Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Agradecemos a todos los miembros del laboratorio Hippenmeyer por su debate, el Centro de Bioimagen, el Centro de Ciencias de la Vida y el Centro Preclínico de IST Austria por su apoyo técnico. Esta labor fue apoyada por los fondos institucionales de IST Austria; R.B. recibió apoyo del programa Lise-Meitner del Fondo Científico Austriaco (FWF) (M 2416); N.A recibió apoyo del Fondo Austriaco de Ciencia (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en el marco del acuerdo de subvención Marie Sk-odowska-Curie No 754411 como becario postdoctoral de ISTplus; A.H. recibió el apoyo de una DOC (Beca Doctoral de la Academia Austriaca de Ciencias). Este estudio también fue apoyado por el Consejo Europeo de Investigación (ERC) en el marco del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea (acuerdo de subvención no 725780 LinPro) a S.H.

Los autores no tienen nada que revelar.

Se describe un método para utilizar MADM para rastrear el linaje celular de los RGPs individuales in vivo en el neocórtex en desarrollo. Cuando se combinan con CreERT2inducible en TM, los eventos MADM se pueden cronomecer con precisión, proporcionando una lectura visual altamente cualitativa y cuantitativa de patrones de división de células madre a nivel de célula única. Al valorar la dosis de TM suministrada, en una situación ideal se puede obtener un promedio de menos de un clon por hemisferio cortical, proporcionando una separación espacial adecuada para distinguir inequívocamente los clones individuales. Al mantener la integridad del tejido, este método también captura información esencial sobre la posición, la morfología y los números de células absolutos. Los casetes MADM en Chr.11 7,11,12,46,56,57, en Chr. 751, y el MADM original en Rosa2647,53,59 se han utilizado en estudios de análisis clonal MADM. La alta resolución de células individuales proporciona una visión sin precedentes tanto de la morfología como de la relación clonal de las células hijas y permite la imagen en vivo de células madre proliferantes y clones emergentes46,,52.
La cesárea y el fomento de los cachorros para el análisis de clones en los puntos de tiempo postnatales es un paso necesario y crítico en el protocolo. Dependiendo del estado de salud de la presa embarazada tratada con TM, puede que no sea necesario realizar una cesárea. Sin embargo, criar a los cachorros con una madre adoptiva todavía es necesario, porque la madre tratada con TM puede tener problemas para lactación. No se han observado diferencias en la necesidad de fomentar con diferentes conductores de CreERT2. Tanto las líneas MADM como las madres adoptivas se mantienen sobre un fondo de CD-1. Si la cesárea no es necesaria, la presa de embarazo tratada con TM utilizada para generar cachorros experimentales puede ser reutilizada para crías experimentales adicionales de acuerdo con los principios del 3R (tenga en cuenta que esto sólo se puede hacer si las licencias experimentales de animales aprueban esta práctica). Las madres adoptivas se pueden utilizar para criar cachorros dentro de los 2 días después de dar a luz, pero se han observado tasas de éxito más altas cuando las madres adoptivas dan a luz el mismo día que los ratones experimentales que deben ser fomentados. Por lo tanto, es importante establecer apareamientos cronometrados para las madres adoptivas en paralelo a los apareamientos experimentales en el paso 1.1. Mantener un número de camada similar al de la camada original de la madre adoptiva puede mejorar la tasa de supervivencia de los cachorros acogidos, por lo que puede ser necesario eliminar de algunos a toda la camada original. Pasos adicionales que pueden mejorar el fomento incluye frotar los guantes del experimentador con basura y alimentos (para eliminar el aroma de los guantes); frotar a los cachorros suavemente después de la cesárea con fragmentos de la basura sucia de la madre adoptiva y el nido; y la colocación de los cachorros en estrecho contacto con los cachorros de la madre adoptiva antes de su colocación en la jaula de ratón adoptivo.
