justeres slik at grønne, røde og gule celler kan identifiseres utvetydig. Uavhengig av oppsettet anbefales det å bruke et mål om minst 20x for å sikre full romlig separasjon av tett plasserte celler. I tillegg til å registrere den kortikale dybden av alle celler (trinn 8.6), kortikale regioner der klonene er plassert må identifiseres ved hjelp av en hjerneatlas som Allen Brain atlas eller andre stereotaxic koordinat kart. Et navneparadigme bør også vedtas for å sikre at klonebilder er lett identifiserbare. Følgende informasjon kan inkluderes i filnavnet: unik bilde-ID, datobilde ble tatt, genotype av dyr, induksjonsalder, analysealder, bildenummer i forhold til resten av bildene fra samme klone.
Innføring av en mutasjon distal til en MADM kassett gir karakteristisk generering av genetiske mosaikker71 og tillater disseksjon av molekylære regulatorer av avstamning og celletype mangfold på klonal nivå7,11,46,62. For å generere en genetisk mosaikk med MADM, må MADM-kassettene være meioly knyttet til samme kromosom som genet av interesse (se figur 2 for avlsordning). Dette begrenser dagens klonanalyse med MADM til gener som ligger på Chr. 751,Chr. 1146,Chr. 1251og Chr. 6 distal til Rosa26 locus47. Fremtidige studier vil bruke MADM kassetter rettet mot ethvert kromosom, slik at mosaikkanalysen av nesten alle gener av musegenomet på klonalnivå.
Til slutt er MADM ikke begrenset til analysen av stamceller i den utviklende neocortex. Studien av mange stamcellenisjatorer kan dra nytte av evnen til å løse spatiotemporale ordninger av klonalt relaterte celler. Ved å bruke MADM til andre områder av hjernen, sykdomsforhold (f.eks. kreft) eller i andre vev47,,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, studier viste slektsforhold i kloner avledet fra ulike klasser av stamceller og stamceller (se tabell 1 for gjeldende liste over MADM klonale studier). En annen interessant fremtidig anvendelse av MADM er å kombinere den med flere funksjonelle eller subcellulære reportere, noe som vil øke graden av informasjon som kan ervervet fra kloner.

Hjernebarken er en svært organisert struktur bestående av seks forskjellige lag. Cortex inneholder et variert utvalg av celletyper, inkludert nevroner og glia, som samhandler for å danne funksjonelle nevrale kretser. De fleste, om ikke alle, kortikale eksitatoriske projeksjon nevroner og glia er avledet fra et vanlig utvalg av nevrale stamceller (NSCs) kjent som radial glial stamfar (RGPs)1,2,3. RGPs selv er avledet fra nevroepitelstamceller (NESCs) som komponerer det tidlige embryonale nevroepithelium. Ved embryonal dag 9 (E9) hos mus begynner NESCs å gå over til RGPs4. RGP avstamning progresjon krever presis temporal og romlig regulering, og når denne prosessen er hindret, alvorlige nevrologiske lidelser som megalencephaly, microcephaly, lissencephaly, eller funksjonsnedsettelser som schizofreni og autisme kan resultere5,6. På E10 gjennomgår de fleste RGPs symmetriske proliferative divisjoner, noe som resulterer i en utvidelse av nevrale stamcellebasseng4,7. RGPs begynner til slutt å dele asymmetrisk, og produserer kortikale projeksjonsnevroner på en tidsmessig definert måte. Gjennom påfølgende bølger av nevrogenese migrerer nyfødte nevroner inn i den kortikale platen som danner kortikale laminale med tidlige fødte nevroner som opptar dype lag og sene fødte nevroner som bor i de overfladiske lagene8,9,10. Fordi klonalt relaterte pyramidale nevroner migrerer radialt inn i cortex med svært liten tangential dispersjon, datterceller har en tendens til å danne en kolonne eller kjegleformet struktur referert til som en nevronal radial enhet4,11,12,13. Ved E17 er embryonal nevrogen ekspansjon komplett hos mus14. RGPs kan også produsere ependymale celler og noen klasser av glia, inkludert astrocytter og oligodendrocytes1,15,16,17,18,19. Potensialet for RGPs å gi opphav til både nevroner og astrocytter synes å være konsistent på tvers av alle kortikale regioner18,med ca 1/6 av nevrogene RGPs også produsere glia11.
