Name: lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)
Uploaded: 2020-05-08T14:30:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Vi tackar alla medlemmar i Hippenmeyer laboratoriet för diskussion, Bioimaging Facility, Life Science Facility, och prekliniska Anläggningen vid IST Österrike för teknisk support. Detta arbete stöddes av IST Austria institutionella fonder; R.B. fick stöd från Austrian Science Fund (FWF) Lise-Meitner-programmet (M 2416); N.A fick stöd från Österrikiska vetenskapsfonden (FWF) Firnberg-Programm (T 1031); GC fick stöd från EU:s forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 inom ramen för bidragsavtalet marie skłodowska-curie som beviljas av ISTplus som postdoktor. A.H. fick stöd från en ÖAW DOC (Doktorandstipendium vid Den österrikiska vetenskapsakademin). Denna studie stöddes också av Europeiska forskningsrådet (ERC) inom ramen för Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 (bidragsavtal nr 725780 LinPro) till S.H.

Författarna har inget att avslöja.

En metod för att använda MADM för att spåra cell härstamning av enskilda RGPs in vivo i utvecklingen neocortex beskrivs. I kombination med TM-inducible CreERT2kan MADM-händelser tidsinställas exakt, vilket ger en mycket kvalitativ och kvantitativ visuell avläsning av stamcellsdelningsmönster på cellnivå. Genom att titrera dosen av levererad TM kan i en idealisk situation erhållas i genomsnitt mindre än en klon per kortikal halvklot, vilket ger tillräcklig rumslig separation för att entydigt skilja enskilda kloner. Genom att upprätthålla vävnadsintegritet fångar denna metod också viktig information om position, morfologi och absoluta cellnummer. MADM kassetter på Chr. 117,11,12,46,56,57, på Chr. 751, och den ursprungliga MADM på Rosa2647,53,59 har använts i MADM klonala analysstudier. Den högupplösta enskilda celler ger oöverträffad inblick i både morfologi och klonala förhållandet mellan dotterceller och tillåter levande bildbehandling av växande stamceller och nya kloner46,52.
Kejsarsnitt och främjande av valpar för analys av kloner vid postnatala tidspunkter är ett nödvändigt och kritiskt steg i protokollet. Beroende på hälsotillståndet för den TM-behandlade gravida dammen, det kanske inte är nödvändigt att utföra ett kejsarsnitt. Hur ... än, höja den pups med en utveckla moder är stilla krevad, emydslig den TM- behandlat moder Maj har oroa ammande. Inga skillnader har observerats i behovet av att främja med olika CreERT2 förare. Både MADM linjer och fostermödrar upprätthålls på en outbred CD-1 bakgrund. Om kejsarsnitt inte är nödvändigt kan den TM-behandlade dräktiga dammen som används för att generera experimentella ungar återanvändas för ytterligare experimentella avel i enlighet med principerna i 3R (observera att detta endast kan göras om djurförsökslicenser godkänner denna praxis). Fostermödrar kan användas för att främja ungar inom 2 dagar efter att de föder, men högre framgång har observerats när fostermödrar föder samma dag som de experimentella möss som måste främjas. Därför är det viktigt att ställa in tidsinställda parningar för fostermödrar parallellt med experimentella parningar i steg 1.1. Upprätthållande en lik skräp antal så den original utveckla moder' skräp kanna förbättra överlevnaden hastigheten av främjat pups, och därför flyttanden något till all om original skräp Maj bli nödvändig. Ytterligare åtgärder som kan förbättra fosterhem inkluderar gnugga experimentörens handskar med skräp och mat (för att ta bort doften av handskarna); gnugga ungarna försiktigt efter kejsarsnittet med fragment av fostermoderns smutsiga kull och bo; och placering av valparna i nära kontakt med fostermoderns valpar innan de placering i fostermusburen.
Liksom i andra reporter-baserade härstamning spårningsmetoder, måste noggrann hänsyn tas när man väljer den optimala CreERT2 föraren för MADM klonala experiment. För det första måste den promotor som används uttrycka rekombinationen både tidsmässigt och rumsligt i föregångaren av intresse. Att hitta denna promotor kan vara en utmaning, eftersom vissa initiativtagare kan ändra uttrycksmönster eller tystas i olika utvecklingsstadier. För att förbättra celltyps specificitet har flera platsspecifika rekombinationer, som var och en drivs av separata promotorer, använts. När en eller båda rekombiner uttrycks i samma cell, detta etiketter cellen och dess avkomma med en fluorescerande reporter74,75,76,77. Sammanfattningsvis är det viktigt att välja en CreERT2-förare som är specifik för populationen av stamfader som analyseras.
Det mest kritiska steget i den här metoden är identifieringen av en klon, eftersom alla celler måste härledas entydigt från en enda rekombinationshändelse (steg 8.1). Titrering av TM-koncentration säkerställer mindre än ett kluster av röda/gröna celler per hjärnhalvklot och maximerar sannolikheten för att analysera en enda klon (steg 2.2)7,11. Kloner bör kasseras om angränsande cellkluster förekommer inom 500 μm från klonen av intresse. Därför är det viktigt att undersöka flera avsnitt före och efter utseendet på en klon för att säkerställa att det inte finns några ytterligare rekombination händelser i närheten. På grund av svagare signal av fluorofores, är det nödvändigt att utföra immunohistochemistry för eGFP och tdT i embryonala kloner (se avsnitt 6). Detta rekommenderas endast i vuxna kloner om ytterligare antigener kommer att kollidera. Vid bildframställning kloner, är det viktigt att fånga hela bredden av cortex där klonen är belägen (dvs. från pial yta till corpus callosum; se steg 8.4) för att inte missa några celler. Detta underlättar också bildjustering under bildbehandling (avsnitt 9). Avsnitt 8 i protokollet kräver ett inverterat konfokalmikroskop men kan anpassas beroende på vilken mikroskopinställning som finns tillgänglig. Epifluorescensmikroskopi kan användas, men konfokalmikroskopi rekommenderas eftersom detta leder till en minskning av ljuskontaminering från utanför fokusplanet. Det är också viktigt att laserintensiteten och förstärkningen justeras så att gröna, röda och gula celler otvetydigt kan identifieras. Oavsett inställning rekommenderas att använda ett mål på minst 20x för att säkerställa fullständig rumslig separation av nära placerade celler. Förutom att registrera det kortikala djupet av alla celler (steg 8.6) måste när regioner där klonerna finns identifieras med hjälp av en hjärnatlas som Allen Brain atlas eller andra stereotaxiska koordinatkartor. En fil namngivning paradigm bör också antas för att se klon bilder är lätta att identifiera. Följande information kan ingå i filnamngivningen: unikt bild-ID, datumbild togs, genotyp av djur, induktionsåldern, analysålder, bildnummer i förhållande till resten av bilderna från samma klon.
Införandet av en mutation distala till en MADM kassett distinkt tillåter generering av genetiska mosaiker71 och tillåter dissekering av molekylära regulatorer av härstamning och cell typ mångfald på klonal nivå7,11,46,62. För att skapa en genetisk mosaik med MADM måste MADM-kassetterna vara meiotiskt kopplade till samma kromosom som den gen av intresse (se figur 2 för avelsprogram). Detta begränsar den aktuella kloniska analysen med MADM till gener som finns på Chr. 751, Chr. 1146, Chr. 1251, och Chr. 6 distala till Rosa26 locus47. Framtida studier kommer att använda MADM kassetter riktade till alla kromosomer, vilket möjliggör mosaik analys av praktiskt taget alla gener av musgenomet på klonal nivå.
Slutligen är MADM inte begränsat till analys av stamcellsceller i den utvecklande neocortexen. Studien av många stamceller nischer skulle kunna dra nytta av förmågan att lösa spatiotemporal arrangemang av clonally relaterade celler. Genom att tillämpa MADM på andra regioner i hjärnan, sjukdomstillstånd (t.ex. cancer) eller i andra vävnader47,,50,,51,,52,,53,54,,55,,56,57,58,59, visade studier härstamningsförhållanden hos kloner som härrör från olika klasser av progenitor och stamceller (se tabell 1 för aktuell lista över MADM-klonala studier). En annan intressant framtida tillämpning av MADM är att kombinera det med ytterligare funktionella eller subcellulära reportrar, vilket skulle öka graden av information som kan förvärvas från kloner.