Al igual que en otros métodos de seguimiento de linaje basados en reporteros, se debe tener en cuenta cuidadosamente al elegir el controlador CreERT2 óptimo para experimentos clonales de MADM. En primer lugar, el promotor utilizado debe expresar la recombinase tanto temporal como espacialmente en la población progenitora de interés. Encontrar a este promotor puede ser un reto, porque algunos promotores pueden cambiar los patrones de expresión o quedar silenciados en diferentes etapas de desarrollo. Para mejorar la especificidad del tipo de celda se han utilizado varias recombinas específicas del sitio, cada una impulsada por promotores independientes. Cuando una o ambas recombinasas se expresan en la misma celda, esto etiqueta la celda y su progenie con un reportero fluorescente74,75,76,77. En resumen, es importante elegir un controlador CreERT2 que sea específico para la población de progenitores que se están analizando.
El paso más crítico de este método es la identificación de un clon, porque todas las celdas deben derivarse inequívocamente de un único evento de recombinación (paso 8.1). La valoración de la concentración de TM garantiza menos de un grupo de células rojas/verdes por hemisferio cerebral y maximiza la probabilidad de analizar un solo clon (paso 2.2)7,,11. Los clones deben descartarse si los clústeres de celdas vecinos se producen dentro de los 500 m del clon de interés. Por lo tanto, es importante examinar varias secciones antes y después de la aparición de un clon para asegurarse de que no hay eventos de recombinación adicionales cerca. Debido a la señal más débil de los fluoróforos, es necesario realizar inmunohistoquímica para eGFP y tdT en clones embrionarios (ver sección 6). Esto sólo se recomienda en clones adultos si se colan antígenos adicionales. Al capturar clones por imágenes, es importante capturar todo el ancho de la corteza donde se encuentra el clon (es decir, desde la superficie pial hasta el cuerpo calloso; consulte el paso 8.4) para no perder ninguna celda. Esto también facilita la alineación de la imagen durante el procesamiento de imágenes (sección 9). La sección 8 del protocolo requiere un microscopio confocal invertido, pero se puede adaptar dependiendo de la configuración del microscopio disponible. Se puede utilizar la microscopía de epifluorescencia, pero se recomienda la microscopía confocal porque esto conduce a una disminución de la contaminación por luz desde fuera del plano de enfoque. También es importante que la intensidad y ganancia del láser se ajusten para que las células verdes, rojas y amarillas puedan ser identificadas inequívocamente. Independientemente de la configuración, se recomienda utilizar un objetivo de al menos 20 veces para garantizar la separación espacial completa de las celdas estrechamente posicionadas. Además de registrar la profundidad cortical de todas las células (paso 8.6), las regiones corticales donde se encuentran los clones deben identificarse utilizando un atlas cerebral como el atlas de Allen Brain u otros mapas de coordenadas estereotaxicas. También se debe adoptar un paradigma de nomenclatura de archivos para asegurarse de que las imágenes clonadas sean fácilmente identificables. La siguiente información podría incluirse en el nombre del archivo: ID de imagen único, fecha de toma de la imagen, genotipo de animal, edad de inducción, edad de análisis, número de imagen en relación con el resto de las imágenes del mismo clon.
La introducción de una mutación distal en un casete MADM permite distintivamente la generación de mosaicos genéticos71 y permite la disección de reguladores moleculares de linaje y diversidad de tipo celular en el nivel clonal7,11,46,62. Para generar un mosaico genético con MADM, los casetes MADM deben estar vinculados meiotically al mismo cromosoma que el gen de interés (ver Figura 2 para el esquema de cría). Esto limita el análisis clonal actual con MADM a los genes ubicados en Chr.7 51, Chr. 1146, Chr. 1251y Chr. 6 distal al locus Rosa26 47. Estudios futuros utilizarán casetes MADM dirigidos a cualquier cromosoma, lo que permite el análisis de mosaico de prácticamente todos los genes del genoma del ratón a nivel clonal.
Por último, MADM no se limita al análisis de células progenitoras en el neocórtex en desarrollo. El estudio de muchos nichos de células madre podría beneficiarse de la capacidad de resolver arreglos espaciotemporales de células relacionadas clonalmente. Al aplicar MADM a otras regiones del cerebro, enfermedades (por ejemplo, cáncer), o en otros tejidos47,50,51,5252,53,54,55,56,57,58,59, estudios revelaron relaciones de linaje en clones derivados de diversas clases de progenitores y células madre (ver Tabla 1 para la lista actual de estudios clonales MADM). Otra aplicación futura interesante de MADM es combinarlo con reporteros funcionales o subcelulares adicionales, lo que aumentaría el grado de información que se puede adquirir de los clones.

