Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
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Agradecemos a todos os membros do laboratório de Hippenmeyer pela discussão, o Centro de Bioimagem, a Instalação de Ciência da Vida e o Centro Pré-Clínico da IST Austria pelo apoio técnico. Este trabalho foi apoiado por fundos institucionais da IST Austria; R.B. recebeu apoio do programa Lise-Meitner (M 2416) do Fundo Austríaco de Ciência (FWF); N.A recebeu apoio do Fundo Austríaco de Ciência (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); A GC recebeu apoio do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia no âmbito do acordo de subvenção Marie Skłodowska-Curie nº 754411 como pós-doutorado da ISTplus; A.H. recebeu apoio de um ÖAW DOC (Bolsa de Doutorado da Academia Austríaca de Ciências). Este estudo também foi apoiado pelo European Research Council (ERC) no âmbito do programa de pesquisa e inovação Horizon 2020 da União Europeia (acordo de subvenção nº 725780 LinPro) à S.H.

Os autores não têm nada a revelar.

Um método para usar o MADM para rastrear a linhagem celular de RGPs individuais in vivo no neocórtex em desenvolvimento é descrito. Quando combinados com o CreERT2indutível TM, os eventos MADM podem ser precisamente cronometrados, fornecendo uma leitura visual altamente qualitativa e quantitativa dos padrões de divisão de células-tronco no nível de célula única. Ao titular a dose de TM entregue, em uma situação ideal pode-se obter uma média de menos de um clone por hemisfério cortical, proporcionando separação espacial adequada para distinguir inequivocamente clones individuais. Ao manter a integridade tecidual, este método também captura informações essenciais sobre posição, morfologia e números de células absolutas. MADM em Chr. 117,11,12,46,56,57, em Chr. 751, e o MADM original em Rosa2647,53,59 foram utilizados em estudos de análise clonal MADM. A alta resolução de células individuais fornece uma visão sem precedentes sobre a morfologia e a relação clonal das células filhas e permite a imagem viva de células-tronco proliferando e clones emergentes46,,52.
A cesariana e o acolhimento de filhotes para análise de clones em momentos pós-natal é um passo necessário e crítico no protocolo. Dependendo do estado de saúde da barragem gestante tratada com TM, pode não ser necessário realizar uma cesariana. No entanto, criar os filhotes com uma mãe adotiva ainda é necessário, porque a mãe tratada com TM pode ter problemas para lactar. Não foram observadas diferenças na necessidade de adoção com diferentes drivers CreERT2. Ambas as linhas MADM e mães adotivas são mantidas em um fundo de CD-1 de raça. Se a cesariana não for necessária, a represa grávida tratada com TM usada para gerar filhotes experimentais pode ser reutilizada para reproduções experimentais adicionais de acordo com os princípios do 3R (note que isso só pode ser feito se as licenças experimentais de animais aprovarem essa prática). Mães adotivas podem ser usadas para adoção de filhotes dentro de 2 dias após o parto, mas maiores taxas de sucesso têm sido observadas quando mães adotivas dão à luz no mesmo dia que os camundongos experimentais que devem ser adotados. Por isso, é importante configurar acasalamentos cronometrados para mães adotivas paralelamente aos acasalamentos experimentais na etapa 1.1. Manter um número de ninhada semelhante ao da ninhada original da mãe adotiva pode melhorar a taxa de sobrevivência dos filhotes adotivos e, portanto, a remoção de alguns para toda a ninhada original pode ser necessária. Etapas adicionais que podem melhorar o acolhimento incluem esfregar as luvas do experimentador com lixo e alimentos (para remover o cheiro das luvas); esfregando os filhotes suavemente após a cesariana com fragmentos da ninhada e ninho sujo da mãe adotiva; e colocação dos filhotes em contato próximo com os filhotes da mãe adotiva antes de sua colocação na gaiola do rato adotivo.