Hjärnbarken är en mycket organiserad struktur som består av sex distinkta lager. Cortex innehåller ett varierat utbud av celltyper inklusive nervceller och glia, som interagerar för att bilda funktionella neurala kretsar. De flesta, om inte alla, när excitatoriska projektion nervceller och glia härrör från en gemensam pool av neurala stamceller (NSCs) kallas radiella glia (RGPs)1,2,3. RGPs själva härrör från neuroepithelial stamceller (NESCs) komponera tidiga embryonala neuropithelium. Vid embryonal dag 9 (E9) hos möss börjar NESC att övergå till RGPs4. RGP härstamning progression kräver exakt tidsmässiga och rumsliga reglering, och när denna process hindras, allvarliga neurologiska sjukdomar såsom megalencephaly, mikrocefali, lissencephaly, eller nedskrivningar såsom schizofreni och autism kan resultera5,6. Vid E10, de flesta RGPs genomgår symmetriska proliferative divisioner, vilket resulterar i en expansion av neurala stamfaderpoolen4,7. RGPs börjar så småningom att dela asymmetriskt, producerar när projektion nervceller på ett tidsmässigt definierade sätt. Genom på varandra följande vågor av neurogenes, nyfödda nervceller migrera in i när plattan bildar när laminae med tidiga födda nervceller ockuperar djupa lager och sena födda nervceller som bor i de ytliga skikten8,9,10. Eftersom clonally relaterade pyramidala nervceller migrera radiellt i hjärnbarken med mycket lite tangentiell spridning, dotterceller tenderar att bilda en kolumn eller konformad struktur som kallas en neuronal radial enhet4,11,12,13. Genom E17 är embryonal neurogen expansion klar hos möss14. RGPs kan också producera ependymala celler och vissa klasser av glia, inklusive astrocyter och oligodendrocyter1,15,16,17,18,19. Potentialen för RGPs att ge upphov till både nervceller och astrocyter verkar vara konsekvent i alla när regioner18, med cirka 1/6 av neurogena RGPs också producerar glia11.
För närvarande är de genetiska och epigenetiska faktorer som reglerar tidsmässiga progression av en stamceller längs dess härstamning mestadels okända. Tidsmässiga mönster av genuttryck kan ha betydande inverkan på härstamningsbeslut i RGPs20,,21,22,,23,24. Hur detta tätt stickade förhållandet mellan tidsmässiga och rumsliga mönster leder till den molekylära mångfalden av vuxna neuronala typer över när områden är inte känt. På samma sätt är hur den enskilda stamcellspotentialen och dess cellulära utgång moduleras på cell- och molekylär nivå en viktig obesvarad fråga. Framtida studier kommer förhoppningsvis att ta upp några av dessa frågor, i slutändan utöka vår förståelse av funktionella när kretsbildning.
Utvecklingsneurobiologi syftar till att förstå den härstamning relation som celler i hjärnan delar med varandra. Inledningsvis var mycket få forskningsverktyg tillgängliga för detta, och många tidiga studier förlitade sig på visuella observationer av division mönster i transparenta organismer som Caenorhabditis elegans25. De senaste decennierna har sett en dramatisk ökning av antalet och förfining av tekniker tillgängliga13,26,27,28,29. Framväxten av CRISPR-Cas9 genomredigeringssystem möjliggör syntetisk rekonstruktion av cellhärstamning relationer genom att införa utvecklas DNA streckkoder27,30. Två aktuella exempel på barcoding strategier är användningen av homing guide RNA som leder CRISPR-Cas9 till specifika DNA-streckkod lokus eller en cytidin deaminase smält med nickase Cas9 att rikta endogena varvas upprepade regioner31,32. Dessa tekniker ger mycket multiplexerade metoder genom införandet av streckkoder som successivt och stabilt ackumulera unika mutationer över tiden. Genomredigeringsmetoder är mycket värdefulla eftersom de tillåter retroaktiv analys av förhållandet mellan två celler baserat på det delade arvet av dessa streckkoder. Men för att läsa streckkoderna i enskilda celler måste vävnaden vanligtvis störas, och därför går information om position, morfologi och absoluta cellnummer från en enskild stamfader förlorad.
Kombinatoriska märkningsparadigmer bevarar rumslig information och möjliggör i princip också skillnaden mellan nära lokaliserade eller till och med överlappande kloner33,34. För att en härstamningsspårningsmetod skall vara informativ skall den märka enskilda stamfader och deras avkomma på ett glest och outplånligt sätt. Noterbart är att Brainbow35 och Confetti36,37 metoder använder stokastiska multicolor Cre recombinase-baserade reportrar som uttrycker en kombination av fluorescerande proteiner från en enda locus. Det omfattande antalet samtidiga färgkombinationer som kan uppnås in vivo gör detta till ett kraftfullt verktyg när man spårar när RGP-kloner och astrocyter34. Transposon-baserade system som ger stabil genomisk integration av transgener kodning fluorescerande reportrar och tillåter härstamning spårning av när defagenitorer har också utvecklats33,,38,,39,40,41. Transposon-baserade system har en extra fördel i att reportern konstruerar stabilt integrera i genomet, och därmed tillförlitligt etikett lineally relaterade dotterceller. För att spåra astrocyt härstamningar specifikt, ett antal metoder har utvecklats som innebär elektroporation av piggyBac transposaser inklusive Star Track, som använder sig av en kombination av konstruktioner kodning olika fluorescerande proteiner40,42. Ett annat tillvägagångssätt, MAGIC markörer, introducerar Brainbow vektorer som transponerbara transgener. Detta har framgångsrikt använts för att spåra embryonala neurala och astrocytprogenitors34,,43. Nyligen, mosaik analys av dubbla recombinase-medierad kassett utbyte (MADR) befanns stabilt märka mutanta celler uttrycker transgena element från exakt definierade kromosomal loci44. Dessa kraftfulla in vivo kombinatoriska märkning tekniker har gett många insikter i härstamning dynamiken i stamcellsceller. Dessa analyser utförs dock på fast vävnad, vilket ger en ögonblicksbild av enskilda kloner i ett definierat utvecklingsstadium. För att observera förändringar i härstamningsdynamiken hos enstaka kloner över tiden måste kroniska in vivo-avbildningsmetoder som liknar dem som utförs i den vuxna dentatentategiken appliceras45.
Mosaikanalys med dubbla markörer (MADM) är en kraftfull dubbel färgmärkningsmetod som möjliggör in vivo-härstamningsspårning av enskilda stamcellsceller hos möss46,47. Två komponenter är nödvändiga för madm-märkningshändelser: För det första måste MADM-kassetter riktas mot identiska loci på homologa kromosomer. Kassetter består av två chimärlyssiga reportergener, eGFP (grön, [G]) och tandemdimmer Tomat (röd, tdT[T]). GT-kassetten innehåller N-ändstationen för eGFP och C-ändstationen för tdT, åtskilda av en intron som innehåller en loxP-plats. GT TG-kassetten är konstruerad omvänt, med N-ändstationen av tdT och C-ändstationen för eGFP. För det andra är uttrycket av Cre recombinase i samma cell som innehåller riktade MADM kassetter viktigt. I avsaknad av Cre,chimerkassetter inte uttrycka funktionella eGFP eller TDT eftersom deras kodning sekvenser störs. LoxP-platserna fungerar som mål för Cre-medierad interchromosomal rekombination, vilket resulterar i rekonstituering av båda uttryckskassetter samtidigt. Om rekombination inträffar under G2-fasen av cellcykeln följt av X-segregering (G2-X), kommer de två dottercellerna att uttrycka var och en av de två fluorescerande proteinerna. Temporal reglering av CreERT2 verksamhet med tamoxifen (TM) ger exakt information om födelsedatum MADM kloner och division mönster av deras avkomma(Figur 1A)29,46,47.