La corteza cerebral es una estructura altamente organizada compuesta por seis capas distintas. La corteza contiene una amplia gama de tipos de células, incluyendo neuronas y glia, que interactúan para formar circuitos neuronales funcionales. La mayoría, si no todas, las neuronas de proyección excitatoria cortical y la glia se derivan de una piscina común de células madre neurales (NSC) conocidas como progenitores gliales radiales (BERÁN)1,2,,3. Los CCP se derivan de células madre neuroepiteliales (NEA) que componen el neuropitelio embrionario temprano. Por día embrionario 9 (E9) en ratones, los NESC comienzan a pasar a RGPs4. La progresión del linaje RGP requiere una regulación temporal y espacial precisa, y cuando este proceso se ve obstaculizado, trastornos neurológicos graves como la megalencefalia, la microcefalia, la lissencefalia o alteraciones como la esquizofrenia y el autismo pueden resultarde 5,,6. En E10, la mayoría de los RGPs se someten a divisiones proliferativas simétricas, lo que resulta en una expansión de la piscina de progenitores neuronales4,7. Los PMP eventualmente comienzan a dividirse asimétricamente, produciendo neuronas de proyección cortical de una manera definida temporalmente. A través de ondas consecutivas de neurogénesis, las neuronas recién nacidas migran a la placa cortical formando láminas corticales con neuronas de nacimiento temprano que ocupan capas profundas y neuronas de nacimiento tardío que residen en las capas superficiales8,,9,,10. Debido a que las neuronas piramidales relacionadas clonalmente migran radialmente a la corteza con muy poca dispersión tangencial, las células hijas tienden a formar una columna o estructura en forma de cono conocida como unidad radial neuronal4,11,12,13. Por E17, la expansión neurogénica embrionaria se completa en ratones14. Los SCP también pueden producir células ependimales y algunas clases de glia, incluyendo astrocitos y oligodendrocitos1,15,16,17,18,19. El potencial de los BAN para dar lugar tanto a las neuronas como a los astrocitos parece ser consistente en todas las regiones corticales18,con aproximadamente 1/6 de BAN neurogénicos también produciendo glia11.
Actualmente, los factores genéticos y epigenéticos que regulan la progresión temporal de una célula madre a lo largo de su linaje son en su mayoría desconocidos. Los patrones temporales de expresión génica pueden tener un impacto sustancial en las decisiones de linaje en los RGP20,21,22,23,24. Se desconoce cómo esta relación estrechamente tejida entre el patrón temporal y espacial conduce a la diversidad molecular de los tipos neuronales adultos en áreas corticales. Del mismo modo, cómo el potencial de células madre individuales y su salida celular se modula a nivel celular y molecular es una pregunta importante sin respuesta. Es de esperar que los estudios futuros aborden algunas de estas cuestiones, lo que en última instancia ampliará nuestra comprensión de la formación de circuitos corticales funcionales.
La neurobiología del desarrollo busca entender la relación de linaje que las células del cerebro comparten entre sí. Inicialmente, muy pocas herramientas de investigación estaban disponibles para esto, y muchos estudios tempranos se basaron en observaciones visuales de patrones de división en organismos transparentes como Caenorhabditis elegans25. En las últimas décadas se ha observado un aumento drástico en el número y la sofisticación de las técnicas disponibles13,,26,,27,,28,,29. La aparición del sistema de edición del genoma CRISPR-Cas9 permite la reconstrucción sintética de las relaciones de linaje celular mediante la introducción de códigos de barras de ADNen evolución 27,,30. Dos ejemplos recientes de estrategias de codificación de barras incluyen el uso de ARN guía de localización que dirige CRISPR-Cas9 a loci de código de barras de ADN específico o una deaminasa citidina fusionada con nickase Cas9 para apuntar a las regiones de repetición intercaladas endógenas31,,32. Estas tecnologías proporcionan enfoques altamente multiplexados a través de la introducción de códigos de barras que acumulan progresiva y establemente mutaciones únicas con el tiempo. Los enfoques de edición del genoma son muy valiosos porque permiten un análisis retroactivo de la relación entre dos celdas basadas en la herencia compartida de estos códigos de barras. Sin embargo, para leer los códigos de barras en células individuales, el tejido generalmente debe ser interrumpido, y por lo tanto se pierde información sobre la posición, morfología y números de celda absolutos de un progenitor individual.
Los paradigmas de etiquetado combinatorios preservan la información espacial y, en principio, también permiten la distinción entre clones estrechamente localizados o incluso superpuestos33,,34. Para que un método de trazado de linaje sea informativo, debe etiquetar los progenitores individuales y su progenie de una manera escasa e indeleble. En particular, los enfoques Brainbow35 y Confetti36,37 utilizan reporteros estocásticos multicolores a base de Cre que expresan una combinación de proteínas fluorescentes de un solo locus. El amplio número de combinaciones de colores simultáneas que se pueden lograr in vivo hacen de esta una poderosa herramienta al trazar clones y astrocitos de RGP cortical34. También se han desarrollado sistemas basados en transposon que proporcionan una integración genómica estable de los reporteros fluorescentes de codificación transgenes