For tiden er de genetiske og epigenetiske faktorene som regulerer temporal progresjon av en stamcelle langs slektslinjen, for det meste ukjent. Temporale mønstre av genuttrykk kan ha betydelig innvirkning på avstamning beslutninger i RGPs20,21,22,23,24. Hvordan dette tett sammensveiset forholdet mellom temporal og romlig mønster fører til molekylært mangfold av voksne nevronale typer på tvers av kortikale områder er ikke kjent. På samme måte er hvordan det enkelte stamcellepotensialet og dens cellulære utgang modulert på celle- og molekylært nivå et viktig ubesvart spørsmål. Fremtidige studier vil forhåpentligvis ta opp noen av disse spørsmålene, og til slutt utvide vår forståelse av funksjonell kortikale kretsdannelse.
Utviklingsnevrobiologi søker å forstå avstamningsforholdet som celler i hjernen deler med hverandre. I utgangspunktet var svært få forskningsverktøy tilgjengelige for dette, og mange tidlige studier var avhengige av visuelle observasjoner av divisjonsmønstre i gjennomsiktige organismer som Caenorhabditis elegans25. De siste tiårene har sett en dramatisk økning i antall og raffinement av teknikker tilgjengelig13,26,27,28,29. Fremveksten av CRISPR-Cas9 genom redigeringssystemet gjør det mulig for syntetisk rekonstruksjon av celle avstamning relasjoner ved å innføre utviklende DNA strekkoder27,,30. To nylige eksempler på barcoding strategier inkluderer bruk av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 til spesifikke DNA strekkode loci eller en cytidin deaminase smeltet sammen med nickase Cas9 å målrette endogene interspersed gjenta regioner31,32. Disse teknologiene gir svært multipleksede tilnærminger gjennom innføring av strekkoder som gradvis og stabilt akkumulerer unike mutasjoner over tid. Genomredigeringsmetoder er svært verdifulle fordi de tillater tilbakevirkende analyse av forholdet mellom to celler basert på den delte arven til disse strekkodene. Men for å lese strekkodene i individuelle celler, må vevet vanligvis forstyrres, og derfor går informasjon om posisjon, morfologi og absolutte celletall fra en individuell stamfar tapt.
Kombinatoriske merking paradigmer bevare romlig informasjon og i prinsippet også tillate skillet mellom nært lokalisert eller overlappende kloner33,34. For at en linjesporingsmetode skal være informativ, må den merke individuelle forfedre og deres stambånd på en sparsom og uutslettelig måte. Spesielt Brainbow35 og Confetti36,37 tilnærminger bruker stokastisk flerfarget Cre rekombininase-baserte journalister som uttrykker en kombinasjon av fluorescerende proteiner fra en enkelt locus. Det omfattende antallet samtidige fargekombinasjoner som kan oppnås in vivo gjør dette til et kraftig verktøy når du sporer kortikale RGP-kloner og astrocytter34. Transposon-baserte systemer som gir stabil genomisk integrasjon av transgenes koding fluorescerende reportere og tillater avstamning sporing av kortikale forfedre har også blitt utviklet33,,38,39,40,41. Transposonbaserte systemer har en ekstra fordel ved at reporteren konstruerer stabilt integrere seg i genomet, og dermed pålitelig etikett linealt relaterte datterceller. For å spore astrocytt linjer spesielt, en rekke metoder er utviklet som involverer elektroporering av piggyBac transposaser inkludert Star Track, som gjør bruk av en kombinasjon av konstruksjoner koding ulike fluorescerende proteiner40,42. En annen tilnærming, MAGIC markører, introduserer Brainbow vektorer som transposable transgenes. Dette har blitt brukt til å spore embryonale nevrale og astrocytt stamfar34,43. Nylig ble mosaikkanalyse ved dobbel rekombininasemeditert kassettutveksling (MADR) funnet å stikke mutantceller som uttrykker transgene elementer fra nøyaktig definerte kromosomale loci44. Disse kraftige in vivo kombinatoriske merking teknikker har gitt mange innsikt i avstamning dynamikken i stamceller. Disse analysene utføres imidlertid på fast vev, noe som gir et øyeblikksbilde av individuelle kloner på et definert utviklingsstadium. For å observere endringer i avstamningdynamikken til enkeltkloner over tid, må kroniske in vivo-bildemetoder som ligner på de som utføres i den voksne dentate gyrus, brukes45.