MADM kan potentiellt systematiskt märka enskilda kloner med hög encellig upplösning i mushjärna som liknar traditionella men ospecificerade och mödosamma metoder som Golgi färgning48 eller färgfyllning49. Eftersom endast promotorn kör CreERT2 bestämmer celltyp specificitet klonala MADM märkning, MADM kan i princip tillämpas för klonala härstamning spårning i alla murine organ och vävnad47,50,51,52. I själva verket har studier redan använt MADM för att avslöja härstamning relationer i kloner som härrör från olika vävnader47,50,,51,52,53,54,55,56,57,58,59. MADM experimentella paradigm har tillämpats för att studera härstamning i när projektion nervceller, glia, och postnatala stamceller i utvecklingen neocortex7,11,12,46,60,61,62,63,64,65. MADM har också använts för att studera cell härstamning i den vuxna dentate gyrus, thalamus, cerebellar granulat celler och interneurons på klonal nivå (se tabell 1 för en komplett lista)47,53,,54,,56,,57,66.
Ett unikt inslag i MADM är förmågan att genetiskt länka mutationer distala till en MADM kassett, vilket skapar en genetisk mosaik (figur 1B och figur 2). Detta resulterar i vilda dotterceller märkta med en fluorescerande markör (tdT i figur 1B) och homozygous mutant syskon med den andra (eGFP i figur 1B) i en omärkt heterozygous miljö. MADM är unikt genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Ursprungligen var MADM kassetter riktade i Rosa26 locus47, men MADM analys av genfunktion var begränsad till gener distala till locus. För att övervinna (åtminstone delvis) denna begränsning och utöka möjligheterna för MADM-baserade genanalyser, MADM kassetter slogs i nära centromeres av Chr. 751, Chr. 1146, och Chr. 1251. Inriktning alla 19 mus autosomes med MADM kassetter pågår och kommer att möjliggöra praktiskt taget alla gener som skall studeras i framtiden, vilket ger en oöverträffad plattform för studier av utvecklingsmässiga härstamning relationer i kombination med funktionell genetisk analys.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL tuberculin syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>9204512N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,4-diazabicyclooctane (DABCO)</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0718.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe (Omnifix Luer Lock)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>8508429N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical centrifuge</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>65.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 multi-well dishes</td>
			<td>Roth/Greiner Bio-one</td>
			<td>CE56.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27- gauge x 3/4 needle (Sterican)</td>
			<td>Braun</td>
			<td>16010256E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corn oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C8267-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips (24 x 60 mm #1)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific (Menzel)</td>
			<td>15747592</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat Cryostar NX70</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>957000H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dako Pen (Wax marker)</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>S200230-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable microtome blade (MX35 Ultra)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>705830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Forceps (Dumont #5)</td>
			<td>Fine Science Tools (FST)</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass anti-roll plate</td>
			<td>Histocom</td>
			<td>M 449980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LSM 800 Confocal</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>25 mg/mL DAPCO, 6 g Glycerol, 2.4 g Mowiol 4-88, 6 mL dH2O, 12 mL 0.2 M Tris-HCl (pH 8.5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mowiol 4-88</td>
			<td>Roth</td>
			<td>0713.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal donkey serum</td>
			<td>Innovative Research</td>
			<td>IGDNSER100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>441244-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump 323E/D 400RPM</td>
			<td>Watson-Marlow</td>
			<td>036.3124.00A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8501-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost plus glass slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxifen</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T5648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Embedding mold T-12 (22mm square)</td>
			<td>Polysciences Inc.</td>
			<td>18986-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software and Plugins:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji</td>
			<td>1.52p</td>
			<td><a href="http://fiji.sc/" target="_blank">Fiji</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MultiStackReg</td>
			<td>1.45</td>
			<td><a href="http://bradbusse.net/sciencedownloads.html" target="_blank">Download link</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TurboReg</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/" target="_blank">EPFL Bioimaging</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Blue</td>
			<td>2.6</td>
			<td><a href="http://www.zeiss.com/microscopy/en_us/products/microscope-software/zen.html#introduction" target="_blank">Zeiss</a></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Experimental Models: Organisms/Strains:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: Emx1-CreER</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:027784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-GT</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013749</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse: MADM-11-TG</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>JAX:013751</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken anti-GFP 1:500</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>GFP-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-tdTomato 1:500</td>
			<td>Sicgen Antibodies</td>
			<td>AB8181-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-RFP 1:500</td>
			<td>MBL</td>
			<td>PM005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Chicken Alexa Fluor 488 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>715-475-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Goat Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>705-165-147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit Cy3 1:500</td>
			<td>Jackson Immuno Research</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lineage tracing and clonal analysis in developing cerebral cortex using mosaic analysis with double markers (madm)