y permiten el trazado de linajes de progenitores corticales33,,38,,39,,40,,41. Los sistemas basados en Transposon tienen una ventaja adicional en el tiempo que el reportero construye una integración estable en el genoma, y por lo tanto etiqueta de manera confiable las células hijas relacionadas linealmente. Para trazar linajes de astrocitos específicamente, se han desarrollado una serie de métodos que implican electroporación de transposasas piggyBac incluyendo Star Track,que hace uso de una combinación de construcciones que codifican diferentes proteínas fluorescentes40,,42. Otro enfoque, los marcadores MAGIC,introduce los vectores Brainbow como transgenes transponibles. Esto se ha utilizado con éxito para rastrear los progenitores neuronales embrionarios y astrocitos34,43. Recientemente, se encontró que el análisis de mosaico por intercambio dual de casetes mediado por recombinase (MADR) etiquetó de forma estable las células mutantes que expresan elementos transgénicos a partir de loci cromosómico44definido con precisión. Estas potentes técnicas de etiquetado combinatorio in vivo han proporcionado numerosas perspectivas sobre la dinámica del linaje de las células progenitoras. Sin embargo, estos análisis se realizan en tejido fijo, proporcionando una instantánea de clones individuales en una etapa de desarrollo definida. Para observar los cambios en la dinámica de linaje de los clones individuales a lo largo del tiempo, es necesario aplicar45métodos crónicos de diagnóstico por imágenes in vivo similares a los realizados en el giro de dentranato adulto.
El análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM) es un potente método de etiquetado de doble color que permite el trazado de linaje in vivo de células progenitoras individuales en ratones46,,47. Dos componentes son necesarios para que se produzcan eventos de etiquetado MADM: En primer lugar, los casetes MADM deben estar dirigidos a locis idénticos en cromosomas homólogos. Los casetes consisten en dos genes reporteros fluorescentes quiméricos, eGFP (verde, [G]) y dimer tándem Tomate (rojo, tdT[T]). El casete GT contiene el N-terminus de eGFP y el C-terminus de tdT, separados por un intrón que contiene un sitio loxP. El casete TG está construido inversamente, con el N-terminus de tdT y el C-terminus de eGFP. En segundo lugar, la expresión de Cre recombinase en la misma célula que contiene los casetes MADM dirigidos es esencial. En ausencia de Cre, los casetes quiméricos no expresan eGFP funcional o tdT porque sus secuencias de codificación se interrumpen. Los sitios loxP sirven como objetivo para la recombinación intercromosomal mediada por Cre, lo que resulta en la reconstitución de ambos casetes de expresión simultáneamente. Si la recombinación ocurre durante la fase G2 del ciclo celular seguida de la segregación X (G2-X), las dos células hijas expresarán cada una de las dos proteínas fluorescentes. La regulación temporal de la actividad de CreERT2 utilizando tamoxifeno (TM) proporciona información precisa sobre la fecha de nacimiento de los clones MADM y los patrones de división de su progenie (Figura 1A)29,46,47.
MADM puede potencialmente etiquetar sistemáticamente clones individuales con alta resolución de una sola célula en el cerebro del ratón similar a los métodos tradicionales pero inespecíficos y laboriosos como la tinción Golgi48 o el relleno de tinte49. Debido a que sólo el promotor que conduce CreERT2 determina la especificidad del tipo de célula del etiquetado MADM clonal, MADM puede en principio aplicarse para el trazado de linaje clonal a través de cualquier órgano y tejido murino47,,50,,51,,52. De hecho, los estudios ya han utilizado MADM para revelar las relaciones de linaje en clones derivados de diversos tejidos47,,50,,51,,52,,53,,54,,55,,56,,57,,58,,59. Se han aplicado paradigmas experimentales MADM para estudiar el linaje en neuronas de proyección cortical, glia y células madre postnatales en el neocórtex en desarrollo7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM también se ha utilizado para estudiar el linaje celular en el diurna de dentado adulto, tálamo, células de gránulos cerebelosos e interneurones a nivel clonal (ver Tabla 1 para una lista completa)47,53,54,56,57,66.
Una característica única de MADM es la capacidad de vincular genéticamente mutaciones distales a un casete MADM, creando así un mosaico genético (Figura 1B y Figura 2). Esto da como resultado células hijas de tipo salvaje etiquetadas con un marcador fluorescente (tdT en la Figura 1B)y hermanos mutantes homocigotos con el otro (eGFP en la Figura 1B)en un entorno heterocigoto sin etiquetar. MADM es único en ese análisis comparativo de control y subclones mutantes se pueden realizar en el mismo entorno tisular in vivo. Originalmente, los casetes MADM estaban dirigidos al locus47 rosa26, pero el análisis MADM de la función génica se limitó a genes distales al locus. Para superar (al menos parcialmente) esta limitación y ampliar las posibilidades de los análisis genéticos basados en MADM, los casetes MADM se acercaron a los centromeres de Chr.7 51, Chr. 1146y Chr. 1251. La orientación a los 19 autosomas de ratón con casetes MADM está en curso y permitirá estudiar prácticamente cualquier gen en el futuro, proporcionando una plataforma sin igual para el estudio de las relaciones de linaje de desarrollo en combinación con el análisis genético funcional.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