Mosaikkanalyse med doble markører (MADM) er en kraftig dual color labeling metode som gjør det mulig for in vivo avstamning sporing av individuelle stamceller i mus46,47. To komponenter er nødvendige for at MADM-merkingshendelser skal forekomme: For det første må MADM-kassetter målrettes mot identiske loci på homologkromosomer. Kassetter består av to kimeriske fluorescerende reporter gener, eGFP (grønn, [G]) og tandem dimer Tomato (rød, tdT [T]). GT-kassetten inneholder N-terminus av eGFP og C-terminus av tdT, atskilt med en intron som inneholder et loxP-område. GT TG-kassetten er konstruert omvendt, med N-terminus av tdT og C-terminus av eGFP. For det andre er uttrykket cre rekombinase i samme celle som inneholder de målrettede MADM-kassettene avgjørende. I fravær av Creuttrykker ikke de kimeriske kassettene funksjonelle eGFP eller tdT fordi deres kodesekvenser er forstyrret. LoxP-nettstedene fungerer som mål for Cre-mediert interchromosomal rekombinasjon, noe som resulterer i rekonstituering av begge uttrykkskassettene samtidig. Hvis rekombinasjon oppstår i G2-fasen av cellesyklusen etterfulgt av X-segregering (G2-X), vil de to dattercellene hver uttrykke ett av de to fluorescerende proteinene. Temporal regulering av CreERT2 aktivitet ved hjelp av tamoxifen (TM) gir nøyaktig informasjon om fødselsdato madm kloner og divisjon mønstre av deres avkom (Figur 1A)29,46,47.
MADM kan potensielt systematisk merke individuelle kloner med høy enkeltcelleoppløsning i musehjernen som ligner på tradisjonelle, men uspesifikke og arbeidskrevende metoder som Golgi farging48 eller fargestofffylling49. Fordi bare arrangøren kjører CreERT2 bestemmer celle type spesifisitet av klonal MADM merking, MADM kan i prinsippet brukes for klonal avstamning sporing i alle murine organ og vev47,,50,51,52. Faktisk har studier allerede brukt MADM til å avsløre avstamning relasjoner i kloner avledet fra ulike vev47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM eksperimentelle paradigmer har blitt brukt til å studere avstamning i kortikale projeksjon nevroner, glia, og postnatal stamceller i den utviklende neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har også blitt brukt til å studere celleavledning i den voksne bulke gyrus, thalamus, cerebellar granulaceller, og interneuroner på klonalnivå (se tabell 1 for en komplett liste)47,53,54,56,57,66.
Et unikt trekk ved MADM er evnen til å genetisk knytte mutasjoner distal til en MADM kassett, og dermed skape en genetisk mosaikk (Figur 1B og figur 2). Dette resulterer i vill type datterceller merket med en fluorescerende markør (tdT i figur 1B)og homozygoterte mutant søsken med den andre (eGFP i figur 1B) i et umerket heterozygot miljø. MADM er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Opprinnelig ble MADM-kassetter rettet inn i Rosa26-locus 47,men MADM-analyse av genfunksjonen var begrenset til gener som var distale til locus. For å overvinne (i det minste delvis) denne begrensningen og utvide mulighetene for MADM-baserte genanalyser, ble MADM-kassetter banket inn nær centromeres av Chr. 751,Chr. 1146, og Chr. 1251. Målretting av alle 19 mus autosomer med MADM kassetter pågår og vil tillate nesten alle genet å bli studert i fremtiden, og gir en enestående plattform for studiet av utviklingsmessige avstamning relasjoner i kombinasjon med funksjonell genetisk analyse.