Como em outros métodos de rastreamento de linhagem baseados em repórteres, deve-se tomar uma consideração cuidadosa ao escolher o driver CreERT2 ideal para experimentos clonais MADM. Em primeiro lugar, o promotor utilizado deve expressar a recombina tanto temporal quanto espacialmente na população progenitora de interesse. Encontrar esse promotor pode ser um desafio, pois alguns promotores podem mudar padrões de expressão ou ficar silenciados em diferentes estágios de desenvolvimento. Para melhorar a especificidade do tipo de célula, várias recombinases específicas do local, cada uma impulsionada por promotores separados, foram usadas. Quando uma ou ambas as recombinases são expressas na mesma célula, isso rotula a célula e sua descendência com um repórter fluorescente74,75,76,77. Em resumo, é importante escolher um driver CreERT2 específico para a população de progenitores que está sendo analisado.
O passo mais crítico neste método é a identificação de um clone, pois todas as células devem ser derivadas inequivocamente de um único evento de recombinação (etapa 8.1). A titulação da concentração de TM garante menos de um aglomerado de células vermelhas/verdes por hemisfério cerebral e maximiza a probabilidade de analisar um único clone (passo 2.2)7,11. Os clones devem ser descartados se os aglomerados vizinhos de células ocorrerem dentro de 500 μm do clone de interesse. Portanto, é importante examinar várias seções antes e depois do aparecimento de um clone para garantir que não haja eventos adicionais de recombinação nas proximidades. Devido ao sinal mais fraco dos fluoroforos, é necessário realizar imunohistoquímica para eGFP e tdT em clones embrionários (ver seção 6). Isso só é recomendado em clones adultos se antígenos adicionais forem colabeled. Ao fotografar clones, é importante capturar toda a largura do córtex onde o clone está localizado (ou seja, da superfície pial ao corpo caloso; ver o passo 8.4) para não perder nenhuma célula. Isso também facilita o alinhamento da imagem durante o processamento da imagem (seção 9). A seção 8 do protocolo requer um microscópio confocal invertido, mas pode ser adaptada dependendo da configuração do microscópio disponível. A microscopia de epifluorescência pode ser usada, mas a microscopia confocal é recomendada porque isso leva a uma diminuição na contaminação da luz de fora do plano focal. Também é importante que a intensidade e o ganho do laser sejam ajustados para que as células verdes, vermelhas e amarelas possam ser identificadas inequivocamente. Independentemente da configuração, recomenda-se usar um objetivo de pelo menos 20x para garantir a separação espacial completa de células posicionadas de perto. Além de registrar a profundidade cortical de todas as células (passo 8.6), regiões corticais onde os clones estão localizados devem ser identificadas usando um atlas cerebral, como o atlas do Cérebro de Allen ou outros mapas de coordenadas estereotipadas. Um paradigma de nomeação de arquivos também deve ser adotado para garantir que as imagens de clone sejam facilmente identificáveis. As seguintes informações podem ser incluídas na nomeação do arquivo: identificação de imagem única, imagem de data foi tirada, genótipo de animal, idade de indução, idade de análise, número de imagem em relação ao resto das imagens do mesmo clone.
A introdução de uma mutação distal a uma fita MADM permite distintamente a geração de mosaicos genéticos71 e permite a dissecção de reguladores moleculares de linhagem e diversidade de tipos celulares no nível clonal7,,11,,46,62. Para gerar um mosaico genético com MADM, as fitas MADM devem estar meioticamente ligadas ao mesmo cromossomo que o gene de interesse (ver Figura 2 para o esquema de reprodução). Isso limita a análise clonal atual com MADM aos genes localizados em Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251, e Chr. 6 distal ao lócus Rosa26 47. Estudos futuros usarão fitas MADM direcionadas a qualquer cromossomo, permitindo a análise do mosaico de praticamente todos os genes do genoma do camundongo no nível clonal.
Finalmente, o MADM não se limita à análise de células progenitoras no neocórtex em desenvolvimento. O estudo de muitos nichos de células-tronco poderia se beneficiar da capacidade de resolver arranjos espáteis de células clonalmente relacionadas. Aplicando MADM a outras regiões do cérebro, condições da doença (por exemplo, câncer), ou em outros tecidos47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59, estudos revelaram relações de linhagem em clones derivados de diversas classes de progenitor e células-tronco (ver Tabela 1 para lista atual de estudos clonais MADM). Outra aplicação futura interessante do MADM é combiná-lo com repórteres funcionais ou subcelulares adicionais, o que aumentaria o grau de informação que pode ser adquirida a partir de clones.