A partir de un conjunto limitado de progenitores, la corteza cerebral de los mamíferos forma circuitos neuronales funcionales altamente organizados. Sin embargo, los mecanismos celulares y moleculares subyacentes que regulan las transiciones de linaje de las células madre neurales (NC) y la producción eventual de neuronas y glia en el neuroepitelio en desarrollo sigue sin estar claro. Los métodos para rastrear patrones de división NSC y mapear el linaje de las células relacionadas clonalmente han avanzado dramáticamente. Sin embargo, muchas técnicas contemporáneas de rastreo de linaje sufren de la falta de resolución celular del destino de las células progenie, que es esencial para descifrar los patrones de división de células progenitoras. Presentado es un protocolo que utiliza el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM) para realizar análisis clonales in vivo. MADM manipula de forma concomitante células progenitoras individuales y visualiza patrones de división precisos y progresión del linaje a una resolución de célula única sin precedentes. Los eventos de recombinación intercromosomal basados en MADM durante la fase G2-X de la mitosis, junto con CreERT2inducible temporalmente, proporcionan información exacta sobre las fechas de nacimiento de los clones y sus patrones de división. Por lo tanto, el rastreo de linaje MADM proporciona lecturas ópticas cualitativas y cuantitativas sin precedentes del modo de proliferación de progenitores de células madre a nivel de célula única. MADM también permite el examen de los mecanismos y requisitos funcionales de los genes candidatos en la progresión del linaje NSC. Este método es único en ese análisis comparativo de control y subclones mutantes se pueden realizar en el mismo entorno tisular in vivo. Aquí, el protocolo se describe en detalle, y se demuestran paradigmas experimentales para emplear MADM para el análisis clonal y el trazado de linaje en el desarrollo de la corteza cerebral. Es importante destacar que este protocolo se puede adaptar para realizar análisis clonales MADM en cualquier nicho de células madre murinas, siempre y cuando el controlador CreERT2 esté presente.