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Fra et begrenset utvalg av forfedre danner den pattedyriske hjernebarken svært organiserte funksjonelle nevrale kretser. Imidlertid er de underliggende cellulære og molekylære mekanismene som regulerer avstamningsoverganger av nevrale stamceller (NSCer) og eventuell produksjon av nevroner og glia i det utviklende nevroepithelium fortsatt uklart. Metoder for å spore NSC divisjonsmønstre og kartlegge avstamningen av klonalt relaterte celler har avansert dramatisk. Imidlertid lider mange moderne avstamning sporingsteknikker av mangel på cellulær oppløsning av avkom celle skjebne, noe som er viktig for å tyde stamfar celle divisjon mønstre. Presentert er en protokoll ved hjelp av mosaikkanalyse med doble markører (MADM) for å utføre in vivo klonalanalyse. MADM manipulerer samtidig individuelle stamceller og visualiserer presise divisjonsmønstre og avstamningsprogresjon ved enestående enkeltcelleoppløsning. MADM-baserte interchromosomale rekombinasjonshendelser under G2-X-fasen av mitose, sammen med tidsmessig udugelig CreERT2,gir nøyaktig informasjon om fødselsdatoene til kloner og deres divisjonsmønstre. Dermed gir MADM-avstamning sporing enestående kvalitative og kvantitative optiske avlesninger av spredningsmodusen til stamcellestamitorer på enkeltcellenivå. MADM åpner også for undersøkelse av mekanismene og funksjonelle kravene til kandidatgener i NSC-avstamningprogresjon. Denne metoden er unik ved at komparativ analyse av kontroll og muterte subkloner kan utføres i samme vevsmiljø in vivo. Her er protokollen beskrevet i detalj, og eksperimentelle paradigmer for å ansette MADM for klonal analyse og avstamning sporing i den utviklende hjernebarken er demonstrert. Viktigere, denne protokollen kan tilpasses til å utføre MADM klonal analyse i noen murine stamcelle nisje, så lenge CreERT2 driveren er til stede.

MADM resulterer i rekonstituering av funksjonelle grønne og røde fluorescerende proteiner med to datterceller som hver uttrykker ett av de to fluorescerende proteinene ved G2-X kromosomsegregeringshendelser (figur 1A). Fordi MADM-hendelser resulterer i permanent og tydelig merking av de to etterkommende ledningene, kan kvantifiserbar vurdering av grønne og røde dattercellesmerninger (subkloner) utføres. Variabler inkludert divisjonsmønster (f.eks. symmetrisk versus asymmetrisk) og potensial (f.eks. antall avkom) av den opprinnelige stamfar kan bestemmes.  Kvantifisering av hver fluorescerende merkede underklone er informativ når det med tilbakevirkende kraft avgjør om den opprinnelige stamcellen gjennomgår symmetriske proliferative divisjoner, eller asymmetriske, nevrogene divisjoner på tidspunktet for TM induksjon. Tidligere studier gruppert Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 avledet ekscitatory projeksjon kloner i cortex i to brede klasser7,,11,46. Den første, kalt "symmetriske proliferative kloner", består i gjennomsnitt av et betydelig antall nevroner, med både grønne og røde subkloner som inneholder fire eller flere nevroner hver. Den andre gruppen, "asymmetriske kloner" definerer en klasse av kloner der "minoriteten" subklone inneholder færre enn tre nevroner og "flertall" subklone, fire eller flere11. Disse definisjonene er spesifikke for kortikale RGPs og må kanskje besøkes på nytt for andre hjerneregioner og vev. For begge klasser av kortikale kloner, vil avkom bli fordelt gjennom overfladiske og dype lag.