O córtex cerebral é uma estrutura altamente organizada composta de seis camadas distintas. O córtex contém uma variedade diversificada de tipos celulares, incluindo neurônios e glia, que interagem para formar circuitos neurais funcionais. A maioria, se não todos, os neurônios de projeção excitatória cortical e a glia são derivados de um conjunto comum de células-tronco neurais (NSCs) conhecidos como progenitores gliais radiais (RGPs)1,,2,3. Os próprios RGPs são derivados de células-tronco neuroepiteliais (NESCs) que compõem o neuroepithelium embrionário precoce. No dia 9 (E9) em camundongos, os NESCs começam a fazer a transição para RGPs4. A progressão da linhagem RGP requer regulação temporal e espacial precisa, e quando esse processo é dificultado, doenças neurológicas graves como megalencefalia, microcefalia, lissencefalia ou prejuízos como esquizofrenia e autismo podem resultar5,,6. Na E10, a maioria dos RGPs sofre divisões proliferativas simétricas, resultando em uma expansão da piscina progenitora neural4,7. Os RGPs eventualmente começam a se dividir assimetriamente, produzindo neurônios de projeção cortical de forma temporalmente definida. Através de ondas consecutivas de neurogênese, os neurônios recém-nascidos migram para a placa cortical formando laminae cortical com neurônios nascidos precocemente ocupando camadas profundas e neurônios nascidos tardios residentes nas camadas superficiais8,,9,,10. Como os neurônios piramiológicos relacionados clonalmente migram radialmente para o córtex com muito pouca dispersão tangencial, as células filhas tendem a formar uma estrutura em forma de coluna ou cone referida como uma unidade radial neuronal4,,11,,12,13. Por E17, a expansão neurogênica embrionária está completa em camundongos14. Os RGPs também podem produzir células ependímicas e algumas classes de glia, incluindo astrócitos e oligódendrocitos1,,15,,16,,17,,18,19. O potencial dos RGPs para dar origem a neurônios e astrócitos parece ser consistente em todas as regiões corticais18, com aproximadamente 1/6 de RGPs neurogênicos também produzindo glia11.
Atualmente, os fatores genéticos e epigenéticos que regulam a progressão temporal de uma célula-tronco ao longo de sua linhagem são, em sua maioria, desconhecidos. Padrões temporais de expressão genética podem ter impacto substancial nas decisões de linhagem em RGPs20,21,22,23,24. Não se sabe como essa relação firmemente tricotado entre a padronização temporal e espacial leva à diversidade molecular dos tipos neuronais adultos em áreas corticais. Da mesma forma, como o potencial individual das células-tronco e sua saída celular é modulado no nível celular e molecular é uma importante pergunta sem resposta. Estudos futuros abordarão algumas dessas questões, expandindo nossa compreensão da formação de circuitos corticais funcionais.
A neurobiologia do desenvolvimento busca entender a relação de linhagem que as células do cérebro compartilham entre si. Inicialmente, poucas ferramentas de pesquisa estavam disponíveis para isso, e muitos estudos iniciais se baseavam em observações visuais de padrões de divisão em organismos transparentes, como caenorhabditis elegans25. Nas últimas décadas, houve um aumento dramático no número e sofisticação das técnicas disponíveis13,26,27,28,,29. O surgimento do sistema de edição do genoma CRISPR-Cas9 permite a reconstrução sintética das relações de linhagem celular, introduzindo códigos de barras de DNAem evolução 27,30. Dois exemplos recentes de estratégias de codificação de barras incluem o uso de RNA guia de homing que direciona o CRISPR-Cas9 para loci de código de barras de DNA específico ou uma deaminase de cytidine fundida com nickase Cas9 para atingir regiões de repetição endógenas31,,32. Essas tecnologias fornecem abordagens altamente multiplexadas através da introdução de códigos de barras que progressivamente e stably acumulam mutações únicas ao longo do tempo. As abordagens de edição de genomas são altamente valiosas porque permitem a análise retroativa da relação entre as duas células com base na herança compartilhada desses códigos de barras. No entanto, para ler os códigos de barras em células individuais, o tecido geralmente deve ser interrompido, e, portanto, se perde informações sobre posição, morfologia e números de células absolutas de um progenitor individual.
Paradigmas de rotulagem combinatória preservam informações espaciais e, em princípio, também permitem a distinção entre clones intimamente localizados ou mesmo sobrepostos33,34. Para que um método de rastreamento de linhagem seja informativo, deve rotular os progenitores individuais e seus descendentes de forma esparsa e indelével. Notavelmente, as abordagens Brainbow35 e Confetti36,37 usam repórteres baseados em cre estocásticos baseados em cre recombinase que expressam uma combinação de proteínas fluorescentes a partir de um único lócus. O extenso número de combinações simultâneas de cores que podem ser alcançadas in vivo fazem desta uma ferramenta poderosa ao rastrear clones e astrócitos cortical RGP34. Sistemas baseados em transposon que fornecem integração genômica estável de transgenes codificando repórteres