Från en begränsad pool av förfäder bildar däggdjursnahbarken mycket organiserade funktionella neurala kretsar. De underliggande cellulära och molekylära mekanismerna som reglerar härstamningsövergångar av neurala stamceller (NSCs) och eventuell produktion av nervceller och glia i det utvecklande neuropithelium är dock fortfarande oklart. Metoder för att spåra NSC-indelningsmönster och kartlägga härstamningen av klonalt relaterade celler har utvecklats dramatiskt. Men många samtida härstamning spårningsteknik lider av bristen på cellulär upplösning av avkomma cell öde, vilket är viktigt för att dechiffrera defader celldelning mönster. Presenteras är ett protokoll som använder mosaik analys med dubbla markörer (MADM) för att utföra in vivo klonal analys. MADM manipulerar samtidigt enskilda stamcellsceller och visualiserar exakta indelningsmönster och härstamningsprogression vid oöverträffad single cell-upplösning. MADM-baserade interchromosomal rekombination händelser under G2-X fasen av mitos, tillsammans med tidsmässigt inducible CreERT2, ge exakt information om födelsedatum kloner och deras division mönster. Madm-härstamningsspårning ger således oöverträffade kvalitativa och kvantitativa avläsningar av spridningssättet för stamceller på encellig nivå. MADM möjliggör också undersökning av mekanismerna och funktionskraven hos kandidatgener i NSC-härstamningsprogression. Denna metod är unik genom att jämförande analys av kontroll och mutanta subkloner kan utföras i samma vävnadsmiljö in vivo. Här beskrivs protokollet i detalj, och experimentella paradigm att använda MADM för klonal analys och härstamning spårning i den växande hjärnbarken demonstreras. Viktigt, detta protokoll kan anpassas för att utföra MADM klonal analys i någon murine stamceller nisch, så länge CreERT2 föraren är närvarande.