Ved design av MADM klonalstudier er det en rekke aspekter som må tas i betraktning. Tiden da MADM-hendelser induseres ved administrering av TM er et viktig hensyn (figur 3). For kortikale ekscitatory projeksjon neuron MADM kloner (dvs. ved hjelp av Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, nesten alle RGPs var fortsatt gjennomgår symmetriske divisjoner11. Induksjon ved E10 med TM fanget derfor flere runder med proliferativ RGP-forsterkning og resulterte i kloner med høye nevrontall. Imidlertid var antall RGPs på E10 generelt lite og dermed TM administrasjon generert svært få MADM hendelser (noen ganger mindre enn en per hjerne). Flertallet av RGPs byttet fra symmetriske til asymmetriske nevrogene divisjoner rundt E12. For å målrette strengt asymmetriske nevrogene kloner, var det best å indusere på E12 eller senere (figur 3). Tiden mellom TM induksjon og observere MADM rekombinering hendelser i cortex tendens til å være mindre enn 24 h. IP injeksjoner var den foretrukne metoden for å administrere TM på embryonale stadier for denne metoden fordi det førte til større reproduserbarhet i klonal induksjon. Det er også viktig å holde TM-dosen til et minimum av to grunner. For det første, hvis MADM-rekombinasjonshastigheten øker, er sannsynligheten for å indusere flere, kanskje overlappende kloner høyere. For det andre, hvis for mye TM leveres, kan en økt forekomst av abort, embryo reabsorpsjon og mindre søppelstørrelser observeres. Abort i omtrent halvparten av alle gravide demninger ble observert da TM-injeksjoner ble levert på E10. Denne frekvensen gikk ned fra E11 og utover og avtok til ca. 1/3 av de gravide demningene ble avbrutt. For et sammendrag av TM-doser, induksjonstider og CreERT2-drivere som brukes i tidligere MADM-studier, se tabell 1. Reporter aktivitet i fravær av TM ble observert med noen TM-induserbare CreERT2 drivere69. Ektopisk uttrykk eller MADM rekombinasjon hendelser i fravær av TM ble ikke observert med Emx1-CreERT2 av Nestin-CreERT2 drivere. Dette kan delvis skyldes det faktum at TM-medierte kromosomale transkombinasjoner forekommer ved ca. 1:1,000 til 1:10,000 lavere frekvens enn cis-rekombinasjoner, noe som reduserer sannsynligheten for ektopisk MADM-merking.
En annen faktor å vurdere når du planlegger et MADM klonanalyseeksperiment er varigheten av studien. Varierer tiden mellom TM induksjon og når eksperimentet ble analysert (A) (tidsvindu) viser stamcelledynamikk over tid64. Korte embryonale tidsvinduer (dvs. TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) fanget dynamikken i embryonisk nevrogenese (figur 4). Sammenligning av kloner fra to eller flere tidsvinduer gir kvantitativ innsikt i antall celler som produseres og hvordan nevronfordelingen varierer på ulike stadier av avstamningsprogresjon64. For å fange hele potensialet til individuelle kloner, er det nødvendig å utvide tidsvinduet analysert i postnatal eller voksen tidspunkter7,11,12. Eksempler på neokortikale kloner indusert i embryoet og analysert hos den voksne er vist i figur 5. Det er for det meste kortikal nevrogenese og gliogenese øker med E17. Omtrent 1/6 nevrogene RGP fortsetter også å generere astrocytter og/eller oligodendrocytes11.
Symmetriske kloner oppstår når RGPs gjennomgår en eller flere runder med proliferativ divisjon11. RGP kloner indusert mellom E10-E12 var i gjennomsnitt større i størrelse og ga flere romlige funksjoner i den endelige nevronfordelingen (figur 4A-C). Kloner med nevroner relativt likt fordelt gjennom dype og overfladiske lag tok på seg en "sylinder" form mens kloner med nevroner mer spredt i overfladiske lag enn dypere lag utviklet en "kjegle" form11. For å fullt ut fange den romlige og morfologiske informasjonen til en klone, var det nødvendig å beregne hver klone ved hjelp av sekvensielle bilder. For å måle klonal dispersjon ble maksimal lateral dispersjon (målt i alle dimensjoner) i overfladiske lag (LII−VI) av en klone sammenlignet med neuron dispersjon i dype lag (LV/LIV). Dette forholdet (øvre distribusjonsoverdelt:) ga en kvantifiserbar avlesning av den generelle kloneformen.
Asymmetriske kloner, hvor minoritetsunderklonen var tre eller mindre, ga innsikt i den nevronale produksjonen til en enkelt RGP (Figur 4D-F og figur 5A-F)7,11,12. Majoritetspopulasjonen (stor subklone) kan merkes enten i rødt eller grønt, med et gjennomsnitt på omtrent syv eksituatory projeksjon nevroner per klone når indusert ved hjelp av en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(Figur 5G)7,11,12. Det totale antallet celler i en MADM klone kan bli ytterligere dissekert ved å analysere fordelingen av nevroner i den store subklone over overfladiske og dype lag. Minoritetspopulasjonen (liten underklone) ble merket av den gjensidige fargen og var i gjennomsnitt 1–2 celler per klone (figur 5H). Den totale "enhetsstørrelse", som i gjennomsnitt var 8–9 nevroner, kunne beregnes ved å legge til de små og store underslutene sammen (figur 5I)7,,11,,12. Det er viktig å merke seg at mens den nevronale produksjonen av RGPs var svært forutsigbar, var det en grad av klonal heterogenitet12,70.