fluorescentes e permitindo o rastreamento de linhagem de progenitores corticais também foram desenvolvidos33,38,,39,,40,,41. Os sistemas baseados em Transposon têm uma vantagem adicional na forma de integrar-se ao genoma e, assim, rotular de forma confiável células filhas relacionadas com linha. Para traçar as linhagens de astrócitos especificamente, foram desenvolvidos vários métodos que envolvem a eletroporação de transposases de piggyBac, incluindo o Star Track,que faz uso de uma combinação de construções codificando diferentes proteínas fluorescentes40,42. Outra abordagem, marcadores MAGIC,introduz os vetores brainbow como transgenes transposáveis. Isso foi usado com sucesso para rastrear progenitores neurais e astrócitos embrionários34,43. Recentemente, a análise do mosaico por dupla troca de mediada por recombinase (MADR) foi encontrada para rotular as células mutantes expressando elementos transgênicos do loci cromossômico44. Essas poderosas técnicas de rotulagem combinatória in vivo forneceram inúmeras percepções sobre a dinâmica de linhagem das células progenitoras. No entanto, essas análises são realizadas em tecido fixo, fornecendo um instantâneo de clones individuais em um estágio de desenvolvimento definido. Para observar mudanças na dinâmica de linhagem de clones únicos ao longo do tempo, métodos crônicos de imagem in vivo semelhantes aos realizados no giro dento adulto precisam ser aplicados45.
A análise de mosaico com marcadores duplos (MADM) é um poderoso método de rotulagem de cores duplas que permite o rastreamento de linhagem in vivo de células progenitoras individuais em camundongos46,47. Dois componentes são necessários para que os eventos de rotulagem MADM ocorram: Primeiro, as fitas MADM devem ser direcionadas a loci idênticas em cromossomos homólogos. As consistem em dois genes de repórteres fluorescentes quiméricos, eGFP (verde, [G]) e tandem dimer Tomate (vermelho, tdT[T]). O GT contém o N-terminus de eGFP e o C-terminus de tdT, separado por um intron contendo um site loxP. O TG é construído inversamente, com o N-terminus de tdT e o C-terminus do eGFP. Em segundo lugar, a expressão de Cre recombinase na mesma célula contendo as fitas MADM direcionadas é essencial. Na ausência de Cre,as fitas quimricas não expressam eGFP ou tdT funcionais porque suas sequências de codificação são interrompidas. Os sites loxP servem como alvo para a recombinação intercromossômica mediada por Cre, resultando na reconstituição de ambas as fitas de expressão simultaneamente. Se a recombinação ocorrer durante a fase G2 do ciclo celular seguido pela segregação X (G2-X), as duas células filhas expressarão cada uma das duas proteínas fluorescentes. A regulação temporal da atividade CreERT2 utilizando tamoxifen (TM) fornece informações precisas sobre a data de nascimento dos clones MADM e os padrões de divisão de seus descendentes (Figura 1A)29,,46,47.
O MADM pode rotular potencialmente clones individuais com alta resolução de células individuais no cérebro do camundongo semelhante aos métodos tradicionais, mas não específicos e trabalhosos, como a coloração de Golgi48 ou o enchimento decorantes 49. Como apenas o promotor que conduz o CreERT2 determina a especificidade do tipo celular da rotulagem clonal MADM, o MADM pode, em princípio, ser aplicado para rastreamento de linhagem clonal em qualquer órgão e tecido murino47,,50,,51,,52. De fato, estudos já utilizaram o MADM para revelar relações de linhagem em clones derivados de tecidos diversos47,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59. Paradigmas experimentais MADM têm sido aplicados para estudar a linhagem em neurônios de projeção cortical, glia e células-tronco pós-natal no neocórtex em desenvolvimento7,11,12,46,60,,61,62,63,64,65. O MADM também tem sido usado para estudar a linhagem celular no giro dento adulto, tálamo, células de grânulo cerebelar e interneurons no nível clonal (ver Tabela 1 para uma lista completa)47,53,,54,,56,,57,66.
Uma característica única do MADM é a capacidade de vincular geneticamente mutações distais a um MADM, criando assim um mosaico genético(Figura 1B e Figura 2). Isso resulta em células filhas do tipo selvagem rotuladas com um marcador fluorescente (tdT na Figura 1B) e irmãos mutantes homozigosos com o outro (eGFP na Figura 1B) em um ambiente heterozigoso sem rótulo. MADM é único na que a análise comparativa de subclonas de controle e mutantes pode ser realizada no mesmo ambiente tecidual in vivo. Originalmente, as fitas MADM eram direcionadas para o lócus Rosa26 47,mas a análise MADM da função genética limitava-se aos genes distais ao lócus. Para superar (pelo menos em parte) essa limitação e ampliar as possibilidades de análises genéticas baseadas em MADM, as fitas MADM foram derrubadas perto dos centrosmers de Chr. 751, Chr. 1146e Chr. 1251. Direcionar todos os 19 autossómos do mouse com MADM está em andamento e permitirá que praticamente qualquer gene seja estudado no futuro, fornecendo uma plataforma incomparável para o estudo de relações de linhagem de desenvolvimento em combinação com a análise genética funcional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