MADM resulterar i rekonstituering av funktionella gröna och röda fluorescerande proteiner med två dotterceller som var och en uttrycker ett av de två fluorescerande proteinerna vid G2 X-kromosomsegregationshändelser (figur 1A). Eftersom MADM-händelser resulterar i permanent och distinkt märkning av de två ättlingslinjen kan kvantifierbar bedömning av gröna och röda dottercellsinstamningar (subkloner) utföras. Variabler inklusive delningsmönster (t.ex. symmetrisk kontra asymmetrisk) och potential (t.ex. antalet avkomman) hos den ursprungliga stamfadern kan bestämmas.  Kvantifiering av varje fluorescerande märkt subklon är informativ när retroaktivt avgöra om den ursprungliga stamcellen genomgår symmetriska proliferative divisioner, eller asymmetriska, neurogena divisioner vid tidpunkten för TM induktion. Tidigare studier grupperade Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2 härledde excitatoriska projektionkloner i cortex i två breda klasser7,11,46. Den första, kallas "symmetriska proliferative kloner", består i genomsnitt av ett stort antal nervceller, med både gröna och röda subkloner som innehåller fyra eller fler nervceller vardera. Den andra gruppen, "asymmetriska kloner" definierar en klass av kloner där "minoritet" subclone innehåller färre än tre nervceller och "majoritet" subclone, fyra eller fler11. Dessa definitioner är specifika för när RGPs och kan behöva ses över för andra regioner och vävnader i hjärnan. För båda klasserna av närkloner kommer avkomman att fördelas över de ytliga och djupa skikten.
Vid utformningen av MADM klonala studier finns det ett antal aspekter som måste beaktas. Den tid då MADM-händelser induceras genom administrering av TM är en viktig faktor (figur 3). För kortikala excitatoriska projektion neuron MADM kloner (dvs. med Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2) på E10, nästan alla RGPs fortfarande genomgår symmetriska divisioner11. Därför induktion på E10 med TM fångade flera rundor av proliferative RGP förstärkning och resulterade i kloner med höga neuron nummer. Emellertid, antalet RGPs på E10 var i allmänhet små och därmed TM administration genererade mycket få MADM händelser (ibland mindre än en per hjärna). Majoriteten av RGPs bytte från symmetriska till asymmetriska neurogena divisioner på runt E12. För att rikta strikt asymmetriska neurogena kloner var det bäst att inducera vid E12 eller senare (figur 3). Tiden mellan TM induktion och observera MADM rekombination händelser i cortex tenderade att vara mindre än 24 h. IP injektioner var den föredragna metoden för att administrera TM på embryonala stadier för denna metod eftersom det ledde till större reproducerbarhet i klonala induktion. Det är också viktigt att hålla TM dosen till ett minimum av två skäl. För det första, om MADM rekombinationshastigheten ökar, är sannolikheten för att inducera flera, kanske överlappande, kloner högre. För det andra, om för mycket TM levereras, kan en ökad abortfrekvens, embryoreabsorption och mindre skräpstorlekar observeras. Aborter i ungefär hälften av alla dräktiga dammar observerades när TM injektioner levererades vid E10. Denna frekvens minskade från E11 och framåt och minskade till cirka 1/3 av gravida dammar avbryta. För en sammanfattning av TM doser, induktionstider, och CreERT2 drivrutiner som används i tidigare MADM studier, se tabell 1. Reporter aktivitet i avsaknad av TM observerades med några TM-inducible CreERT2 drivrutiner69. Ectopic uttryck eller MADM rekombination händelser i avsaknad av TM observerades inte med Emx1-CreERT2 av Nestin-CreERT2 drivrutiner. Detta kan delvis bero på det faktum att TM-medierad kromosomal trans-rekombinationer inträffar vid cirka 1:1,000 till 1:10,000 lägre frekvens än cis-recombinations, vilket minskar sannolikheten för utomkvedshavandeskap MADM märkning.
En annan faktor att tänka på när man planerar en MADM klonala analys experiment är varaktigheten av studien. Varierande tidslängd mellan TM induktion och när experimentet analyserades (A) (tidsfönster) visar stamcellsdynamik över tid64. Korta embryonala tidsfönster (dvs. TM/E11−A/E13; TM/E11−A/E16) fångade dynamiken i embryonal neurogenes (figur 4). Om du jämför kloner från två eller fler tidsfönster får du kvantitativ inblick i antalet celler som produceras och hur neuronfördelningen varierar i olika stadier av härstamningsprogression64. För att fånga hela potentialen för enskilda kloner, är det nödvändigt att förlänga tidsfönstret analyseras till postnatala eller vuxna tidpunkter7,11,12. Exempel på neokortikala kloner som inducerats i embryot och analyseras hos den vuxna visas i figur 5. Observera, när neurogenes är mestadels klar och gliogenes ökar med E17. Cirka 1/6 neurogen RGP fortsätter också att generera astrocyter och/eller oligodendrocyter11.