Innføring av en mutasjon distal til MADM kassett muliggjør generering av genetiske mosaikker, noe som gir en unik metode for å dissekere molekylære regulatorer av stamcelle avstamning progresjon. Som sådan gir MADM en enestående eksperimentell plattform for å studere den celle-autonome funksjonen til et gen (f.eks. dens tilknytning til mikrocefali eller makrocephaly). Ved å sammenligne kloner indusert i en MADM genetisk mosaikk til kloner indusert i en kontroll MADM, en svært kvantitativ avlesning av endringer i nevron tall og distribusjon kan genereres. Tidligere MADM-baserte studier kvantifiserte den celle-autonome funksjonen til Otx1 i mikrocefalidannelse på klonalnivå (se figur 6A-E for et representativt eksempel)11. I en annen studie viste MADM klonalanalyse at Ndel1 ikke cell-autonomt regulere projeksjon neuron tall, men i stedet evnen til nyfødte nevroner å gå inn eller migrere innenfor kortikale plate, som senere danner den voksne cortex46. Disse studiene viste den svært kvantitative karakteren av MADM klonal analyse i å studere de celle-autonome funksjonene til gener som regulerer kortikale utvikling. Det finnes for tiden ingen eksempler i litteraturen som bruker MADM til å studere gener innblandet i makrocephaly på klonalnivå. Men i fremtidige studier analyse av gener som er relevante for kontroll av kortikale størrelse generelt kan gi svært ønskelig innsikt på molekylært og cellulært nivå.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig1.jpg"> Figur 1: MADM-prinsippet for avstamningssporing og klonanalyse på enkelt stamcellenivå. (A) For å utføre avstamning sporing og klonal analyse med MADM, må to komponenter være til stede. Først må MADM-kassetter målrettes mot identiske loci på homologe kromosomer. Kassetter består av to kimeriske fluorescerende reporter gener, eGFP (grønn, [G]) og tandem dimer Tomato (rød, tdT [T]). GT-kassetten inneholder N-terminus av eGFP og C-terminus av tdT, atskilt med en intron som inneholder et loxP-område. GT TG-kassetten er konstruert omvendt, med N-terminus av tdT og C-terminus av eGFP. For det andre må uttrykket for Cre recombinase forekomme i cellen som inneholder de målrettede MADM-kassettene. LoxP-nettstedene fungerer som et mål for Cre-mediert interchromosomal rekombinasjon, noe som resulterer i rekonstituering av begge uttrykkskassettene samtidig. Hvis rekombinasjon oppstår i G2-fasen av cellesyklusen etterfulgt av X-segregering (G2-X), vil de to dattercellene uttrykke ett av de to fluorescerende proteinene. (B)MADM prinsipp for genetisk mosaikkanalyse på ett enkelt klonenivå. Muterte alleler (punktmutasjoner, slettinger, innsettinger, loxP-flankerte betingede alleler som avbildet i figur 1B,etc.) kan innføres distal til TG-MADM-kassetten via meiotisk rekombinasjon (se figur 2 og Hippenmeyer et al.46 for detaljer om hvordan man introduserer muterte alleler i MADM-systemet). Hvis en G2-X Cre recombinase-mediert interchromosomal trans-rekombinasjon oppstår mellom MADM kassetter det resulterer i en GFP + homozygot mutant celle (GeneX-/-) for genet av interesse og en tdT + homozygot vill type celle (GeneX+/+) i en umerket heterozygous miljø46,47,71. Alternative merkingsresultater som ikke brukes i klonalanalysen (dvs. gule celler) har tidligere blitt beskrevet i detalj11,,46,47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig1large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig2.jpg"> Figur 2: Avlsordninger for generasjon eksperimentelle MADM-mus for avstamning. Avl ordningen for generering av kontroll MADM (A) og Gene X MADM (B) eksperimentelle MADM mus for klonal analyse. For mer informasjon om MADM avl paradigmer se Beattie et al.7 og Hippenmeyer et al.7,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig2large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig3.jpg"> Figur 3: Tidskurs paradigmer for MADM-basert klonal avstamning analyse. Skjematisk av eksperimentelle design tid vinduer. For langsgående prøvetaking paradigmer forble tidspunktet for kloneinduksjon konstant og hvor lang tid før analysen varierte. I progressiv intervallprøvetaking forble tidspunktet for analyse konstant, men induksjonstidspunktet varierte. En kombinasjon av en eller begge tilnærminger kan brukes avhengig av spørsmålene som er adressert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig4.jpg"> Figur 4: MADM klonalanalyse i utvikling og voksen neocortex. TM-mediert