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Se presenta un protocolo para realizar el rastreo de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos a un solo nivel de células utilizando el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM). El análisis clonal de MADM proporciona un marco cuantitativo para medir el comportamiento proliferativo, la producción celular y la relación de linaje de los progenitores individuales y sus células hijas.

Seguimiento de linaje y análisis clonal en el desarrollo de la corteza cerebral mediante el análisis de mosaico con marcadores dobles (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

El análisis de mosaico con tecnología Double Markers es un método potente que puede proporcionar información altamente cuantitativa sobre el comportamiento de proliferación y las salidas de bodega de las células madre de los individuos. Una característica única de esta técnica, es que permite el trazado de linajes y el análisis genético funcional de genes candidatos en el nivel de una sola célula.demontrating to procedure será, Carmen Streicher, su técnico, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc y Andy Hansen, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para inducir eventos de recombinación MADM en ratones experimentales, utilice una jeringa de 1 ml equipada con una aguja de calibre 25 para administrar una sola inyección de tamoxifeno intraperitoneal en una presa de tiempo para embarazada. Desde el análisis clonal de MADM hasta los puntos de tiempo posnatales. En los días embrionarios 18 a 19, coloque un ratón embarazada en posición supina y desinfecte el pelaje con 70% de etanol. Haga una pequeña incisión en la piel en la parte inferior del abdomen por encima del útero y haga una segunda incisión a través de los músculos y la pared muscular abdominal para revelar el peritoneo. Use tijeras para separar el útero de los tejidos circundantes y coloque el útero intacto en un guante con agua tibia. A continuación, utilice tijeras y dedos de punta fina para abrir cuidadosamente las paredes uterinas para liberar los embriones. Limpie los cachorros presionando suavemente los pechos de vez en cuando para iniciar la respiración antes de transferir los animales prenatales a una madre adoptiva. Para recoger el tejido clon neuronal MADM coloque un animal anestesiado en la posición supina en una bandeja de cirugía de perfusión y desinfecte el pelaje con 70%etanol. Usa tijeras y fórceps para hacer una incisión a través de la piel y una incisión a través de la capa muscular. Cuando la cavidad torácica es visible, olfatee y levante el diafragma para revelar el corazón y recorte y fije cuidadosamente la caja torácica a la bandeja quirúrgica.inserte una aguja conectada a un tubo de bomba peristáltica lleno de PBS en el ventrículo izquierdo inferior del corazón y use pequeñas tijeras Iris para hacer una incisión en el extremo posterior de la aurícula derecha. Perca el sistema cardiovascular con el PBS seguido inmediatamente por perfusión con hielo frío recién preparado 4%paraformaldehído en PBS. Cuando la perfusión esté completa, retire el cerebro a través de una disección cuidadosa y coloque el órgano cosechado en al menos cinco veces el volumen cerebral de 4%paraformaldehído fresco durante la noche a las 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

A neuronales y astrocitos Co-cultivo de ensayo para el análisis de alto contenido de neurotoxicidad

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Investigación

Biología

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Frutas volátil análisis mediante una nariz electrónica

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Rápido y Eficiente de pez cebra Genotipado Utilizando PCR con análisis del derretimiento de alta resolución

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Análisis de la autofagia en<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Por la inanición Pads en combinación con microscopía de fluorescencia

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Análisis de una sola partícula de código abierto para el Super-resolución Microscopía con VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

Ensayo de absorción de colesterol LDL utilizando celular directo imágenes análisis con células control de salud

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...