Symmetriska kloner uppstår när RGPs genomgår en eller flera rundor av proliferative division11. RGP kloner inducerade mellan E10−E12 var i genomsnitt större i storlek och gav mer rumsliga funktioner i den slutliga neuron distribution (figur 4A-C). Kloner med nervceller relativt jämnt fördelade över djupa och ytliga lager tog på en "cylinder" form medan kloner med nervceller mer spridda i ytliga lager än djupare lager utvecklat en "kon" form11. För att helt fånga den rumsliga och morfologiska informationen om en klon var det nödvändigt att beräkningsmässigt rekonstruera varje klon med hjälp av sekventiella bilder. För att mäta klonisk dispersion jämfördes den maximala laterala spridningen (mätt i alla dimensioner) i ytliga lager (LII−VI) av en klon med neuronspridning i djupa lager (LV/LIV). Detta förhållande (fördelning övre:distribution lägre) gav en kvantifierbar avläsning av den övergripande klonformen.
Asymmetriska kloner, där minoritetsubklonen var tre eller mindre, gav insikt i neuronala produktionen av en enda RGP (figur 4D-F och figur 5A-F)7,11,12. Majoriteten (stora subclone) kan märkas antingen i rött eller grönt, med ett genomsnitt på cirka sju excitatoriska projektion nervceller per klon när de induceras med hjälp av en Emx1-CreERT2 eller Nestin-CreERT2(Figur 5G)7,11,12. Det totala antalet celler i en MADM klon kan ytterligare dissekeras genom att analysera fördelningen av nervceller i den stora subklon över ytliga och djupa lager. Minoritetspopulationen (liten subklon) var märkt med den ömsesidiga färgen och var i genomsnitt 1−2 celler per klon (figur 5H). Den totala "enhetsstorleken", som var i genomsnitt 8−9 nervceller, kunde beräknas genom att lägga till små och stora subkloner tillsammans (figur 5I)7,,11,12. Det är viktigt att notera att medan neuronala produktionen av RGPs var mycket förutsägbar, det fanns en grad av klonisk heterogenitet12,70.
Införandet av en mutation distala till MADM kassetten möjliggör generering av genetiska mosaiker, vilket ger en unik metod för att dissekera de molekylära regulatorerna av stamcells härstamning progression. Som sådan ger MADM en oöverträffad experimentell plattform för att studera en gens cellautonoma funktion (t.ex. dess koppling till mikrocefali eller makrocefali). Genom att jämföra kloner induceras i en MADM genetisk mosaik till kloner inducerad i en kontroll MADM, en mycket kvantitativ avläsning av förändringar i neuron nummer och distribution kan genereras. Tidigare MADM-baserade studier kvantifierade den cellautonoma funktionen av Otx1 vid mikrocefalibildning på klonnalnivå (se figur 6A-E för ett representativt exempel)11. I en annan studie, MADM klonal analys visat att Ndel1 inte cell-autonomt reglera projektion neuron nummer, utan i stället förmågan hos nyfödda nervceller att komma in eller migrera inom den när plattan, som senare bildar den vuxna cortex46. Dessa studier visade den mycket kvantitativa karaktären av MADM klonal analys i att studera cell-autonoma funktioner gener som reglerar kortikal utveckling. Det finns för närvarande inga exempel i litteraturen med MADM att studera gener inblandade i makrocefali på klonal nivå. Men i framtida studier analys av gener som är relevanta för kontroll av kortikal storlek i allmänhet kan ge mycket önskvärda insikter på molekylär och cellulär nivå.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig1.jpg"> Figur 1: MADM-principen för härstamningsspårning och klonal analys på enstamcellsnivå. (A)För att utföra härstamningsspårning och klonal analys med MADM skall det finnas två komponenter. Först måste MADM kassetter riktas till identiska lokus på homologa kromosomer. Kassetter består av två chimärlyssiga reportergener, eGFP (grön, [G]) och tandemdimmer Tomat (röd, tdT[T]). GT-kassetten innehåller N-ändstationen för eGFP och C-ändstationen för tdT, åtskilda av en intron som innehåller en loxP-plats. GT TG-kassetten är konstruerad omvänt, med N-ändstationen av tdT och C-ändstationen för eGFP. För det andra måste uttrycket av Cre recombinase förekomma i cellen som innehåller riktade MADM kassetter. Den loxP platser fungera som ett mål för Cre-medierad interchromosomal rekombination, vilket resulterar i rekonstituering av båda uttryck kassetter samtidigt. Om rekombination inträffar under G2-fasen av cellcykeln följt av X-segregering (G2-X), kommer de två dottercellerna att uttrycka ett av de två fluorescerande proteinerna. b)MADM-principen för genetisk mosaikanalys på en enda klonnivå. Mutanta alleler (punktmutationer, borttagningar, infogningar, loxP-flankerade villkorliga alleler som avbildas i figur 1B, etc.) kan introduceras distala till TG-MADM-kassetten via meiotisk rekombination (se figur 2 och Hippenmeyer et al.46 för detaljer om hur man inför mutanta alleler i MADM-systemet). Om en G2-X Cre recombinase-medierad interchromosomal trans-rekombination inträffar mellan MADM kassetter det resulterar i en GFP + homozygous mutant cell (GeneX-/- )för genen av intresse och en tdT + homozygous vilda typ cell (GeneX+/+) i en omärkt heterozygous miljö46,47,71. Alternativa märkningsresultat som inte används i klonalanalysen (dvs. gula blodkroppar) har tidigare beskrivits i detalj11,,46,47. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig1large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig2.jpg"> Figur 2: Avelssystem för generering av experimentella MADM-möss för härstamningsspårning. Avelssystem för generering av kontroll MADM(A) och Gene X MADM (B)experimentella MADM möss för klonal analys. För mer information om MADM avel paradigm se Beattie et al.7 och Hippenmeyer et al.7,46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig3.jpg"> Figur 3: Tidsloppsparadigm för MADM-baserad klonal härstamningsanalys. Schematisk av den experimentella designtidsfönster. För longitudinella samplingsparadigmet förblev tidspunkten för kloninduktion konstant och tiden innan analysen varierade. Vid progressiv intervallprovtagning förblev tidspunkten för analys konstant, men induktionstiden varierade. En kombination av en eller båda metoderna kan användas beroende på vilka frågor som tas upp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig4.jpg"> Figur 4: MADM klonal analys i utveckling och vuxen neocortex. TM-medierad MADM klon induktion i symmetriskt proliferative (TM vid E10) (A-C) och asymmetriskt neurogena (TM vid E12) (D-F)dela RGPs. Avbildade är individuella MADM-kloner in vivo i utvecklingen (TM/E10−A/E16 och TM/E12−A/E16) (B,E) och vuxna (TM/E10−A/P21 och TM/E12−A/P21) (C,F) i MADM-11GT/TG; Nestin-CreERT2+/- (B,E) och MADM-11GT/TG; Emx1-CreERT2+/- (C,F). Neuron produktionen var oberoende av subclone färg och grön majoritet / minoritet subkloner kan jämföras med röd majoritet / minoritet subkloner under kontroll villkor7,11. Ungefärligt 1/6 av vuxen- kloner innehöll också astrocyter och/eller oligodendrocyter som indikeras av vita asterisker. Panelerna B och F reproduceras med tillstånd från Hippenmeyer et al.46 och Rulands och Simons72, respektive. CP = Kortikal platta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig5a.jpg"> Figur 5: MADM klonal analys för att kvantifiera RGP-medierad neuron utgång. Analys av excitatorisk neuron (enhet) produktion av enskilda neurogena RGPs på klonal nivå med MADM7,11. (A)Experimentellt paradigm för att inducera mestadels asymmetriska MADM kloner i utvecklingsbarken. b)Möjliga asymmetriska klonresultat med de flesta subklon märkta i antingen grönt eller rött(C)Representativa på varandra följande sektioner som spänner över en enda neurogen asymmetrisk klon(D,E)3D-rekonstruktionsbilder av representativa asymmetriska G2-X MADM-kloner med majoritetspopulation i rött(D)eller grönt(E)i MADM-11GT/TG. Emx1-CreERT2+/- med TM induktion på E12 och analys vid P21. Observera att både gröna och röda celler är vilda typer. (F)Schematisk som anger de två möjliga experimentella MADM klon resultat. G)Kvantifiering av storleken på den majoritetspopulation som härrör från förnyelse av rgps i MADM-11 kloner. H)Kvantifiering av minoritetspopulationens storlek till följd av förnyande av regionala kostnader för MADM-11-kloner. I)Kvantifiering av den enhetliga storleken på asymmetriska neurogena MADM-11 kloner. Hypotetiska värden kan representera medelvärdet ± SEM. Skalstång = 100 μm (D och E). TM = Tamoxifen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig5large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61147/61147fig6.jpg"> Figur 6: MADM klonal analys för att studera gener som leder till mikrocefali och makrocefali. Hypotetiska MADM klonala analysresultat när de utför funktionella genetiska dissekering av kandidat gener som leder till mikrocefali eller makrocefali. För att dissekera de cellautonoma funktionerna hos en gen av intresse (Gene X) på neuron utgång, kräver MADM mutanta alleler som skall införas distala till MADM kassetter via meiotic rekombination (för detaljer hur man inför mutanta alleler i MADM-systemet se även figur 2, Hippenmeyer et al.46, och Laukoter et al.46,73). (A,B) Schematisk indikerar experimentella MADM paradigm för funktionell analys av klonala RGP-enheter. Den muterade subklonen kan antingen bilda minoriteten (A) eller majoritet (B) populationen. (C-E) Hypotetiska MADM klonala analysresultat vid kvantifiering kontroll MADM (vita barer), Gene-X MADM mikrocefali (grå barer) och Gene-X MADM makrocefali svarta barer) asymmetriska kloner. CCKvantifiering av storleken på majoritetspopulationen. D)Kvantifiering av minoritetsbefolkningens storlek. E)Kvantifiering av den enhetliga storleken på asymmetriska neurogena kloner. Hypotetiska värden kan representera medelvärdet ± SEM. S = Hypotetiskt scenario där skillnaden i subklocellnummer kan komma i betydelse i förhållande till kontrollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147fig6large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Tabell 1: MADM klonala studier i litteraturen. Sammanfattning av studier i litteraturen som innehåller MADM klonala härstamningsexperiment, inklusive CreERT2-förare som används, TM-dos och injektionstid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61147/61147_table1.xlsx" target="_blank">Klicka här för att se den här tabellen (Högerklicka för att ladda ner).</a>