MADM klone induksjon i symmetrisk proliferativ (TM på E10) (A-C) og asymmetrisk nevrogen (TM på E12) (D-F) dele RGPs. Avbildet er individuelle MADM kloner in vivo i utviklingen (TM / E10 -A / E16 og TM / E12−A / E16) (B, E) og voksen (TM / E10 -A / P21 og TM / E12 − A / P21) (C, F) i MADM-11GT / TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) og MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuron produksjonen var uavhengig av subklone farge og grønt flertall / minoritet subclones kunne sammenlignes med rødt flertall / minoritets subclones under kontrollforhold7,11. Omtrent 1/6 av voksne kloner inneholdt også astrocytter og/eller oligodendrocytes, indikert av hvite stjerner. Paneler B og F er gjengitt med tillatelse fra Hippenmeyer et al.46 og Rulands og Simons72,henholdsvis. CP = Kortikal plate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig5a.jpg"> Figur 5: MADM klonal analyse for å kvantifisere RGP-mediert neuron utgang. Analyse av ekscitatorisk nevron (enhet) produksjon av individuelle nevrogene RGPs på klonalnivå ved hjelp av MADM7,11. (A)Eksperimentelt paradigme for å indusere for det meste asymmetriske MADM-kloner i den utviklende cortex. (B) Mulige asymmetriske kloneutfall med flertallet subklone merket i enten grønn eller rød (C) Representative påfølgende seksjoner som spenner over en enkelt nevrogen asymmetrisk klone(D,E)3D rekonstruksjon bilder av representative asymmetrisk G2-X MADM kloner med flertallet populasjon i rødt (D) eller grønn (E) i MADM-11GT / TG; Emx1-CreERT2+/- med TM-induksjon ved E12 og analyse ved P21. Legg merke til at både grønne og røde merkede celler er villtype. (F)Skjematisk indikerer de to mulige eksperimentelle MADM kloneutfallene. (G) Kvantifisering av størrelsen på majoritetsbefolkningen som følge av fornyelse av RGPs i MADM-11 kloner. (H)Kvantifisering av størrelsen på minoritetsbefolkningen som følge av fornyelse av RGPs i MADM-11 kloner. (I)Kvantifisering av den enhetlige størrelsen på asymmetriske nevrogene MADM-11 kloner. Hypotetiske verdier kan representere gjennomsnitt ± SEM. Skala bar = 100 μm (D og E). TM = Tamoxifen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig6.jpg"> Figur 6: MADM klonal analyse for å studere gener som fører til mikrocefali og makrocephaly. Hypotetiske MADM klonale analyseresultater når du utfører funksjonell genetisk disseksjon av kandidatgener som fører til mikrocefali eller makrocephaly. For å dissekere de celle-autonome funksjonene til et gen av interesse (Gene X) på neuron utgang, MADM krever mutant alleler som skal innføres distal til MADM kassetter via meiotisk rekombinasjon (for detaljer hvordan å introdusere muterte alleler i MADM-systemet se også Figur 2, Hippenmeyer et al.46, og Laukoter et al.46,73). - Jeghar ikke noe valg. Skjematisk indikerer eksperimentell MADM paradigme for funksjonell analyse av klonale RGP enheter. Den muterte subklonen kan enten danne minoritetspopulasjonen (A) eller flertallet (B) populasjon. - Jeghar ikke noe å gjøre. Hypotetiske MADM klonale analyseresultater når kvantifisere kontroll MADM (hvite barer), Gene-X MADM microcephaly (grå barer) og Gene-X MADM makrocephaly svarte barer) asymmetriske kloner. (C) Kvantifisering av størrelsen på majoritetsbefolkningen. (D) Kvantifisering av minoritetsbefolkningens størrelse. (E) Kvantifisering av den enhetlige størrelsen på asymmetriske nevrogene kloner. Hypotetiske verdier kan representere gjennomsnitt ± SEM. S = Hypotetisk scenario der forskjellen i subklonecellenummer kan nå betydning, i forhold til kontroll. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
Tabell 1: MADM klonalstudier i litteraturen. Sammendrag av studier i litteraturen som inneholder MADM klonale avstamningseksperimenter, inkludert CreERT2 driver brukt, TM dose, og tidspunkt for injeksjon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147_table1.xlsx" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne tabellen (Høyreklikk for å laste ned).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

En protokoll for å utføre avstamning sporing og funksjonell genetisk analyse av kandidat gener på en enkelt celle nivå ved hjelp av mosaikk analyse med doble markører (MADM) presenteres. MADM klonal analyse gir et kvantitativt rammeverk for å måle den proliferative atferd, cellulær utgang, og avstamning forholdet mellom individuelle forfedre og deres datter celler.