A partir de uma piscina limitada de progenitores, o córtex cerebral mamífero forma circuitos neurais funcionais altamente organizados. No entanto, os mecanismos celulares e moleculares subjacentes que regulam as transições de linhagem das células-tronco neurais (NSCs) e a eventual produção de neurônios e glia no neuroepithelium em desenvolvimento permanece incerto. Métodos para rastrear padrões de divisão NSC e mapear a linhagem de células clonalmente relacionadas avançaram dramaticamente. No entanto, muitas técnicas contemporâneas de rastreamento de linhagem sofrem com a falta de resolução celular do destino celular progênero, o que é essencial para decifrar padrões de divisão celular progenitora. Apresentado é um protocolo que utiliza análise de mosaico com marcadores duplos (MADM) para realizar análises clonais in vivo. O MADM manipula concomitantemente células progenitoras individuais e visualiza padrões precisos de divisão e progressão de linhagem em resolução celular única sem precedentes. Eventos de recombinação intercromossômica baseados em MADM durante a fase G2-X da mitose, juntamente com o CreERT2temporalmente indutível, fornecem informações exatas sobre as datas de nascimento dos clones e seus padrões de divisão. Assim, o rastreamento de linhagem MADM fornece leituras ópticas qualitativas e quantitativas sem precedentes do modo de proliferação de progenitores de células-tronco no nível único da célula. O MADM também permite o exame dos mecanismos e requisitos funcionais dos genes candidatos na progressão da linhagem NSC. Este método é único na forma de que a análise comparativa de subclonas de controle e mutantes pode ser realizada no mesmo ambiente tecidual in vivo. Aqui, o protocolo é descrito em detalhes, e paradigmas experimentais para empregar MADM para análise clonal e rastreamento de linhagem no córtex cerebral em desenvolvimento são demonstrados. É importante ressaltar que este protocolo pode ser adaptado para realizar análises clonais MADM em qualquer nicho de células-tronco murinas, desde que o driver CreERT2 esteja presente.