Watch this Scientific Journal Video about Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM at JoVE.com

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers MADM

Ett protokoll för att utföra härstamning spårning och funktionell genetisk analys av kandidat gener på en enda cell nivå med mosaik analys med dubbla markörer (MADM) presenteras. MADM klonal analys ger en kvantitativ ram för att mäta proliferative beteende, cellulära produktion, och härstamning förhållandet mellan enskilda förfäder och deras dotter celler.

Härstamning spårning och klonal analys i utvecklingen av hjärnbarken med mosaik analys med dubbla markörer (MADM)

Beginning from a limited pool of progenitors, the mammalian cerebral cortex forms highly organized functional neural circuits. However, the underlying ...

Mosaic Analysis with Double Markers-tekniken är en kraftfull metod som kan ge mycket kvantitativ information om spridningsbeteende och källarutgångarna hos individer stamceller. Ett unikt inslag i denna teknik, är att det tillåter härstamning spårning och funktionell genetisk analys av kandidat gener på Single Cell level.demontrating till förfarandet kommer att vara, Carmen Streicher, din tekniker, Nicole Amberge, post-doc, Gisselle Cheung, post-doc och Andy Hansen, en doktorand från mitt laboratorium. För att inducera MADM-rekombinationshändelser i experimentella Möss, använd en 1 ml-spruta utrustad med en 25 gauge nål för att leverera en enda injektion av Tamoxifen Intraperitoneal till en tidsinställd till gravid damm. Från MADM klonal analys till postnatala tidspunkter. På embryonala dagar 18 till 19, placera en gravid mus i ryggläge och desinficera pälsen med 70%etanol. Gör ett litet snitt i huden i nedre delen av buken ovanför livmodern och gör ett andra snitt genom musklerna och den bukmuskulära muskelväggen för att avslöja bukhinnan. Använd sax för att separera livmodern från de omgivande vävnaderna och placera den intakta livmodern i en handske med varmt vatten. Använd sedan fina spets sax och fingrar för att noggrant öppna livmoderns väggar för att släppa embryon. Rengör ungarna försiktigt trycka på kistor från tid till annan att inleda andning innan överföring av prenatala djur till en fostermor. För att samla neurala MADM Klon Vävnad placera ett sövt djur i ryggläge på en perfusion kirurgi bricka och desinficera pälsen med 70%etanol. Använd sax och tupp för att göra ett snitt genom huden och ett snitt genom muskellagret. När brösthålan är synlig, sniffa och lyft membranet att avslöja hjärtat och försiktigt trimma och stift bröstkorgen till kirurgiska tray.insert en nål ansluten till en peristaltic pump slangar fylld med PBS i den nedre vänstra ventrikel i hjärtat och använda små Iris sax för att göra ett snitt i den bakre änden av den högra atrium. Genomsyra det kardiovaskulära systemet med PBS följt omedelbart av perfusion med nyberedda iskall 4%paraformaldehyd i PBS. När perfusionen är klar, ta bort hjärnan genom noggrann dissekering och placera det skördade organet i minst fem gånger hjärnvolymen av färsk 4%paraformaldehyd över natten vid 4

Research

JoVE Journal

Biology

Lineage Tracing and Clonal Analysis in Developing Cerebral Cortex Using Mosaic Analysis with Double Markers (MADM)

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

En Neuronal och astrocyternas Co-Kultur-analys för High innehållsanalys av Neurotoxicitet

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

Analys av DNA dubbel-strängen Break (DSB) Reparation i däggdjursceller

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypisk analys och isoleringen av murina hematopoietiska stamceller och Linjen-bundna stamfäder

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Fruit Volatile Analysis Using an Electronic Nose

Frukt Flyktiga Analys Använda en elektronisk näsa

Numerous and diverse physiological changes occur during fruit ripening, including the development of a specific volatile blend that characterizes fruit ...

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualization and Analysis of mRNA Molecules Using Fluorescence In Situ Hybridization in Saccharomyces cerevisiae

Visualisering och analys av mRNA-molekyler användning av fluorescens<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering i<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

The Fluorescence in situ Hybridization (FISH) method allows one to detect nucleic acids in the native cellular environment. Here we provide a protocol for ...

Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis

Snabb och effektiv Zebrafish Genotyping Använda PCR med hög upplösning Smält Analysis

Zebrafish is a powerful vertebrate model system for studying development, modeling disease, and performing drug screening. Recently a variety of genetic ...

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analysis of Autophagy in Penicillium chrysogenum by Using Starvation Pads in Combination With Fluorescence Microscopy

Analys av Autophagy i<em&gt; Penicillium chrysogenum</em&gt; Med hjälp Svält Pads i kombination med fluorescensmikroskopi

The study of cellular quality control systems has emerged as a highly dynamic and relevant field of contemporary research. It has become clear that cells ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Öppen källkod Single-partikelanalys för Super högupplösande mikroskopering med VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Laboratory Protocol for Genetic Gut Content Analyses of Aquatic Macroinvertebrates Using Group-specific rDNA Primers

Laboratoriet protokoll för genetiska Gut innehåll analyser av vattenlevande Macroinvertebrates använda gruppspecifika rDNA grundfärger

Analyzing food webs is essential for a better understanding of ecosystems. For example, food web interactions can undergo severe changes caused by the ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

LDL-kolesterol upptag Assay använder levande Cell Imaging analys med Cell hälsoövervakning

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...