Lineage sporing og klonal analyse i å utvikle Hjernebarken ved hjelp av Mosaikk analyse med doble markører (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaic Analysis with Double teknologi er en kraftig metode som kan gi svært kvantitativ informasjon om spredning atferd og kjeller utganger av enkeltpersoner stamceller. Et unikt trekk ved denne teknikken, er at det tillater avstamning sporing og funksjonell genetisk analyse av kandidat gener på Single Cell level.demontrating til prosedyren vil være, Carmen Streicher, din tekniker, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc og Andy Hansen, en ph.d.-student fra laboratoriet mitt. For å indusere MADM-rekombinasjonshendelser i eksperimentelle mus, bruk en 1 ml sprøyte utstyrt med en 25 gauge kanyle for å levere en enkelt injeksjon av Tamoxifen Intraperitoneal til en tidsriktig til gravid dam. Fra MADM klonisk analyse til postnatale tidspunkter. På embryonale dager 18 til 19, plasser en gravid mus i liggende stilling og desinfiser pelsen med 70% etanol. Lag et lite snitt i huden i underlivet over livmoren og gjør et nytt snitt gjennom musklene og magemuskulaturen for å avsløre bukhinnen. Bruk saks for å skille livmoren fra det omkringliggende vevet og legg den intakte livmoren i en hanske med varmt vann. Bruk deretter fin spiss saks og fingre for å forsiktig åpne livmorveggene for å frigjøre embryoene. Rengjør valpene forsiktig trykke på kistene fra tid til annen for å starte pusten før du overfører prenatal dyrene til en fostermor. For å samle nevrale MADM Klone Tissue plassere et bedøvet dyr i liggende posisjon på en perfusjon kirurgi brett og desinfisere pelsen med 70% etanol. Bruk saks og tang for å gjøre ett snitt gjennom huden og ett snitt gjennom muskellaget. Når thoraxhulen er synlig, snus og løft membranen for å avsløre hjertet og forsiktig trimme og pin brystkassen til operasjonsbrettet.sett inn en nål koblet til en peristaltisk pumperør fylt med PBS inn i hjertets nedre venstre ventrikkel og bruk små Iris saks for å gjøre et snitt i den bakre enden av høyre atrium. Perfuse kardiovaskulærsystemet med PBS etterfulgt umiddelbart av perfusjon med nylaget iskald 4% paraformaldehyd i PBS. Når perfusjonen er fullført, fjern hjernen gjennom forsiktig disseksjon og plasser det høstede organet i minst fem ganger hjernevolumet av fersk 4% paraformaldehyd over natten ved 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypeanalyser og Isolering av murine hematopoetiske stamceller og Lineage-engasjerte stamfedre

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Frukt Volatile Analysis Bruke en elektronisk nese

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering og analyse av mRNA molekyler med fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rask og effektiv Sebrafisk Genotyping Bruke PCR med høy oppløsning Melt Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analyse av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Ved hjelp av Sult Pads i kombinasjon med Fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Open-source Single-partikkel Analyse for Super-oppløsning Mikroskopi med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll for genetisk Gut innhold analyser av akvatiske Macroinvertebrates bruke gruppe-spesifikke rDNA primere

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL Kolesterol opptaksanalyse bruke levende celle Imaging analyse med cellen helseovervåking

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...