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Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Um protocolo para realizar o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos em um único nível celular usando a análise de mosaico com marcadores duplos (MADM). A análise clonal madm fornece uma estrutura quantitativa para medir o comportamento proliferativo, a saída celular e a relação de linhagem de progenitores individuais e suas células filhas.

Rastreamento de linhagem e análise clonal no desenvolvimento de córtex cerebral usando análise de mosaico com marcadores duplos (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

A Análise mosaico com tecnologia Double Markers é um método poderoso que pode fornecer informações altamente quantitativas sobre o comportamento de proliferação e saídas de porões de células-tronco individuais. Uma característica única desta técnica, é que permite o rastreamento de linhagem e a análise genética funcional dos genes candidatos no nível de Célula Única.demonização para o procedimento será, Carmen Streicher, sua técnica, Nicole Amberge, pós-doc, Gisselle Cheung, pós-doutor e Andy Hansen, um estudante de doutorado do meu laboratório. Para induzir eventos de recombinação MADM em camundongos experimentais, use uma seringa de 1ml equipada com uma agulha de calibre 25 para fornecer uma única injeção de Tamoxifen Intraperitoneal em uma represa cronometrada para grávida. Da análise clonal madm aos pontos de tempo pós-natal. Nos dias embrionários de 18 a 19 dias, coloque um rato grávida na posição supina e desinfete a pele com 70% de etanol. Faça uma pequena incisão na pele no abdômen inferior acima do útero e faça uma segunda incisão através dos músculos e da parede muscular abdominal para revelar o peritônio. Use uma tesoura para separar o útero dos tecidos circundantes e colocar o útero intacto em uma luva com água morna. Em seguida, use uma tesoura de ponta fina e os dedos para abrir cuidadosamente as paredes uterinas para liberar os embriões. Limpe os filhotes pressionando suavemente os baús de tempos em tempos para iniciar a respiração antes de transferir os animais pré-natais para uma mãe adotiva. Para coletar tecido clone madm neural coloque um animal anestesiado na posição supina em uma bandeja de cirurgia de perfusão e desinfete a pele com 70% de etanol. Use tesouras e fórceps para fazer uma incisão através da pele e uma incisão através da camada muscular. Quando a cavidade torácica estiver visível, fareje e levante o diafragma para revelar o coração e corte cuidadosamente e fixe a caixa torácica na bandeja cirúrgica.insira uma agulha conectada a uma tubulação de bomba peristáltica cheia de PBS no ventrículo inferior esquerdo do coração e use uma pequena tesoura Iris para fazer uma incisão na extremidade posterior do átrio direito. Perfuuse o sistema cardiovascular com o PBS seguido imediatamente por perfusão com gelo recém-preparado frio 4%paraformaldeído na PBS. Quando a perfusão estiver completa, remova o cérebro através de dissecção cuidadosa e coloque o órgão colhido em pelo menos cinco vezes o volume cerebral de fresco 4% de desformaldeído durante a noite em 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A Neuronal e astrocitária Ensaio Co-Cultura de Análise de Conteúdo de Alta de neurotoxicidade

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biologia

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Análise de DNA dupla fita-Break Repair (DSB) em células de mamíferos

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Análise de Frutas volátil Usando um Nariz Eletrônico

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualização e análise de moléculas de mRNA Usando Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação em<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rápida e eficiente Zebrafish Genotipagem Usando PCR com alta resolução Análise Melt

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Análise de Autophagy em<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por a inanição Pads em combinação com microscopia de fluorescência

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Protocolo do laboratório para análises genéticas de conteúdo intestino de rDNA usando de macroinvertebrados aquáticos grupo-específicos Primers

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Ensaio de absorção de LDL colesterol usando célula viva análise com célula de imagem monitoramento de integridade

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...